Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

마우스에서 호중구의 이동 및 침투 감지

Published: February 6, 2020 doi: 10.3791/60543
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, 2State Key Laboratory of Biocontrol, Department of Biochemistry, School of Life Sciences, Sun Yat-Sen (Zhongshan) University
* These authors contributed equally

Summary

여기에서, 우리는 생체외 및 시험관내 둘 다 호중구 이동 및 침투를 평가하는 3개의 방법을 제시합니다. 이 방법은 호중구 이동을 표적으로 하는 유망한 치료법을 발견하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Abstract

호중구는 선천적인 면역 계통의 중요한 일원이고 병원체 및 병리학적인 선동적인 반응에 대하여 호스트 방어에 있는 중추적인 역할을 합니다. 호중구는 사이토 카인과 케모카인의 지도를 통해 염증 부위에 모집 될 수 있습니다. 호중구의 압도적 인 침투는 류마티스 관절염 (RA)과 같은 무차별 조직 손상으로 이어질 수 있습니다. 후막 삼출액으로부터 분리된 호중구는 정의된 화학유고력제, N-포밀-메트-레-페(fMLP), 트랜스웰 또는 지그몬드 챔버 어세에서 시험관내 반응한다. 공기 파우치 실험은 생체 내에서 리포폴리사카라이드(LPS)를 향하여 호중구의 화학요법을 평가하는데 사용될 수 있다. 상기 보조제 유도 관절염(AA) 마우스 모델은 RA 연구에서 자주 사용되며, 항-골수페록시다아제(MPO) 또는 항호중구 엘라스타제(NE) 항체를 이용한 관절 절편의 면역조직화학적 염색은 잘 확립된 측정 방법이다. 호중구 침투. 이 방법은 호중구 이동을 표적으로 하는 유망한 치료를 발견하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Introduction

호중구는 가장 풍부한 백혈구이며 인간 에서 전체 백혈구 인구의 50-70 %를차지합니다 1. 호중구는 급성 염증 중 주요 응답자 중 하나입니다. 호중구는 조직 상주세포에의해 방출된 사이토카인 및 케모카인의 지도를 통해 염증 부위에 모집될 수 있다2,3,4,이는 호중구 및 혈관 내피 세포의 표면에 세포 부착 분자 사이의 상호작용에 의해 매개되는5. 호중구는 반응성 산소 종(ROS) 및 기타 조직 손상분자3,6의방출을 통해 조직을 손상시키는 강력한 능력으로 인해 병원성 염증 반응에 대한 역할을 하는 근본적인 방어및 역할을 한다.

이전 연구는 마우스 또는 인간에게서 몇몇 호중구 격리 프로토콜을 기술했습니다. Oh et al. 인간호중구를 전혈로부터 분리시키는 밀도 구배 분리 방법을 7. 그러나, 마우스 혈액에서 충분한 호중구의 분리는 작은 혈액 양 때문에 어렵습니다. 대안적으로, 많은 수의 순수하고 생존 가능한 마우스 호중구는 마우스 복막 유체로부터 유도될 수 있으며, 이들 정제된 호중구는 호중구 침투, 이동, 화학택시, 산화 파열, 사이토카인 및 호중구 외세포(NET)생산8을포함하는 세포 기능의 여러 측면을 검사하기 위해 생체내 생체내 기능을 검사하는데 사용될 수 있다. Transwell공고9 또는 지그몬드 챔버 어세10,11은 시험관내에서 호중구 이동을 평가하는데 사용될 수 있다. 공기 파우치 모델은 생체 내 호중구의 이동 및 침투를 평가하는 데 사용됩니다. 피하 공기 파우치 모델은 염증 세포의 이동을 연구하는 편리한 생체 내 동물 모델이다.

전통적으로 호중구는 급성 염증 단계에서 병원균 제거제로 간주되었습니다. 그러나, 최근 사실 인정은 호중구가 전문화한 기능의 중요한 다양성을 능력을 발휘하는 복잡한 세포이다는 것을 보여주었습니다. 호중구는 급성 손상 및 수리, 종양 발생, 자가 면역 반응 및 만성 염증 과 같은 많은 과정을 조절할 수있습니다 12,13. 호중구는 또한 적응성 면역 반응을 조절하고 B 세포 및 T 세포14,15를조절할 수 있다. 호중구의 실질적인 부족은 인간에서 사망 또는 중증 면역 결핍으로 이어지며 마우스에서 호중구 고갈은 사망으로 이어지며, 장기에서 호중구의 과도한 활성화 또는 모집은 류마티스 관절염(RA) 및전신 성 홍반성 루푸스(SLE)와 같은 여러 면역 질환을 유발한다. 호중구는 RA 환자의 활액에서 가장 풍부한 세포이다. 호중구는 연골 침식을 악화시키는 분해를 통해 과도한 양의 골수페록시다아제(MPO)와 호중구 엘라타아제(NE)를 생성합니다. MPO는 주로호중구(16)의과립에 발현되는 과산화효소이다. NE는 관절 연골파괴와 연관되어 17. MPO 및 NE는 RA 환자의 조직에서 호중구 이동 및 침윤의 상태를 평가하는데 사용될 수 있었다.

본 문서는 생체 내 및 시험관 내에서 유도된 정상 호중구의 이동뿐만 아니라 마우스 관절 특이적 염증 모델에서 병리학적 호중구의 침투를 평가하는 세 가지 통상적인 방법을 제공한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

모든 실험 절차는 중국 의학 동물 관리 및 사용 위원회의 베이징 대학에 의해 검토 되고 승인되었습니다.

참고: C57BL/6 마우스 (7-8 주 령)를 사용 하였다.

1. 호중구 격리

  1. 후막 삼출 세포의 취득
    1. ddH2O. 마우스 수에 따라 필요한 부피를 계산하여 신선한 10% 프로테오오스 펩톤 용액을 준비한다.
      참고: 용액의 mL(2N+1)을 미리 용해및 여과해야 하는 마우스 수를 N으로 설정합니다.
    2. 작업 공간에 70% 에탄올을 뿌린 다. 인슐린 인젝터를 사용하여 펩톤 용액 1 mL을 그리고 거품을 배출합니다.
    3. 마우스 당 1 mL의 펩톤 용액의 첫 번째 복강 내 주입을 수행합니다.
      1. 한 손으로 헤드 다운 위치에 마우스를 잡아. 알코올에 젖은 면봉으로 주사 지점을 소독하십시오.
        참고: 바람직한 주입 위치는 복부의 아래 쪽 또는 오른쪽 사분면의 측면 측면에 있습니다.
      2. 시약을 빠르게 주입하십시오. 인슐린 인젝터로 각 마우스의 복막 구멍에 1 mL을 주입하십시오.
        참고 : 바늘과 피부 사이의 각도는 장이나 다른 장기를 손상시키지 않도록 약 15-30 °여야합니다.
    4. 염증 반응이 하룻밤 사이에 발달하도록 허용하십시오. 12 시간 후, 제 1 주사와 동일한 방식으로 두 번째 주입을 수행한다.
    5. 두 번째 주입 후 3 시간, 완전히 2 L / 분의 속도로 가스 마취 챔버에서 5 %의 이소플루란으로 마우스를 마취.
      참고 : 마취의 충분한 깊이는 단일 호흡 단위로 챔버에서 마우스를 이동하기 전에 발가락을 꼬집어 보장한다. 발가락이 꼬일 때 다리가 움직이지 않아야합니다.
      참고 : 다음 모든 단계는 조직 배양 후드에서 처리되어야한다.
    6. 70% 에탄올로 마우스에 스프레이합니다. 멸균 플라스틱 패드에 마우스를 놓고 바늘로 팔다리를 고정합니다.
    7. 외과 도구의 멸균 세트를 사용하여 하복부 의 중간에 수평 절개 (~ 1cm)를 만듭니다. 집게로 위 복부의 피부를 들어 올리고 복부의 중간선을 따라 잘라 그대로 복막 벽을 노출.
    8. 30G x 1/2" 바늘로 복강에 멸균 RPMI-1640 완전 배지 5mL를 주입합니다. 바늘의 경정맥 가장자리가 위를 향하여 맥막 벽을 통해 바늘을 삽입하고 전체 볼륨을 주입합니다.
    9. 패드를 수평으로 5분간 흔들어 줍니다.
    10. 복부의 측면 공간에 23 G x 1 1/4 "바늘을 주입하십시오. 복부 액체 (~ 5 mL)를 추출하고 50 mL 원심 분리튜브에 수집합니다.
      참고: 호중구가 활성화된 경우 가능한 한 빨리 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
    11. 완전한 배지의 또 다른 5 mL을 주입하고 후막에서 나머지 세포를 제거하는 절차를 반복합니다. 50 mL 원심 분리튜브에 복막 액을 풀.
    12. 실온(RT)에서 10분 동안 400 x g에서 풀링된 복막 액을 원심분리합니다.
    13. 상급제는 버리십시오. RPMI-1640 완전한 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단합니다.
      참고 : 호중구 활성화를 피하기 위해 소용돌이를 피하십시오.
  2. 호중구의 격리
    1. 15 mL 원심 분리튜브에 갓 제조된 70.2% 밀도 그라데이션 배지(예를 들어, Percoll)의 4 mL를 추가합니다.
    2. 신중하게 15 mL 원심 분리튜브에서 날카로운 파이펫 팁튜브의 가장자리를 따라 천천히 70.2 % 밀도 그라데이션 매체에 갓 제조 된 54.8 % 밀도 그라데이션 매체의 4 mL을 오버레이.
      참고: 54.8% 밀도 그라데이션 매체와 70.2% 밀도 그라데이션 매체 사이의 인터페이스가 방해되지 않도록 주의하십시오.
    3. 1 mL 복막 셀 현탁액을 54.8% 밀도 그라데이션 배지 층 위에 조심스럽게 날카로운 파이펫팁(그림 1A)으로천천히 오버레이합니다.
      참고: 셀 서스펜션과 54.8% 밀도 그라데이션 배지 사이의 인터페이스를 방해하지 않도록 주의하십시오.
    4. 제동없이 22 °C에서 30 분 동안 1,500 x g의 원심 분리기.
    5. 새로운 튜브에 54.8% 밀도 그라데이션 배지 및 70.2% 밀도 그라데이션 배지층(도1B)의계면에서 호중구를 수집한다.
    6. 수집된 셀에 RPMI-1640 완전 배지 1mL를 추가하고 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 셀을 조심스럽게 재중단합니다. RT에서 10 분 동안 100 x g의 원심 분리기를 조심스럽게 제거하십시오.
    7. 세척 단계(1.2.6단계)를 한 번 반복합니다.
    8. 펠릿에 배양 배지 0.5 mL를 추가하고 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 세포를 다시 놓습니다. 자동 혈액학 분석기를 사용하여 세포를 계산하기 위해 50 μL aliquot를 가져 가라.

2. 호중구 이동 분석

  1. Transwell분석9 또는 지그몬드 챔버 분석에 의한 호중구 이동을 측정하기 앞서 설명한 바와 같이10,11.

3. 공기 파우치 분석

  1. 첫 번째 공기 분사
    1. 0일째에, 2 L/min의 속도로 가스 마취 실에서 5% 이소플루란으로 마우스를 완전히 마취시키고, 0.5 L/min의 속도로 2% 이소플루란을 가진 단일 호흡 유닛에서 각 마우스의 마취를 유지합니다.
      참고 : 마취의 충분한 깊이는 단일 호흡 단위로 챔버에서 마우스를 이동하기 전에 발가락을 꼬집어 보장한다. 발가락이 꼬일 때 다리가 움직이지 않아야합니다.
    2. 5mL 주사기에 부착된 0.22 μm 필터를 사용하여 3mL의 멸균 된 공기를 얻습니다.
    3. 핀셋으로 마취 된 마우스의 뒷면 피부를 들어 올리고 26G x 3/8 "바늘을 사용하여 멸균 된 공기 3 mL를 피하 주입하십시오.
    4. 처리 후, 호흡 부에서 마우스를 제거하십시오. 마우스가 움직이기 시작할 때까지 생쥐가 살아 있는지 모니터링합니다.
  2. 두 번째 공기 분사
    1. 3일째에는 섹션 3.1에 설명된 대로 공기 파우치를 유지하기 위해 이전에 확립된 에어 포켓에 3mL의 멸균 된 공기를 추가로 주입하십시오.
  3. 치료
    1. 희생 하기 전에 6 시간 6 일에 공기 파우치에 다른 치료를 주입 합니다. 1 mL의 인산염 완충식염수(PBS)를 음성 대조군으로 주입합니다. 국부적인 염증을 유발하는 양성 대조군으로 1 μg/mL LPS 1 mL을 주입합니다.
    2. 2 L/min의 속도로 가스 마취 챔버에서 3 분 동안 5 %의 이소플루란으로 마우스를 완전히 마취하고, 0.5 L / min의 속도로 2 %의 이소플루란으로 단일 호흡 장치에서 각 마우스의 마취를 유지합니다.
      참고 : 마취의 충분한 깊이는 단일 호흡 단위로 챔버에서 마우스를 이동하기 전에 발가락을 꼬집어 보장한다. 발가락이 꼬일 때 다리가 움직이지 않아야합니다.
    3. 각 공기 파우치에 대해 공기 파우치를 1 mL의 세척 버퍼로 씻고 15 mL 원심 분리튜브에서 염증성 삼출액을 수집하십시오. 공기 파우치를 세척 완충액 2x로 세척하고 동일한 원심분리기 튜브에서 염증성 삼출액을 수집합니다.
    4. RT에서 10 분 동안 100 x g의 원심 분리기를 폐기하고 1 mL의 세척 버퍼에서 세포를 다시 일시 중단하십시오. 자동 혈액학 분석기를 사용하여 호중구 비율을 정량화하기 위해 세포를 계산합니다.
      참고: 그림 2의대표 결과를 참조하십시오.

4. 보조 유도 관절염의 유도 (AA) 마우스 모델

  1. 적어도 5 s를 소용돌이시켜 완전한 Freund의 보조제 (CFA)를 일시 중단한 다음 100 μL의 현탁액을 인슐린 인젝터에 그립니다.
    참고: 멸균을 보장하기 위해 실험에서 완전히 새로운 CFA를 사용하는 것이 좋습니다.
  2. 단계 3.1.1에 기재된 바와 같이 마우스를 마취한다.
  3. 선택한 발을 표시하고 발목 관절 공간에 CFA 20 μL을 주입합니다. 20 μL의 현탁액을 선택한 발에 4 개의 골반에 주입하십시오 (총 80 μL).
  4. 호흡 유닛에서 마우스를 제거하고 처리된 마우스를 새로운 챔버에 넣습니다. 마우스가 움직일 수 있는 능력을 되찾을 때까지 호흡하고 있는지 모니터링합니다.
  5. 3일마다 포켓 두께 게이지를 사용하여 발목 관절 직경을 측정하여 관절 직경을 평가한다(도3A).
  6. 매 3 일, 관절염 점수 기준에 의해 관절염 심각도평가(그림 3C):0, 정상, 홍반 및 붓기의 증거; 1, 가장 가벼운 관절염, 홍반 및 경미한 붓기는 타르살 또는 발목 관절에 국한; 2, 적당한 관절염, 홍반 및 경미한 붓기는 발목에서 타르살까지 연장됩니다. 3, 심한 관절염, 홍반 및 중족골 관절에 발목에서 연장 적당 한 붓기; 4, 가장 심한 관절염, 홍반 및 심한 붓기는 발목, 발 및 숫자, 또는 사지의 ankylosis를 포함합니다.

5. 관절 절의 면역 성 화학 적 염색

  1. 조인트 절연
    1. 이소플루란으로 마취 후 자궁 경부 탈구를 사용하여 섹션 4에서 마우스를 희생하십시오. 70% 에탄올로 마우스에 스프레이합니다.
    2. 핀셋과 가위로 뒷다리에서 피부와 근육의 일부를 제거합니다. 70% 에탄올로 관절에 스프레이하고 종이 타월을 사용하여 근육의 나머지 부분을 제거합니다.
    3. RT에서 2 일 동안 발목 관절을 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오.
    4. 파라핀에 조직을 포함하고 4-μm 두께의 조직 절편을 준비합니다.
      1. 액체 파라핀의 특정 부피와 표시된 곰팡이에 조직을 배치합니다. 잠시 식히세요.
      2. 두께를 4 μm로 설정하고 마이크로토메에서 슬라이스를 자른다. 43 °C 수조에 부동 섹션.
      3. 슬라이드에 섹션을 장착하고 2 시간 동안 70 °C에서 오븐에 슬라이드를 넣어. 나중에 사용할 수 위해 -20 °C에서 슬라이드를 보존하십시오.
  2. 사프라닌 O와 조인트 섹션의 빠른 녹색 염색
    참고: RT에서는 다음과 같은 염색 단계가 수행됩니다.
    1. 5.1.4.3단계에서 슬라이드를 랙에 놓고 RT에서 재수화하기 위해 다음 세척을 수행합니다: 5분(3x), 2분 동안 100% 에탄올(2x), 2분 동안 95% 에탄올,70% 에탄올을 2분 간, 15분 동안 3회 에탄올을 3분 동안 세척합니다.
    2. 0.1% 빠른 녹색 용액에 5 분 동안 얼룩을 1 % 아세트산으로 10 초.
    3. 0.1% 사프란O 염색용액을 20분 동안 적신후 2분 간 95% 에탄올(2x), 2분(2배), 자일렌 2분(2x)에 95% 에탄올을 담그세요.
    4. 조직 단면도를 설치하고 현미경의 밑에 조직을 관찰하십시오.
      참고: 그림 4A의대표 이미지 참조
  3. 호중구를 시각화하는 면역 성 화학 염색
    1. 78 °C에서 2 시간 동안 파라핀 섹션을 굽습니다. 슬라이드를 랙에 놓고 RT에서 수분을 보충하기 위해 다음 세정을 수행합니다: 15분(2배), 5분 동안 100% 에탄올, 5분 동안 95% 에탄올, 5분 동안 80% 에탄올, H2O3분, PBS3분.
      참고: 이 단계에서는 슬라이드가 건조되지 않도록 하십시오.
    2. 조직을 덮기 위해 투과 완충액 한 방울을 추가하십시오. 37°C에서 습도 제어 트레이에 섹션을 배양합니다.
    3. PBS에서 3분(3회) 동안 슬라이드를 헹구십시오. 조직을 직접 헹위지 마십시오.
    4. 압력 보일러를 사용하여 열 유도 항원 에피토프 검색을 수행합니다.
      1. 선반에 슬라이드를 정렬합니다. 검색 버퍼로 채워진 압력 보일러에 슬라이드를 담그십시오.
      2. 전자 레인지에 압력 보일러를 놓습니다. 전자 레인지를 600W로 설정하고 슬라이드를 10 분 동안 가열합니다.
      3. 끓인 후 보일러에 슬라이드를 넣고 90°C로 식힙니다. 슬라이드를 꺼내 3 분 (3x)동안 PBS에서 헹구십시오.
    5. 15분 동안 RT에서 갓 제조된 3% H2O2에서 내인성 과산화 활성을 담금질하여 3분(3x)에 PBS에서 린스 슬라이드를 헹구는다.
    6. 소수성 펜으로 샘플 주위에 큰 원을 윤곽을 그리며 샘플을 건드리지 마십시오. 3% 소 혈청 알부민(BSA)을 37°C에서 습도 조절 챔버에서 60분 동안 차단합니다.
    7. 차단 솔루션을 제거합니다. 각 섹션에 PBS 희석 1차 항체 50 μL을 빠르게 추가합니다. 이어서, 슬라이드를 밤새 4°C에서 습도 제어 트레이에 배양한다.
      참고: 다른 희석 비율은 다른 항체에 사용됩니다(MPO의 경우 1:25, NE의 경우 1:20).
    8. 둘째 날에는 트레이를 꺼내 서서 30 분 동안 RT에 두십시오. 그런 다음 슬라이드를 PBS에서 3분(3x)으로 헹구십시오.
    9. 50 μL의 PBS 희석 이차 항체를 조직에 추가합니다.
      참고: MPO의 경우 1:1,000, NE의 경우 1:1,500의 다른 희석 비율이 적용되었습니다.
    10. 37°C에서 30분 동안 습도 조절 트레이에 슬라이드를 인큐베이팅합니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS에서 3분(3x)으로 헹구십시오.
    11. 희석 된 3,3'-다미노 벤지딘 (DAB) 용액으로 5 분 동안 개발하십시오. 슬라이드를 증류수로 헹구십시오.
    12. 헤마톡실린의 슬라이드를 10초 동안 카운터스테인하여 5분 동안 수돗물로 헹구십시오.
    13. 산성 알코올 초고속 분화 용액으로 3 초고음 분화 용액으로 헹급하십시오. 그런 다음 수돗물로 10 분 동안 헹구어 보루하십시오.
    14. RT에서 슬라이드를 5분 동안 80% 에탄올, 5분 동안 95% 에탄올, 5분 동안 100% 에탄올, 15분(2배)의 자일렌에 담그세요. 마운팅 솔루션으로 커버슬립을 고정합니다. 현미경으로 조직을 관찰하십시오.
      참고: 그림 4B의대표 이미지 참조.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

후막 삼출 세포는 마우스의 세척액으로부터 수집하였다. 세포는 RPMI-1640 완전한 배지의 1 mL에서 재중단되었고, 2단계(54.8%/70.2%)에 층상하였다. 불연속 밀도 구배(도1A)및 30분 동안 1,500 x g에서 원심분리(≥95%, ~1 x 107 호중구/마우스)를 하부 계면으로부터 회수하였다(도1B).

공기 파우치 실험은 생체 내에서 LPS에 의해 자극된 호중구 모집을 조사하기 위해 수행하였다(도2A). 공기 파우치 압출액내의 백혈구 서브세트를 측정하였다(도2B).

RA에서의 호중구 이동은 CFA-유도 관절염 뮤린 모델을 통해 평가되었다. 대조군과 비교하여, AA 그룹은 발에 상당한 부종을 보였다. AA 군에서는 발목 관절 직경이증가하고(그림 3B)관절염 점수가 일관되게 상승하였다(그림3D).

연골 손상은 RA의 대표적인 증후군으로, AA 마우스에서 연골 손상을 평가하기 위해 A-빠른 녹색 연골 염색을 수행하였습니다. 도4A에도시된 바와 같이, CFA 도전은 다량의 백혈구 침윤, 유의한 연골 침식 및 활액 증식을 유도했다. MPO 및 NE 발현 수준은 호중구 침투의 대표적인 마커이다. 면역히스토화학적 분석실험은 관절에서 호중구 침투를 관찰하기 위해 수행되었다. MPO 및 NE 발현은 관절 부에서 현저하게 상승하였다(도4B).

Figure 1
그림 1: 호중구 격리. (A)RPMI-1640 완전 배지의 1 mL에서 재중단된 복막 삼출세포를 2단계(54.8%/70.2%)에 계층화시켰다. 불연속 밀도 그라데이션. (B)30 분 동안 1,500 x g에서 원심 분리 후, 호중구 (≥95 %, ~ ~ 1 x 107 호중구 / 마우스)를 하부 계면으로부터 회수하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 공기 파우치 분석법의 대표적인 결과. (A)공기 파우치 분석법의 일러스트. (B)공기 파우치 분석에서 백혈구 서브세트 침투의 대표적인 결과. PBS: 제어; LPS: 1 μg/mL LPS. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다.

Figure 3
도 3: 보조제 유도 관절염(AA) 마우스 모델의 대표적인 결과. (A)포켓 두께 게이지를 사용하여 발목 관절 직경을 측정하였다. (B)관절 부종은 발목 관절 직경(n=7)에 기초하여 평가되었다. (C)각 관절염 점수의 사진. (D)관절염의 중증도는 0-4점(n=7)의 척도로 등급화되었다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다.

Figure 4
도 4: 대조군 및 AA 마우스로부터관절절의 사프라닌 O-고속 녹색 연골 염색 및 면역운동화학분석의 대표적인 결과. (A)관절의 사프라닌 O-빠른 녹색 연골 염색의 대표적인 결과. (B)발목 관절에서 MPO 및 NE의 발현 수준에 대한 대표적인 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

말초 혈액7,골수 및 조직18에서 고도로 정제 된 호중구의 상세한 프로토콜은 오랫동안 사용할 수 있었습니다. 여기에서 우리는 성숙한 호중구가 추가 항염증제 및 항산화 방지 연구를 위해 불활성화남아 있는 복막 액체19에서 호중구를 분리하는 방법을 채택합니다.

우리는 공기 파우치 실험을 사용하여 생체 내에서 호중구의 LPS 유도 침윤을 탐구했습니다. 이 방법은 생체 내에서 일반적인 염증 환경에서 세포 침투를 직접 측정하는 잠재적인 방법으로 제안되었다.

공기 파우치 분석은 장기 비특이적 방식으로 호중구의 기능을 입증하고 백혈구 모집 캐스케이드의 여러 단계를 제거한다는 점은 주목할 만합니다. 특정 장기에 호중구 모집은 상이한 장기 특성, 접착 분자 및 케모카인에 의존할 수 있기 때문에, 장기 특이적 조건에서 호중구 기능 상태를 탐구하는 것은 호중구가 특정 질병에서 잠재적으로 재생하는 역할을 연구하는 데 매우 중요하다3. 호중구 침투를 조사하기 위해 엔드포인트 모델이 필요하다고 제안되었습니다. 따라서, AA 모델에서 마우스의 관절 절편에서 면역성 화학적 염색을 수행하면 관절 공간에서 호중구에 대한 통찰력있는 관점을 제공할 수 있다. 우리의 데이터에 따르면, 호중구의 광대 한 숫자는 관절 조직으로 모집하고 RA를 치료하는 호중구의 침투를 중단에 대한 추가 연구를위한 기본 증거로 봉사한다. 또한, 포괄적인 아세, 예를 들어, 사프라닌 O-빠른 녹색 염색은, 추가 연구를 위한 질병 모델을 평가하기 위해 요구된다.

호중구는 염증 세포에 침투하는 주요 하위 집합이며 침입 병원체 또는 조직 손상에 대한 첫 번째 방어선으로서작동20,21. 호중구가 많은 수의 조직에 침투하면 높은 수준의 사이토 카인과 NET가 분비되어 조직의 보호 메커니즘을 압도하고 조직 손상을 초래할 수 있습니다. 조직 손상은 호중구 침투를 더욱 자극하여악순환(22)을형성한다. 림프성 장기에서 활성화된 세포를 포획하여 세포 이동을 방해하는 것은 중요한 치료 접근법으로 제안되어 왔으며 다양한 부작용을 가진 임상 시험에서 적용되고있다 23. 호중구 이동 및 염증 활성을 동시에 조절하는 새로운 치료법을 발견하는 것은 향후 염증성 질환 치료에 유망한 전략입니다. 더욱이, 운동성 조절제가 결합되는 경우, 호중구 매개 약물전달(24)은 약물 특이성을 증가시켜 부작용을 감소시킬 수 있다.

그러나, 전술한 전술의 적용을 확대하기 위해 추가의 변형이 결합될 수 있다. 예를 들어, AA 마우스 모델에서, 관절에 염증 세포의 침투의 전반적인 인상을 얻기 위해, 연구원은 상주 백혈구 인구를 해제하고 다음 카운트 흐름 세포측정을 적용하기 위해 관절을 효소 소화하는 것이 좋습니다 인구.

본 명세서의 프로토콜은 호중구 이동 및 침투를 평가하는 3가지 방법을 포함한다. 이 프로토콜의 적용은 호중구를 관련시키는 RA 및 그밖 선동적인 질병을 위한 잠재적인 처리를 발견하기 위해 유용합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81430099 및 31500704), 국제 협력 및 교환 프로젝트 (교부수 번호 2014DFA32950), 그리고 중국 의학 대학의 연구 프로그램에 의해 지원되었다 ( 부여 번호 BUCM-2019-JCRC006 및 2019-JYB-TD013).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Fast Green Solution Solarbio 8348b Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.1% Safranin O Staining Solution Solarbio 8348a Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 Sigma 324506 Sterile
100% Ethanol Beijing Chemical Works
100% Methanol Beijing Chemical Works
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube Falcon 14-959-53A
23 G x 1 1/4" Needle BD 305120
26 G x 3/8" Needle BD 305110
3% bovine serum albumin (BSA) Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS
3% H2O2 Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol
3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit ZSGB-BIO ZLI-9018
30 G x 1/2" Needle BD 305106
30% H2O2 Beijing Chemical Works
5 mL Syringe BD Z683574
50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube Falcon 14-432-22
50% Ethanol Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O
54.8% Percoll Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still
70% Ethanol Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
70.2% Percoll Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still
80% Ethanol Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O
95% Ethanol Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O
Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution Beyotime C0165S
ANTIBODIES
Anti-Myeloperoxidase Antibody Abcam ab208670
Anti-Neutrophil Elastase Antibody Abcam ab21595
Automatic Hematology Analyzer Sysmex XS-800i
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 0332-100G
Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml sigma 1002036152
Cover Slip CITOGLAS 10212432C
Dial Thickness Gauge Mitutoyo 7301
Eppendorf Microtubes, 1.5 mL Sigma Z606340
Foetal Bovine Serum (FBS) Premium PAN P30-1302
Gas Anesthesia System ZS Dichuang ZS-MV-IV
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) PPLYGEN C1309 This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Hematoxylin Staining Solution ZSGB-BIO ZLI-9609
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L3012
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit Solarbio G1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma 47729
Penicillin Streptomycin Solution, 100× Invitrogen 1514022
Percoll GE Healthcare 10245207 Density gradient medium
Permeabilization Buffer Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100
Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved
Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
POWDER
Proteose Peptone Oxoid 1865317
Retrieval Buffer Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0
Retrieval Buffer A Stock for IHC Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O
Retrieval Buffer B Stock for IHC Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758
RPMI-1640 Complete Medium RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL BD 328421
Slide CITOGLAS 10127105P-G
SOLUTION
Stock Isotonic Percoll (SIP) Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min
Wash Buffer in Air Pouch Assay Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS
Xylene Beijing Chemical Works

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
  2. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
  3. Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
  4. Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
  5. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
  6. Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
  7. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
  8. Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
  9. Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
  10. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
  11. Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
  12. Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
  14. Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
  15. Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
  16. Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
  17. Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
  18. Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
  19. Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
  20. Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
  21. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  22. Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
  23. Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
  24. Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).

Tags

생물학 문제 156 호중구 이주 관절염 면역 운동 화학 공기 펀치 화학 요법
마우스에서 호중구의 이동 및 침투 감지
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, Q., Yuan, K., Li, X., Jiang, H., … More

Lu, Q., Yuan, K., Li, X., Jiang, H., Huo, G., Jia, W., Huang, G., Xu, A. Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60543, doi:10.3791/60543 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter