Summary
这里介绍的是明胶甲酰胺的3D生物打印方法。
Abstract
明胶甲酰胺（GelMA）已成为生物印刷领域流行的生物材料。这种材料的衍生物是明胶，它是从哺乳动物胶原蛋白水解。因此，基质金属蛋白酶（MMP）的精氨酸-甘氨酸-阿斯巴酸（RGD）序列和目标图案留在分子链上，有助于实现细胞附着和降解。此外，GelMA 的地层特性是通用的。甲酰胺组允许材料在光射光下在光开射器的存在下迅速交联。因此，建立合适的方法，用这种有前途的材料合成三维（3D）结构是十分有意义的。然而，其低粘度限制了GelMA的可打印性。这里介绍了对GelMA水凝胶进行3D生物打印的方法，即制造凝胶微球、凝胶纤维、GelMA复杂结构和基于GelMA的微流体芯片。讨论了材料的结构和生物相容性以及印刷方法。据信，该协议可作为以前应用的生物材料和GelMA之间的桥梁，并有助于建立基于GelMA的生物医学应用3D架构。
Introduction
水凝胶被认为是生物制造领域1、2、3、4的合适材料。其中，明胶甲酰胺（GelMA）已成为用途最广的生物材料之一，最初由范登布尔克等人于2000年提出。GelMA由明胶与冰毒氢化物（MA）的直接反应合成。明胶由哺乳动物胶原蛋白水解，由基质金属蛋白酶（MMP）的目标图案组成。因此，GelMA建立的体外三维（3D）组织模型可以理想地模拟细胞与体内细胞外基质（ECM）之间的相互作用。此外，精氨酸-甘氨酸-阿斯巴酸（RGD）序列，在一些其他水凝胶（如藻酸盐）中不存在，留在GelMA的分子链上。这使得它有可能实现在水凝胶网络6内封装的细胞的附着。此外，GelMA的形成能力是有希望的。GelMA分子链上的甲酰胺组在轻度反应条件下与光射器发生反应，在暴露于光照射时形成共价键。因此，打印结构可以快速交联，以简单的方式保持设计的形状。
基于这些特性，一系列领域利用GelMA进行各种应用，如组织工程、基础细胞学分析、药物筛选和生物传感。因此，各种制造策略也已显示7，8，9，10，11，12，13，14。然而，基于GelMA进行3D生物打印仍然具有挑战性，这是由于其基本特性。GelMA 是一种温度敏感材料。在印刷过程中，必须严格控制印刷环境的温度，以保持生物墨水的物理状态。此外，GelMA的粘度一般低于其他常见的水凝胶（即藻酸盐、甲酸、透明质酸等）。然而，在用这种材料建造3D架构时，还面临着其他障碍。
本文总结了我们实验室提出的GelMA3D生物打印的几种方法，并描述了印刷样品（即凝胶微球、GelMA纤维、GelMA复杂结构和基于GelMA的微流体芯片的合成）。每种方法都有专门的功能，可以在不同情况下采用，有不同的要求。GelMA 微球由电辅助模块生成，形成额外的外部电力以缩小液滴大小。就GelMA纤维而言，它们由同轴生物印刷喷嘴挤出，借助粘性藻酸钠。此外，通过数字光处理 （DLP） 生物打印机实现复杂 3D 结构的建立。最后，提出了两次交联策略，将凝胶水凝胶与传统微流体芯片相结合，构建基于GelMA的微流体芯片。据认为，该协议是我们实验室使用的GelMA生物打印策略的重要总结，并可能激励相关领域的其他研究人员。
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Protocol
1. 细胞培养
- 制备Dulbeco的改性鹰培养基（DMEM），辅以10%胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素，用于培养人类乳腺癌细胞（MDA-MB-231）线和人类脐带静脉内皮细胞（HUVEC）线。
- 用L-谷氨酰胺（DMEM/F-12）制备DMEM，辅以10%FBS和1%青霉素/链霉素，用于培养骨髓间质干细胞（BMSC）线。
- 将培养环境设置为 37°C 和 5% CO2。培养MDA-MB-231、HUVEC和BMSC，当达到90%汇合时，以1：2的比例通过细胞。
2. 凝胶微球的制造
- 在熔融沉积建模 （FDM） 打印机上使用聚乳酸 （PLA） 打印图 1A。在夹具中放置两个金属环电极。
- 将两个金属环电极分别与接地极和正极连接。将金属板与环形电极下方的高压连接，并将装有硅油的培养皿作为滴接收器放在金属板上。
- 在Dulbeco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中溶解冻干GelMA（5%w/v）和苯基锂-2，4，6-三甲基苯甲酸酯（LAP，0.5%w/v），作为生物油墨（10 mL）。通过 0.22 μm 过滤器过滤生物墨水，使其不育，并在 37°C 水浴中加热 15 分钟。
- 在37°C下分离3mL为0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液的MDA-MB-231细胞。在100 x g的15 mL离心管中的离心细胞5分钟，以获得细胞颗粒。
- 拆下上清液。通过缓慢移液将细胞颗粒与1 mL制备的生物墨水混合，以防止产生气泡。
- 将 1 mL 的生物墨水 （MDA-MB-231） 放入 3 mL 无菌注射器中。用压缩空气（±0.5 kPa）为生物墨水进料。将注射器放在夹具上。
注：打印环境应严格控制在30°C和湿度50% 的温度下。 - 打开高压电源，并将电压设置为 0⁄4 kV。同时，打开 405 nm 波长光，将 GelMA 液滴交错在 5 mL 的硅油中。
- 倒掉培养皿，将大部分硅油倒入。使用勺子将剩下的硅油和GelMA微球转移到15 mL离心管中。
- 加入 5 mL 的 DPBS 并均匀摇动混合物。将管在 100 x g下离心 5 分钟，并去除上清液。
- 重复步骤 2.9 3x。
- 用勺子拿出GelMA微球，在37°C和5%CO2的培养皿中，在DMEM中培养3天。
- 丢弃介质，用 DPBS 清洗微球。在室温 （RT） 下，用 2 mL 的 4% 甲醛 （PFA） 固定 30 分钟。
- 丢弃 PFA，用 DPBS 清洗微球。在 RT 使用 2 mL 0.5% 非离子表面活性剂（即 Triton X-100）进行 5 分钟的渗透。
- 丢弃非离子表面活性剂，用DPBS清洗微球。在RT的黑暗中用2mL的四甲基二甲胺（TRITC）噬菌体染色30分钟。
- 丢弃 TRITC，用 DPBS 清洗微球。在RT的黑暗中用2mL染色，2mL为4*，6-二酰胺-2-苯林多尔（DAPI）。
- 丢弃 DAPI，用 DPBS 清洗微球。使用共聚焦荧光显微镜捕捉形态。
3. 凝胶纤维的制造
- 准备同轴喷嘴，如图2A所示。用焊接固定内部喷嘴（25 G，OD = 510 μm，ID = 250 μm）和外部喷嘴（18 G，OD = 1200 μm，ID = 900 μm）。将玻璃管（长度 = 50 mm，内径 = 1.2 mm）连接到同轴喷嘴的末端。
- 在紫外线 （UV） 光下灭菌的灭菌钠藻酸钠（Na-Alg）粉末在去离子水中消毒30分钟，在2%（w/v）下。
- 按照步骤 2.3 准备无菌生物墨水溶液。在 37°C 水浴中加热 GelMA 生物墨水和 Na-Alg 溶液 15 分钟。
- 在37°C下分离3mL为0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液的BMCS细胞。在100 x g的15 mL离心管中的离心细胞5分钟，以获得细胞颗粒。
- 拆下上清液。通过缓慢移液将细胞颗粒与2 mL制备的GelMA生物墨水混合，以防止气泡产生。
- 将 2 mL 的生物墨水 （BMSc） 放入 10 mL 注射器中。将 2 mL 的 Na-Alg 溶液放入另一个注射器 （10 mL）。分别用两个注射器泵喂它们（此处为50μm/min的生物墨水和350μm/分钟的Na-Alg溶液）。
注：打印环境应严格控制在30°C和湿度50% 的温度下。 - 打开 405 nm 波长光，照射透明管，将 GelMA 纤维交错。使用带有 DPBS 的培养皿接收纤维。
- 用DPBS的勺子拿出GelMA纤维，在37°C和5%CO2中制备DMEM/F-123天。
- 按照步骤 2.12_2.16 准备 GelMA 纤维，以便使用共聚焦荧光显微镜进行形态观察。
4. 复杂3D凝胶结构的制造
注：图3A显示了复杂3DGelMA结构的制造草图。
- 用 75% 的酒精擦拭 DLP 生物打印机 （图 3E），并将其暴露在紫外线照射下 30 分钟，使其不育。
- 在 DPBS 中溶解冷冻干燥的 GelMA（10% w/v）和 LAP（0.5% w/v）。将洋红色食用色素加入溶液（3%v/v），以提高印刷精度。
- 通过 0.22 μm 过滤器过滤溶液，使其不育，并在 37°C 水浴中加热 15 分钟。
- 使用计算机辅助设计 （CAD） 软件构建 3D 模型。将模型文档导入应用的 DLP 生物打印机的上部软件 （EFL）。
- 在 DLP 生物印刷机的槽中加入 10 mL 的制备生物墨水。
- 将上部软件中的打印参数设置如下：光强 = 12 mW/cm2，辐照持续时间 = 30 s，切片高度 = 100 μm。开始打印。
- 从生物打印机上取下印刷结构，并将其浸入培养皿中。
- 在37°C下分离3 mL为0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液的MDA-MB-231s细胞。在15 mL管中，在100 x g下离心细胞5分钟，以获得细胞颗粒。
- 去除上清液，将细胞颗粒与 2 mL 的 DMEM 混合。
- 在印刷结构上添加100 μL的细胞悬浮液。在制备的DMEM中，在37°C和5%CO2下培养它们3天。
- 按照步骤 2.12_2.16 准备复杂的 3D 结构，以便使用共聚焦荧光显微镜进行形态观察。
5. 基于凝胶Ma的微流体芯片的制造
注：图4A显示了基于GelMA的微流体芯片的制造草图。
- 在 DPBS 中溶解冷冻干燥的 GelMA 10%（w/v）和 LAP（0.5% w/v）。通过 0.22 μm 过滤器过滤 GelMA 溶液，以进行无菌。
- 在紫外线下对明胶粉末进行30分钟的消毒，并将其添加到步骤 5.1 中制备的 GelMA-LAP 溶液中，最终浓度为明胶浓度为 5%（w/v）。在 37°C 水浴中加热混合物 15 分钟。
- 使用 CAD 软件设计一组模具 （图 4B，C），并在 DLP 打印机上用光聚合物树脂制造它们。
- 用准备好的生物墨水充分填充模具。
- 将模具放入 4°C 冰箱中，将明胶交联 30 分钟。
- 用刀片将部分（物理）交联水凝胶片从模具中取出模具和脱模。
- 结合两个脱毛水凝胶片，并通过在 405 nm 辐照 1 分钟，将其与 GelMA 的帮助下粘结。
- 在37°C下分离3mL 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液的HUVECs细胞3分钟。在15 mL离心管中的离心细胞，以获得100 x g的细胞颗粒5分钟。
- 去除上清液，将细胞颗粒与 2 mL 的 DMEM 混合。
- 用喷嘴和注射器注射细胞悬浮液，充分填充微通道。
- 在接下来的 3 小时内，每隔 15 分钟翻转一次芯片，以实现均匀和完整的细胞播种。在制备的DMEM中，在37°C和5%CO2下，在培养培养培养培养培养培养培养培养的薯片3天。
- 按照步骤 2.12_2.16 准备微流体芯片，以便使用共聚焦荧光显微镜进行形态观察。
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Representative Results
在制造GelMA微球过程中，凝胶电滴被外部电场力分离。当液滴落入接收硅油时，它们保持标准球形形状，没有尾巴。这是因为GelMA液滴处于水相，而硅油处于油相。两个阶段之间形成的表面张力导致GelMA液滴保持标准球形形状。就电池载载的微球而言，细胞在这个过程中经历了高压电场力。从染色MDA-MB-231的形态（图1B+E）中发现，封装的MDA-MB-231保持其扩散能力，验证了这种电辅助制造方法的生物相容性。
就GelMA纤维而言，GelMA和藻酸钠溶液分别流于同轴喷嘴的内部和外部喷嘴中。由于藻酸钠的粘度高于GelMA，GelMA在藻酸钠溶液中受到限制，并保持一个线形。光（405 nm 波长）的照射使内部GelMA成为交联，形成GelMA纤维（图2B）。此外，BMSC被封装在GelMA纤维中（图2C，D）。如图所示，封装的BMSC在制造过程后在GelMA水凝胶网络中保持了扩散能力（图2E）。
选择 DLP 生物打印机来制造具有更复杂的形状的 GelMA 结构。如图3B+D所示，"鼻子"、"耳朵"和"多室"的结构被建立。在交联GelMA结构的表面，种子HUVECs附着在GelMA材料上并扩散（图3F）。这表明，借助DLP生物打印机建立GelMA复杂3D结构，在组织工程领域的应用具有巨大潜力。
与传统的微流体芯片，基于材料没有生物降解特性16，17，18，20（即树脂，玻璃，聚二甲基硅氧烷[PDMS]和聚甲基丙烯酸甲酸酯[PMMA]），在这里使用两次交联策略制造基于GelMA的微流体芯片。生物墨水中的两个组件依次交联。不同微通道的芯片是按需设计不同模具而构建的（图4B，C）。此外，经验证，HUVECs在通道中播种并附着在通道壁上，形成宏观容器形状（图4D，E）。
图1：GelMA微球。（A） 凝胶微球的制造草图.（B） 凝胶微球的光学显微镜图像.（C） GelMA中MDA-MB-231的光学显微镜图像。（D） 封装的MDA-MB-231的F-actin和核心的2D视图。（E） 封装的MDA-MB-231的F-actin和核心的3D视图。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：凝胶纤维。（A） 凝胶纤维的制造草图.（B） 凝胶纤维的光学显微镜图像（用蓝色墨水）。（C） GelMA 纤维的共聚焦荧光显微镜图像（含绿色荧光颗粒）。（D） 凝胶光纤中 BMSC 的光学显微镜图像。（E） 封装的BMSC的F-actin和核心。请点击此处查看这个数字的较大版本。
图3：GelMA复杂3D结构。（A） 复杂 GelMA 3D 结构的制造草图.（B） 凝胶"鼻子"的光学显微镜图像。（C） 凝胶"耳"的光学显微镜图像。（D） GelMA"多室"的光学显微镜图像。（E） 应用的 DLP 生物打印机.（F） 种子MDA-MB-231的F-actin和核。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：基于GelMA的微流体芯片。（A） 基于GelMA的微流体芯片的制造草图.（B，C）基于GelMA的微流体芯片的光学显微镜图像。（D） 通道壁上种子 HUVEC 的光学显微镜图像。（E） 通道壁上种子 HUVECs 的 F-actin 和原子核。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本文介绍了几种制造GelMA 3D结构的策略，即凝胶微球、凝胶母纤维、凝胶MA复杂结构和基于GelMA的微流体芯片。GelMA具有广阔的生物相容性和形成能力，在生物制造领域有着广泛的应用。微球结构适用于受控药物释放、组织培养和注射到生物体中，以进行进一步治疗21、22、23、24、25。由于GelMA溶液的粘度低，其形成具有挑战性。因此，在制造GelMA微球时，选择了电流体动力学（EHD）原理来解决这个问题。施加的电压相对较低，微滴逐一产生。为了制造较小尺寸的微球，施加的电压可以增加，并且流体将处于另一种状态与泰勒锥26。
由于库仑爆炸现象，滴滴由于电密度过大而进一步分离，导致GelMA微球变小。此外，单组分GelMA纤维是借助同轴喷嘴和藻酸钠溶液制造的。这里应用了同轴喷嘴。如上所述，由于GelMA的低粘度，藻酸钠提供了抗性，有助于维持纤维的形状。水凝胶纤维结构适用于模仿体内的纤维状组织（即肌肉、血管等，27、28、29、30、31、32）。对于具有更复杂的部件的GelMA纤维，可进一步修改应用的生物打印喷嘴。例如，可以组装三层同轴喷嘴以生成多层 GelMA 纤维。
在建立复杂的GelMA3D结构时，发现DLP生物打印机突破了凝胶玛低粘度造成的打印障碍。在CAD软件的帮助下，盖尔玛3D结构按需制造。最后，演示了一种新的GelMA制造方法，即两次交联策略，并将其应用于凝胶MA与传统微流体芯片的结合上。水凝胶具有较高的生物相容性，研究人员可以将细胞封装在芯片体内。建议的基于GelMA的微流体芯片可以通过将细胞封装在芯片中作为在体外进行药物筛选、细胞相互作用研究等的合适模型来进一步完善。我们相信，这里描述的GelMA的制造方法将提高这一领域的发展速度，并可应用于进一步的生物医学研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由中国国家重点研究发展计划（2018YFA07030000）、国家自然科学基金（No.U1609207，81827804）、国家自然科学创新研究团体科学基金赞助。中国基金会（第51821093号）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter membrane | Millipore | ||
| 2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) | Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China | ||
| 3D bioprinter | SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China | ||
| 405nm wavelength light | SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China | ||
| co-axial nozzle | SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China | ||
| confocal fluorescence microscope | OLYMPUS FV3000 | ||
| digital light processing (DLP) bioprinter | SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China | ||
| DLP printer | SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium with L-glutamine (DMEM/F-12) | Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China | ||
| EFL Software | SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China | ||
| fetal bovine serum (FBS) | Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China | ||
| gelatin | Sigma-Aldrich, Shanghai, China | ||
| gelatin methacryloyl (GelMA) | SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China | ||
| high voltage power | SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China | ||
| lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China | ||
| paraformaldehyde | Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China | ||
| penicillin/streptomycin | Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China | ||
| sodium alginate (Na-Alg) | Sigma-Aldrich, Shanghai, China | ||
| TRITC phalloidin | Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China | ||
| Triton X-100 | Solarbio Co., Ltd., Shanghai, China |
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