여기에서 우리는 소장 오르가노이드의 장벽 무결성을 정량화하는 기술을 기술합니다. 이 방법이 살아있는 오르가노이드를 기반으로 한다는 사실은 시간 해결 방식으로 상이한 장벽 무결성 변조 물질 또는 이들의 조합에 대한 순차적 조사를 가능하게 한다.
오르가노이드 및 3차원(3D) 세포 배양은 시험관 내에서 복잡한 생물학적, 기전 및 규정을 조사할 수 있게 해주며, 이는 이전에는 고전 세포 배양 단층에서 불가능하였다. 더욱이, 단층 세포 배양은 시험관내 모델 시스템에서는 양호하지만 3D 구조에 의존하는 복잡한 세포 분화 과정 및 기능을 나타내지는않는다. 이것은 지금까지 광학 기술로 평가하기 어렵고, 시간이 많이 걸리고, 어려운 동물 실험에서만 가능했습니다. 여기에서 우리는 살아있는 소장 마우스 오르가노이드에 있는 시간 지남에 따라 장벽 무결성을 정량적으로 결정하기 위하여 분석실험을 기술합니다. 우리의 모형을 검증하기 위하여는, 우리는 IFN-γ 수용체 2에서 파생된 장벽 파괴 및 오르가노이드를 위한 양성 통제로 인터페론 감마 (IFN-γ)를 음성 대조군으로 마우스를 녹아웃하기 위하여 적용했습니다. 분석을 통해 우리는 IFN-γ가 장장벽 무결성및 IFN-γ에 미치는 영향을 클로딘-2, -7, 및 -15의 단단한 접합 단백질의 분해를 유도하는 것을 확인할 수 있었습니다. 이 분석은 또한 장 장벽 무결성에 화학 화합물, 단백질, 독소, 박테리아, 또는 환자 유래 탐사기의 충격을 조사하기 위하여 이용될 수 있었습니다.
상피 장벽의 무결성은 정점 접합 복합체(AJC)에 의해 유지되며, 이는 단단한 접합부(TJ) 및 접합부(AJ) 단백질1로구성된다. AJC의 편광 구조는 생체 내에서의 기능에 매우 중요합니다. AJC의 dysregulation는 각종 질병에서 나타나고 선동적인 장 병인의 중요한 트리거로 의심됩니다. 장 장벽 기능의 손실은 질병의 발신 이벤트를 나타냅니다. 공생 박테리아와 염증 반응의 다음 전좌는 고통스러운 결과2.
다양한 생체 외 및 생체 내 모델은 AJC의 규제를 조사하기 위해개발되었습니다. Transwell 분석은 종양 세포주로부터 유래된 2차원(2D) 세포 단층체에 기초한다. 이러한 시스템은 광학 및 생화학적 방법으로 평가하고 동시에 많은 샘플의 분석을 가능하게 하지만 생체 내에서 존재하는 1차 세포 및 분화 과정의 많은 특징이 결여되어있다. 동물 모델에서도 장벽 무결성을 조사하는 것이 가능합니다. 말단 실험에서, 전체 장의 투과성에 생체 내 특정 치료의 효과는 정량화 될 수있다. 그러나, 이 모형은 동물의 다수를 요구하고, 그(것)들은 근본적인 분자 프로세스의 상세한 가시화를 허용하지 않습니다. 요즘 개선된 3D 체외 모델은 세포 분화 과정, 세포 분극, 및 장의 토굴-융모 구조를 나타내는 3.000달러를 밀접하게 재현하는 것을 이용할 수 있다.3 기능 분석을 위한 3D 장 오르가노이드를 적용하려면 2D 모델에서 사용 가능한 방법을 적용해야 합니다. 여기에서 우리는 살아있는 소장 마우스 오르가노이드에 있는 장 방벽 무결성을 조사하는 모형을 기술합니다. 이 분석은 IFN-γ가 장벽 무결성 및 각각의 단단한 접합 단백질8에미치는 영향을 조사하기 위해 확립되었다.
레슬리4,Zietek5,또는 피어스6에의해 적용 된 기술과는 달리, 이는 배지에서 루시퍼 노란색 (LY)를 제거 한 후 형광을 측정, 우리의 접근 방식은 시간이 지남에 따라 형광의 발광의 정량화를 할 수 있습니다. 따라서, 결과는 동적 섭취 운동학을 나타내고 우리의 분석실험은 실험 의 과정 동안 추가자극또는 억제제의 적용을 가능하게 한다. 두 분석이 외부 암기측에서 내부 정점 표면으로의 섭취량을 측정한다는 사실은 생체 내 상황과 는 대조적이다. Hill et al.7에의해 설명된 모델에서,이 주제를 탐구했다. 오르가노이드의 내강으로 형광의 미세 주입시, 형광을 정량화시켰다. 확산 방향은 생체 내에서 존재하는 방향을 나타낸다. 미세 주입의 기술적 노력은 이 방법의 처리량을 분명히 감소시킵니다. 여기에 설명된 모델과 는 달리, 미세 주입 방법은 정점 상피 표면에서 생물학적 활성화를 필요로 하는 효과를 측정할 수 있게 한다.
여기에 제시된 오르가노이드 장벽 무결성 모델은 살아있는 세포 현미경 검사법을 기반으로 하며 시간이 지남에 따라 AJC 규정 내에서 동적 변화를 분석할 수 있습니다. 설치는 장 장벽의 무결성을 유도하고 억제하는 물질의 약리학적 영향을 테스트하기 위해 적용 될 수 있습니다. 또한, 오르가노이드 기반 모델은 약리학 연구에 사용되는 동물의 수를 줄이는 데 도움이됩니다.
이 분석은 살아있는 오르가노이드 내의 장 장벽 무결성을 연구하는 기술을 제공합니다. 전체 분석은 소장 마우스 오르가노이드 및 공초점 살아있는 세포 현미경 검사법에 근거를 둔다. 따라서 오르가노이드의 적절한 취급을 사전에 연습해야합니다. 격리시, 오르가노이드는 일상적으로 분할하고 냉동동결 에의해 저장 될 수있다3,9. 이 분석의 경우 치료가 시작되기 전에 오르가노이드 48 h를 분할하는 것이 좋습니다. 이 기간은 오르가노이드가 완전히 닫고 구형 구조를 형성 할 수있는 기회를 제공합니다. 실험을 위한 오르가노이드의 파종은 분석내의 중요한 단계이다. 개별 처리 변형을 줄이려면 시드 프로세스에 대한 일상적인 절차를 권장합니다. 이 단계는 매우 중요하며 일상적인 처리 프로토콜은 실험적 변형을 명확하게 줄입니다.
시딩 절차(단계 1.7) 동안 오르가노이드는 표준 10 μL 파이펫 팁을 통해 반복적으로 통과시킴으로써 단편화됩니다. 이 쪽의 상품의 기공 크기는 회사마다 다릅니다. 이 절차는 사전에 실행되어야하며, 결과는 항상 위상 대비 현미경 검사법에 의해 확인되어야한다. 일단 얻은 오르가노이드가 원하는 크기에 도달하면 절차를 변경하지 마십시오.
오르가노이드의 시드는 사용 가능한 현미경 설정에 맞게 최적화되고 조정되어야 합니다. 적어도 48 시간 동안 배양 및 이미지 오르가노이드를 할 수 있도록, 배양 된 현미경 챔버는 절대적으로 필요하다. 요구 사항에 맞는 챔버 커버 슬립을 선택하십시오. 오르가노이드를 시드 할 때 커버 슬립 표면에 오르가노이드를 집중하십시오. 이것은 세포 매트릭스 오르가노이드 현탁액을 배치 한 후 5 분 동안 얼음 팩에 챔버 커버 슬립을 유지함으로써 가능합니다. 이 단계는 공초점 살아있는 세포 화상 진찰의 질을 증가시키기 위하여 중요합니다. 공초점 현미경 렌즈의 축 해상도 및 작동 거리는 특히 제한적입니다. 샘플을 렌즈에 가까이 가져갈수록 이미지를 더 잘 이미지할 수 있으며 LY 형광을 자극하기 위해 레이저 에너지가 적게 필요합니다.
광택시는 살아있는 세포 현미경 검사법에 관해서 중요한 문제입니다. 이 분석에서는 이 옵션을 제외합니다. 기능성 AJC는 오가노이드의 루멘(도1,PBS)에서 LY를 배제함으로써 볼 수 있다. 실험의 끝에 EGTA의 추가는 AJC 단백질을 위한 공동 인자인 이중 이온의 격리를 일으키는 원인이 됩니다. LY는 기능성 AJC 복합체를 가진 중요한 오르가노이드에서만 오르가노이드의 내성에서 제외됩니다. 일반적으로 형광 분자는 장 장벽의 무결성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 그 원거리에서 정점구획9에장 세포에서 세포전환으로 수송되기 때문에 플루오레세인 표지된 덱천과 같은 그밖 통용되는 형광단 대신에 LY를 선택했습니다. 우리는 또한 작은 크기 때문에 LY를 선택했습니다. LY는 분자량이 457 Da이므로 소분자에 대한 장벽 투과성의 조사를 용이하게 합니다. 형광 분자는 조사된 과학적 질문에 따라 선택되어야 합니다. 광독성 AJC 결함이 존재하기 때문에 레이저 여기 에너지가 감소되거나 이미징 간격이 연장되어야 합니다. 이 분석법을 위한 최적 공초점 화상 진찰 기술은 디스크 현미경 검사법을 회전하고 있습니다. 각 계측기는 낮은 레이저 전력으로 짧은 노출 시간으로 공초점 이미징을 가능하게 합니다.
다른 모델은 이미 시험관에서 장 장벽 무결성을 연구하기 위해 개발되었습니다. 세포주 단층 또는 생체 내 실험에 기초한 실험의 사용이 감소하는 동안, 오르가노이드 기반 방법은 증가하고 있다. 앞서 설명한 방법과는 달리4,5,6,,7,우리의 방법은 시간이 지남에 따라 장벽 기능을 정량화 할 수 있습니다. 이것은 실험의 과정을 통해 추가 자극에 오르가노이드의 노출을 허용합니다. 여기서 우리는 실험의 끝에 두 번째 자극으로서 EGTA를 양성 대조군으로 적용한다.
생체 내 상황과는대조적으로, 우리의 분석에서 LY는 배지에 첨가되고 외부 기단상 상피 측에서 내부 정점 루멘을 향해 오르가노이드를 관통한다. LY는 작고 장 장벽의 압박감을 시각화하는 데만 사용됩니다. 상피 층을 정점 표면에서 조절하는 분자 및 자극은 오르가노이드의 루멘7에주입될 필요가 있다. 실험적 노력을 줄이고 많은 오르가노이드의 장벽 무결성을 동시에 측정할 수 있도록 외부에서 형광 염료를 적용하기로 결정했습니다.
우리는 작은 장 마우스 오르가노이드의 단단한 접합에 IFN-γ의 기능을 조사하기 위하여 분석실험을 이용했습니다. 우리가 살아있는 오르가노이드에 있는 장벽 무결성을 분석할 수 있었다는 사실은 장 방벽의 염증 유도한 고장에 대한 억제제를 기술하기 위하여 이 기술을 적용하는 미래 가능성을 제안합니다. IFN-γ에 의한 장벽 기능을 중화시키는 물질은 염증성 장 질환의 치료를 위한 후보가 될 수 있으며, 이 경우 장벽 기능이 손상되는 병원성 인자 중 하나이다10.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 독일 연구 재단 (DFG) [KFO257, 프로젝트 4에서 M.S.로, C.B.에 프로젝트 1의 보조금에 의해 지원되었다; FOR2438, 프로젝트 2에서 M.S. 및 E.N.에, 프로젝트 5에서 C.B.; SFB1181 프로젝트 C05에서 C.B.; TRR241, 프로젝트 A06 을 N.B.L. 및 M.S.로, A03에서 C.B.로, BR5196/2-1에서 N.B.L.로, BE3686/2에서 C.B.로 프로젝트합니다.]; 임상 센터 에를랑겐 (M.S., E.N., 및 M.B.), W. Lutz Stiftung (M.S.) 및 임상 센터 에를랑겐의 Forschungsstiftung Medizin의 임상 연구 (IZKF)에 대한 학제 간 센터 (M.S.). 본 작품은 마르코 바덴바처 박사의 학위를 취득하기위한 요구 사항의 (부분) 이행에서 수행되었다.
48-well culture plate | Thermo Fisher Scientific | #150687 | |
8-well chamber slides | Ibidi | #80826 | |
96-well culture plate | Greiner Bio-One | #655101 | |
Axio Observer.Z1 – spinning disc | Zeiss | excitation laser 488 nm / emission filter 525/25 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
Cell strainer | Falcon | 352350 | |
Centrifugation tube 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 11507411 | |
Centrifugation tube 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 10788561 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 431788-25g | |
EGTA | Sigma-Aldrich | 431788 | |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
Matrigel, growth factor reduced, phenol red free | Corning | 356231 | Cell matrix solution |
Mice | The Jackson Laboratory | M. musculus C57/Bl6 | |
Microscope coverslip | 24×60 mm | ||
Organoid Growth Medium mouse | Stemcell Technologies | #06005 | |
Phosphate buffered saline | Biochrom | L182-05 | |
Recombinant murine IFN-γ | Biolegend | Cat#575304 |