Här beskriver vi en teknik för att kvantifiera barriärintegriteten hos små tarmorganoider. Det faktum att metoden är baserad på levande organoider möjliggör sekventiell undersökning av olika barriärintegritetsmodulerande ämnen eller kombinationer av dessa på ett tidsuppslöjt sätt.
Organoider och tredimensionella (3D) cell kulturer tillåter undersökning av komplexa biologiska mekanismer och förordningar in vitro, som tidigare inte var möjligt i klassiska cell kultur monolayers. Dessutom monolayer cell kulturer är bra in vitro-modell system men representerar inte de komplexa cellulära differentiering processer och funktioner som är beroende av 3D-struktur. Detta har hittills bara varit möjligt i djurförsök, som är mödosamma, tidskrävande och svåra att bedöma med optiska tekniker. Här beskriver vi en analys för att kvantitativt bestämma barriärintegriteten över tiden i levande små intestinala mus organoider. För att validera vår modell tillämpade vi interferongamma (IFN-γ) som en positiv kontroll för barriärförstöring och organoider som härrör från IFN-γ receptor 2 knock out möss som en negativ kontroll. Analysen gjorde det möjligt för oss att bestämma effekten av IFN-γ på tarmbarriären integritet och IFN-γ inducerad nedbrytning av den snäva korsningen proteiner claudin-2, -7 och -15. Denna analys kan också användas för att undersöka effekterna av kemiska föreningar, proteiner, toxiner, bakterier, eller patient-härledda sonder på tarmbarriären integritet.
Epitelbarriärens integritet upprätthålls av det apikala junctionalkomplexet (AJC), som består av snäva korsnings- (TJ) och följsamhetskorsning (AJ) proteiner1. Den polariserade strukturen av AJC är avgörande för dess funktion in vivo. Dysregulation av AJC finns i olika sjukdomar och misstänks vara en viktig utlösande faktor för inflammatoriska tarm patogenes. Förlust av tarmbarriärfunktion representerar den inledande händelsen av sjukdomen. Följande flyttning av commensal bakterier och inflammatoriska reaktioner är de smärtsamma konsekvenserna2.
Olika in vitro- och in vivo-modeller har utvecklats för att undersöka regleringen av AJC. Transwell-analysen är baserad på tvådimensionella (2D) cell monolayers som härleddes från tumör cellinjer. Dessa system är bra att bedöma med optiska och biokemiska metoder och möjliggöra analys av många prover samtidigt men saknar många funktioner i primära celler och differentieringsprocesser som finns in vivo. Att undersöka barriärintegriteten är också möjligt i djurmodeller. I terminalexperiment kan effekterna av specifika behandlingar in vivo på permeabiliteten i hela tarmen kvantifieras. Dessa modeller kräver dock ett stort antal djur, och de tillåter inte detaljerad visualisering av de underliggande molekylära processerna. Numera förbättrade 3D in vitro-modeller finns tillgängliga som nära rekapitulering cell differentiering processer, cellpolarisering, och representerar crypt-villus struktur tarmen3. Tillämpningen av 3D intestinala organoider för funktionella analyser kräver anpassning av tillgängliga metoder från 2D-modeller. Här beskriver vi en modell för att undersöka tarmbarriärens integritet i levande små intestinala mus organoider. Analysen inrättades för att undersöka effekten av IFN-γ på barriärintegriteten och respektive snäva kopplingsproteiner8.
I motsats till den teknik som tillämpas av Leslie4, Zietek5, eller Pearce6, som mäter fluorescens efter avlägsnande lucifer gul (LY) från mediet, tillåter vår metod kvantifiering av luminal upptag av fluorofore över tiden. Därför representerar resultatet ett dynamiskt upptag kinetisk och vår analys möjliggör tillämpning av ytterligare stimuli eller hämmare under experimentet. Det faktum att båda analyserna mäter upptaget från utsidan basolateral sida till insidan apikal yta står i tydlig kontrast till situationen in vivo. I en modell som beskrivs av Hill et al.7, utforskades detta ämne. Vid microinjection av fluorofore i organoid lumen, fluorescens kvantifierades. Riktningen av diffusion föreställer riktningen som är närvarande in vivo. Den tekniska ansträngningen av microinjection minskar tydligt genomströmningen av denna metod. I motsats till den modell som beskrivs här möjliggör mikroinjektionsmetoden mätning av effekter som kräver biologisk aktivering på den apikala epitelytan.
Den organoidbarriärintegritetsmodell som presenteras här är baserad på levande cellmikroskopi och möjliggör analys av dynamiska förändringar inom AJC-förordningen över tid. Inställningen kan användas för att testa den farmakologiska effekten av ämnen som inducer och hämmar tarmbarriärens integritet. Dessutom bidrar organoidbaserade modeller till att minska antalet djur som används för farmakologiska studier.
Denna analys erbjuder en teknik för att studera tarmbarriären integritet inom levande organoider. Hela analysen är baserad på små intestinala mus organoider och confocal levande cellmikroskopi. Därför är det obligatoriskt att öva korrekt hantering av organoider i förväg. Vid isolering kan organoider rutinmässigt delas och lagras genom kryofrysning3,9. För denna analys rekommenderar vi att man delar organoiderna 48 timmar innan behandlingen påbörjas. Denna period ger organoiderna chansen att helt stänga och bilda sfäriska strukturer. Såddningen av organoiderna för experimentet är ett kritiskt steg inom analysen. För att minska individuella hanteringsvariationer rekommenderar vi ett rutinförfarande för såddprocessen. Detta steg är avgörande, och ett rutinmässigt hanteringsprotokoll minskar tydligt experimentella variationer.
Under såddproceduren (steg 1.7) fragmenteras organoiderna genom repetitiv passering genom en standard 10 μL pipettspets. Porstorleken på denna produkt varierar från företag till företag. Detta förfarande bör praktiseras i förväg, och resultatet bör alltid kontrolleras med faskontrastmikroskopi. När de organoider som erhållits når önskad storlek, ändra inte proceduren.
Såddningen av organoiderna måste optimeras och anpassas för den tillgängliga mikroskopiska installationen. För att kunna odla och avbilda organoider i minst 48 timmar krävs absolut en inkuberad mikroskopkammare. Välj ett kammarstrum som matchar dina krav. Vid sådd organoider, se till att koncentrera organoider på täcket ytan. Detta är möjligt genom att hålla det kamrade täcket på en isförpackning i 5 min efter att cellmatris-organoid suspension. Detta steg är viktigt för att öka kvaliteten på konfokal levande cell imaging. Den axiella upplösningen och arbetsavståndet för konfokalmikroskoplinser är särskilt begränsade. Ju närmare du tar provet till linsen, desto bättre kan du bild det och mindre laserenergi behövs för att excitera LY fluorescens.
Phototaxis är en viktig fråga när det gäller levande cellmikroskopi. Inom denna analys utesluter vi detta alternativ. En funktionell AJC är synlig genom uteslutning av LY från organoid lumen (Figur 1, PBS). Tillsatsen av EGTA i slutet av experimentet orsakar bindning av bivalentjoner, som är kofaktorer för AJC-proteiner. LY är utesluten från organoid lumen endast i vitala organoider med en funktionell AJC komplex. I allmänhet kan fluorescerande molekyler användas för att mäta tarmbarriärens integritet. Vi valde LY istället för andra vanliga fluorofores såsom fluorescein märkt dextran eftersom de transporteras transcellulärt i tarmceller från basala till det apikala facket9. Vi valde också LY på grund av dess ringa storlek. LY har en molekylvikt på 457 Da och underlättar därför undersökningen av barriärpermeabiliteten för små molekyler. Lysrörsmolekylen måste väljas beroende på den vetenskapliga fråga som undersöks. Eftersom fototoxiska AJC-defekter finns måste laser excitationsenergi minskas eller bildningsintervallet förlängas. Den optimala konfokalavbildningstekniken för denna analys är spinning av skivmikroskopi. Respektive instrument möjliggör konfial avbildning med kort exponeringstid vid låg lasereffekt.
Olika modeller har redan utvecklats för att studera tarmbarriären integritet in vitro. Medan användningen av analyser baserade på cellinje monolayers eller experiment in vivo minskar, organoid-baserade metoder ökar. I motsats till metoder som tidigare beskrivits4,5,6,7, tillåter vår metod kvantifiering av barriärfunktion över tiden. Detta möjliggör exponering av organoider till ytterligare stimuli under experimentets gång. Här tillämpar vi EGTA som en andra stimulans i slutet av experimentet som en positiv kontroll.
I motsats till situationen in vivo, i vår analys LY läggs till i mediet och tränger in i organoid från utsidan basolateral epitelial sida mot insidan apikal lumen. LY är liten och används endast för att visualisera tätheten av tarmbarriären. Molekyler och stimuli som modulerar epitelskiktet vid den apikala ytan måste injiceras i organoidens lumen7. För att minska den experimentella ansträngningen och för att kunna mäta barriärintegriteten hos många organoider samtidigt valde vi att applicera det fluorescerande färgämnet utifrån.
Vi använde analysen för att undersöka funktionen av IFN-γ på den snäva korsningen av små intestinala mus organoider. Det faktum att vi kunde analysera barriärintegriteten hos levande organoider erbjuder framtida möjligheter att tillämpa denna teknik för att beskriva hämmare för den inflammation-inducerad nedbrytning av tarmbarriären. Ämnen som motverkar den nedsatta barriärfunktionen som orsakas av IFN-γ kan vara kandidater för behandling av inflammatoriska tarmsjukdomar, där nedsatt barriärfunktion är en av de patogena faktorerna10.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från Tyska forskningsstiftelsen (DFG) [KFO257, projekt 4 till M.S. och projekt 1 till C.B.; FOR2438, projekt 2 till M.S. och E.N. och projekt 5 till C.B.; SFB1181 projekt C05 till C.B.; TRR241, projekt A06 till N.B.L. och M.S., projekt A03 till C.B., BR5196/2-1 till N.B.L. och BE3686/2 till C.B.]; det tvärvetenskapliga centrera för klinisk forskning (IZKF) av kliniskt centrera Erlangen (till M.S., E.N., och M.B.), W. Lutz Stiftungen (till M.S.) och Forschungsstiftungen Medizin av kliniskt centrera Erlangen (till M.S.). Det nuvarande arbetet utfördes i (partiell) uppfyllande av kraven för att erhålla graden Dr Med. av Marco Bardenbacher.
48-well culture plate | Thermo Fisher Scientific | #150687 | |
8-well chamber slides | Ibidi | #80826 | |
96-well culture plate | Greiner Bio-One | #655101 | |
Axio Observer.Z1 – spinning disc | Zeiss | excitation laser 488 nm / emission filter 525/25 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
Cell strainer | Falcon | 352350 | |
Centrifugation tube 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 11507411 | |
Centrifugation tube 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 10788561 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 431788-25g | |
EGTA | Sigma-Aldrich | 431788 | |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
Matrigel, growth factor reduced, phenol red free | Corning | 356231 | Cell matrix solution |
Mice | The Jackson Laboratory | M. musculus C57/Bl6 | |
Microscope coverslip | 24×60 mm | ||
Organoid Growth Medium mouse | Stemcell Technologies | #06005 | |
Phosphate buffered saline | Biochrom | L182-05 | |
Recombinant murine IFN-γ | Biolegend | Cat#575304 |