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Medicine

살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사

doi: 10.3791/60546 Published: March 26, 2020
* These authors contributed equally

Summary

여기에서 우리는 소장 오르가노이드의 장벽 무결성을 정량화하는 기술을 기술합니다. 이 방법이 살아있는 오르가노이드를 기반으로 한다는 사실은 시간 해결 방식으로 상이한 장벽 무결성 변조 물질 또는 이들의 조합에 대한 순차적 조사를 가능하게 한다.

Abstract

오르가노이드 및 3차원(3D) 세포 배양은 시험관 내에서 복잡한 생물학적, 기전 및 규정을 조사할 수 있게 해주며, 이는 이전에는 고전 세포 배양 단층에서 불가능하였다. 더욱이, 단층 세포 배양은 시험관내 모델 시스템에서는 양호하지만 3D 구조에 의존하는 복잡한 세포 분화 과정 및 기능을 나타내지는않는다. 이것은 지금까지 광학 기술로 평가하기 어렵고, 시간이 많이 걸리고, 어려운 동물 실험에서만 가능했습니다. 여기에서 우리는 살아있는 소장 마우스 오르가노이드에 있는 시간 지남에 따라 장벽 무결성을 정량적으로 결정하기 위하여 분석실험을 기술합니다. 우리의 모형을 검증하기 위하여는, 우리는 IFN-γ 수용체 2에서 파생된 장벽 파괴 및 오르가노이드를 위한 양성 통제로 인터페론 감마 (IFN-γ)를 음성 대조군으로 마우스를 녹아웃하기 위하여 적용했습니다. 분석을 통해 우리는 IFN-γ가 장장벽 무결성및 IFN-γ에 미치는 영향을 클로딘-2, -7, 및 -15의 단단한 접합 단백질의 분해를 유도하는 것을 확인할 수 있었습니다. 이 분석은 또한 장 장벽 무결성에 화학 화합물, 단백질, 독소, 박테리아, 또는 환자 유래 탐사기의 충격을 조사하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

Introduction

상피 장벽의 무결성은 정점 접합 복합체(AJC)에 의해 유지되며, 이는 단단한 접합부(TJ) 및 접합부(AJ) 단백질1로구성된다. AJC의 편광 구조는 생체 내에서의 기능에 매우 중요합니다. AJC의 dysregulation는 각종 질병에서 나타나고 선동적인 장 병인의 중요한 트리거로 의심됩니다. 장 장벽 기능의 손실은 질병의 발신 이벤트를 나타냅니다. 공생 박테리아와 염증 반응의 다음 전좌는 고통스러운 결과2.

다양한 생체 외 및 생체 내 모델은 AJC의 규제를 조사하기 위해개발되었습니다. Transwell 분석은 종양 세포주로부터 유래된 2차원(2D) 세포 단층체에 기초한다. 이러한 시스템은 광학 및 생화학적 방법으로 평가하고 동시에 많은 샘플의 분석을 가능하게 하지만 생체 내에서 존재하는 1차 세포 및 분화 과정의 많은 특징이 결여되어있다. 동물 모델에서도 장벽 무결성을 조사하는 것이 가능합니다. 말단 실험에서, 전체 장의 투과성에 생체 내 특정 치료의 효과는 정량화 될 수있다. 그러나, 이 모형은 동물의 다수를 요구하고, 그(것)들은 근본적인 분자 프로세스의 상세한 가시화를 허용하지 않습니다. 요즘 개선된 3D 체외 모델은 세포 분화 과정, 세포 분극, 및 장의 토굴-융모 구조를 나타내는 3.000달러를 밀접하게 재현하는 것을 이용할 수 있다.3 기능 분석을 위한 3D 장 오르가노이드를 적용하려면 2D 모델에서 사용 가능한 방법을 적용해야 합니다. 여기에서 우리는 살아있는 소장 마우스 오르가노이드에 있는 장 방벽 무결성을 조사하는 모형을 기술합니다. 이 분석은 IFN-γ가 장벽 무결성 및 각각의 단단한 접합 단백질8에미치는 영향을 조사하기 위해 확립되었다.

레슬리4,Zietek5,또는 피어스6에의해 적용 된 기술과는 달리, 이는 배지에서 루시퍼 노란색 (LY)를 제거 한 후 형광을 측정, 우리의 접근 방식은 시간이 지남에 따라 형광의 발광의 정량화를 할 수 있습니다. 따라서, 결과는 동적 섭취 운동학을 나타내고 우리의 분석실험은 실험 의 과정 동안 추가자극또는 억제제의 적용을 가능하게 한다. 두 분석이 외부 암기측에서 내부 정점 표면으로의 섭취량을 측정한다는 사실은 생체 내 상황과 는 대조적이다. Hill et al.7에의해 설명된 모델에서,이 주제를 탐구했다. 오르가노이드의 내강으로 형광의 미세 주입시, 형광을 정량화시켰다. 확산 방향은 생체 내에서 존재하는 방향을 나타낸다. 미세 주입의 기술적 노력은 이 방법의 처리량을 분명히 감소시킵니다. 여기에 설명된 모델과 는 달리, 미세 주입 방법은 정점 상피 표면에서 생물학적 활성화를 필요로 하는 효과를 측정할 수 있게 한다.

여기에 제시된 오르가노이드 장벽 무결성 모델은 살아있는 세포 현미경 검사법을 기반으로 하며 시간이 지남에 따라 AJC 규정 내에서 동적 변화를 분석할 수 있습니다. 설치는 장 장벽의 무결성을 유도하고 억제하는 물질의 약리학적 영향을 테스트하기 위해 적용 될 수 있습니다. 또한, 오르가노이드 기반 모델은 약리학 연구에 사용되는 동물의 수를 줄이는 데 도움이됩니다.

Protocol

모든 단계는 모든 관련 규제 및 기관 동물 관리 지침을 준수하고 준수하여 완료되었습니다.

1. 오르가노이드 도금

  1. 앞서 설명한 대로 오르가노이드를분리3. 절차는 아래에 간략하게 설명되어 있습니다.
    1. 쥐에서 소장을 수집합니다.
    2. 소장을 세로로 열고 커버 슬립으로 내부 장 조직을 긁어 서 융모 팁을 제거합니다.
    3. 가위를 사용하여 작은 조각으로 장 조직을 잘라.
    4. 차가운 인산완충식염수(PBS)에서 5x를 25mL 파이펫으로 10배 위아래로 파이펫팅하여 세척합니다.
    5. 차가운 2 mM EDTA 용액으로 조직 조각을 수평 떨기 플랫폼에서 30 분 동안 얼음에 배양하십시오. 티슈 조각을 퇴적물을 허용합니다.
    6. 조직 조각이 바닥에 정착하면 EDTA 용액을 PBS 버퍼로 교체하십시오. 상급을 버리고 PBS의 20 mL를 추가합니다.
    7. 10 mL 파이펫으로 10 배 위아래로 활발하게 피펫을 피펫하여 조직에서 장 지하실을 방출하십시오.
    8. 원심 분리관에서 상판을 수집하고 위상 대비 현미경검사법으로 검사합니다. 이렇게 하려면, 96 웰 셀 배양 플레이트에 상판의 한 방울을 첨가한다. 얼음에 원심 분리 튜브를 유지합니다.
    9. 수집된 상복부의 장 토굴 수가 감소할 때까지 1.1.6-1.1.8단계를 반복합니다.
    10. 70 μm 세포 스트레이너를 통해 가장 많은 토굴을 포함하는 분획을 전달합니다.
    11. 300 x g,4 °C에서 5 분 동안 토굴 현탁액을 원심 분리기.
    12. 상급을 버리고 토굴을 씻기 위해 차가운 PBS에 펠릿을 다시 놓습니다. 그런 다음 1.1.11에 설명된 대로 원심분리 단계를 반복합니다.
    13. 펠렛을 세포 매트릭스 용액 과 뮤린 오르가노이드 배양 배지의 1:1 혼합물의 웰당 총 25 μL로 재중단하고 48개의 웰 세포 배양 플레이트에서 오르가노이드를 플레이트한다.
    14. 세포 매트릭스 용액이 고화될 수 있도록 20분 동안 37°C, 5%CO2에서, 오르가노이드를 배양한다.
    15. 잘 당 뮤린 오르가노이드 매체의 300 μL로 오르가노이드를 덮습니다.
    16. 유기체를 37°C, 5%CO2에서배양하고, 배지를 2-3일마다 변화시다.
    17. 배양 7일 후에 실험에 오르가노이드를 사용하십시오.
  2. 장벽 무결성 측정을 위해 오르가노이드를 준비합니다.
    1. 소 혈청 알부민 (BSA)으로 도금 과정에서 오르가노이드를 저장하는 데 사용되는 모든 원심 분리 튜브를 PBS에 0.1 % BSA 용액을 충분히 추가하여 모든 플라스틱 표면을 덮습니다. 그런 다음 BSA 용액을 다시 제거하고 원심분리튜브를 얼음 위에 보관합니다.
    2. 얼음에 세포 매트릭스 용액 및 오르가노이드 배양 배지를 해동.
  3. 오르가노이드를 분리하려면, 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 차가운 PBS의 1 mL에서 48 웰 플레이트중 하나에서 오르가노이드를 다시 중단한다. 활발한 파이펫팅으로 셀 매트릭스를 용해시면 됩니다. 항상 BSA로 미리 코팅 원심 분리 튜브에 오르가노이드 현탁액을 유지하고 항상 얼음에 보관하십시오.
    참고: 챔버형 커버슬립 슬라이드 내의 오르가노이드의 밀도, 크기 및 위치는 분할 비, 세포 매트릭스 용액 농도 및 오르가노이드 세포 매트릭스 현탁액의 처리에 의해 영향을 받습니다. 셀 매트릭스 솔루션의 처리를 사전에 연습하는 것이 좋습니다. 일반적으로 8 개의 잘 챔버 유리 커버립은 분석에 적합합니다. 한 웰의 웰(48 웰 플레이트)으로부터 유래된 오르가노이드는 8개의 잘 챔버된 커버슬립의 2개의 웰로 분할될 수 있다(잘 당 오르노이드 세포 매트릭스 펠릿의 40 μL).
  4. 4°C에서 300 x g에서 5분 동안 오르가노이드 현탁액을 원심분리기.
  5. 조심스럽게 상류를 버리고 차가운 PBS 1 mL로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
  6. 5 분 동안 300 x g,4 °C에서 오르가노이드 현탁액을 원심 분리기.
  7. 상판을 완전히 버리고 40 μL의 차가운 배지에 있는 48 개의 웰 플레이트에서 잘 파생 된 오르가노이드를 다시 중단하십시오. 파종된 대형 오르가노이드 구조물은 10 μL 파이펫 팁을 통해 오간노이드 현탁액을 5배 파이펫팅하여 파종을 위한 40-60 μm 크기의 구조물을 수집한다.
    참고: 10μL 팁을 오르가노이드 구조물의 단편화를 위해 100 μL 파이펫 팁에 사용하고, 일관된 결과를 보장하기 위해 사전에 1.7단계를 연습한다. 원심분리관 내의 위상 대비 현미경 검사법에 의해 오르가노이드의 크기를 제어합니다. 더 이상 다분기 오르가노이드가 존재하지 않고 오르가노이드 조각이 대략 40-60 μm 길이인지 확인하십시오.
  8. 오르가노이드가 원하는 크기를 얻으면 세포 매트릭스 용액의 40 μL과 혼합합니다 (중간 : 세포 매트릭스 솔루션 = 1 :1).
    참고: 일관된 결과를 얻으려면 배지 대 셀 매트릭스 용액 비율을 일정하게 유지해야 합니다. 세포 매트릭스 용액의 희석은 오르가노이드 덩어리의 강성을 감소시키고 확산 특성에 영향을 미칩니다. 셀 매트릭스 용액을 함유하는 모든 현탁액에 미리 냉각된 파이펫 팁(-20°C)을 사용합니다.
  9. 8 개의 잘 챔버 커버 슬립의 각 웰의 중앙에 오르노이드 세포 매트릭스 용액 현탁액의 40 μL을 놓습니다.
  10. 슬라이드를 얼음 팩에 5분 동안 보관하십시오. 이것은 세포 매트릭스 오르가노이드 현탁액 액체를 보존하고 중력에 의해 커버 슬립 표면에서 오르가노이드 농도를 증가시킵니다.
  11. 유기성 세포 매트릭스 방울의 중합을 가능하게 하기 위해 37°C 및 5%CO2에서 20분 동안 배양한다.
  12. 잘 당 150 μL의 오르가노이드 배양 배지를 추가하고 실험 처리를 진행하기 전에 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 배양한다.
    1. 이 기간을 사용하여 오르가노이드를 치료하고 해당 과학적 가설에 따라 장벽 무결성을 조절하십시오. 양성 대조를 위해, IFN-γ와 함께 48시간 동안 오르가노이드를 치료하여 IFN-γ 관련 결속 분해 및 투과성 증가를 조사한다. 10 U/mL(10 ng/mL) 재조합 뮤린 IFN-γ로 양성 대조군을 자극합니다. 잘 치료되지 않은 하나의 오르가노이드를 둡니다.
  13. 배양 오르가노이드는 최대 48시간 동안 37°C 및 5%CO2에서.

2. 조직성 퍼뮤지성 분석

  1. 현미경의 배양챔버를 적어도 2시간 37°C로 가져와 오르가노이드를 이미징하는 동안 열 드리프트를 감소시키기 위한 실험을 시작한다.
  2. PBS에서 LY의 100 mM 솔루션을 준비합니다. 빛으로부터 보호된 얼음에 보관하십시오.
  3. PBS에서 EGTA의 200mM 솔루션을 준비합니다. 얼음에 보관하십시오.
  4. 오가노이드를 포함한 챔버 커버슬립을 역전된 공초점 현미경의 인큐베이션 챔버로 옮기고CO2 배양을 켜십시오(5%). 챔버 커버 슬립이 현미경의 단계 내에 단단히 잠겨 있는지 확인하십시오.
  5. 참조뿐만 아니라 하나에 오르가노이드를 사용하여, 현미경의 화상 진찰 설정을 조정합니다. LY(배지 의 150 μL에서 100 μL의 3 μL)를 첨가하여 배지의 300 μL에서 1 mM LY의 최종 부피를 얻었다. 1 시간 동안 현미경에 배양하고 오르가노이드의 루멘 이미징에 대한 초점을 조정합니다. LY 여기(488nm)와 기기의 각 검출 감도에 필요한 레이저 에너지를 정의하고 사용 중인 계측기의 사용 가능한 동적 범위의 30-40%에서 LY 형광을 이미지화하려고 합니다.
    참고: 레이저 여기 에너지 및 치료되지 않은 오르가노이드에 검출 효율을 조정 70 LY의 첨가 후 분. 여기 에너지가 잘 노출된 이미지를 얻을 수 있을 만큼 충분히 높은지 확인합니다. 현미경 이미지 내에서 LY 형광의 포화를 방지하려면 LY 확산이 정상 상태에 도달한 후 이러한 설정을 조정하는 것이 좋습니다.
  6. 차동 간섭 콘트라스트(DIC) 라이브 이미징에 의해 오르가노이드의 위치를 정의합니다. 비슷한 직경 (80 ± 30 μm)을 가진 오르가노이드를 이미지화하고 오르가노이드의 중앙 슬라이스에 초점을 맞추어 루멘을 이미지화하십시오. 잘 당 대략 10 개의 오르가노이드를 정의하고 구형 구조로 커버 슬립 표면에 가까운 오르가노이드만 이미지하려고합니다.
    참고: 실행당 이미지화할 수 있는 오르가노이드의 수는 현미경의 속도에 따라 달라집니다. 5 분 간격 내에서 오르가노이드를 이미지화하는 것이 좋습니다. 일반 레이저 스캐닝 현미경에서는 총 40개의 위치가 합리적인 출발점입니다.
  7. 장벽 무결성 분석에 사용되는 LY를 웰에 추가하기 전에 오르가노이드의 모양과 자가 형광을 문서화하기 위해 모든 위치의 DIC 및 LY 형광을 기록합니다.
  8. 높은 자가형광을 나타내는 오르가노이드를 이미지화하지 마십시오. 이것은 오르가노이드의 내적 내의 죽은 세포의 축적 때문이며, 자가 형광 오르가노이드의 결과는 나중에 분석하기 어렵습니다.
  9. 제조된 LY 용액의 3 μL(배지 의 100 μL에서 100 mM LY)을 희석하고 챔버 커버슬립을 건드리지 않고 각 우물에 조심스럽게 첨가한다. 웰 당 LY의 권장 농도는 1 mM입니다. 웰당 최종 부피는 300 μL이어야 합니다.
  10. 정의된 위치의 초점을 빠르게 확인하고 필요한 경우 수정합니다.
    참고: LY는 셀 매트릭스를 통해 빠르게 확산됩니다. 따라서 공초점 이미징은 불소 첨가 후 3분 이내에 시작되어야 합니다.
  11. 현미경에 시간 경과 화상 진찰을 시작합니다. 총 70분 동안 5분마다 모든 포지션의 형광 이미지를 찍습니다.
    참고: 오르가노이드는 시간이 지남에 따라 LY 의 섭취량을 시각화하기 위해 5 분 간격으로 이미지화되었습니다. 장 장벽 고장을 측정하기 위해, LY 첨가 후 60분 전과 EGTA 첨가 후 다시 10분 후에 형광을 기록하는 것으로 충분하다.
  12. 챔버 커버 슬립을 건드리지 않고 잘 준비된 EGTA 용액의 3 μL을 추가합니다. EGTA의 챔버 커버 슬립 내에서 권장농도는 2 mM입니다. 웰당 총 부피는 300 μL이어야 합니다.
  13. 두 번째 시간 경과를 시작합니다. 정의된 오르가노이드의 형광을 총 30분 동안 5분 간격으로 다시 기록합니다.
  14. 현지 안전 규정에 따라 모든 것을 폐기하십시오.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

3. 데이터 분석

  1. EGTA 첨가 후 LY를 차지한 오르가노이드의 결과만 분석한다.
  2. 결과는 피지 ImageJ로 정량화 할 수 있습니다.
  3. File |을 클릭하여 ImageJ에서 데이터 집합 열기 이미지 데이터를 열고 선택합니다. 다음 BIO 형식 가져오기 옵션 대화 상자에서 하이퍼스택을 사용 하 여 스택 보기를 선택 합니다.
  4. 분석을 클릭하여 관심 영역(ROI) 관리자 열기 | 도구 | ROI 관리자.
  5. ImageJ 메뉴 모음에서 타원형 선택 버튼을 클릭하여 타원형 ROI를 그립니다. 오르가노이드의 내부 내강을 포함하는 선택을 그립니다. 그런 다음 ROI 관리자에 추가를 누릅니다.
  6. 오르가노이드 외부의 세 가지 대표 영역에 대한 단계를 반복합니다.
  7. 메뉴 모음에서 분석을 클릭하고 측정 값 설정을 선택합니다. 회색 값만 사용하도록 설정하고 다른 측정을 사용하지 않도록 설정합니다. 그런 다음 확인을클릭합니다.
  8. ROI 관리자에서 모든 ROI를 선택해야 합니다. ROI 관리자에서 더 많은 것을 클릭합니다 | 다중 측정. 옵션 대화 상자에서 모든 [...] 슬라이스슬라이스당 하나의 행측정을 선택합니다. 그런 다음 확인을클릭합니다.
  9. 결과 창에서 모든 값을 선택하고 추가 분석을 위해 스프레드시트 응용 프로그램에 복사합니다.
    참고: 타임랩스 이미징 중에 오르가노이드의 위치가 이동한 경우 ROI를 그에 따라 조정해야 합니다. 이렇게 하려면 ROI 관리자에서 올바른 ROI를 선택하고 새 위치로 이동합니다. 그런 다음 ROI 관리자에서 업데이트를 클릭합니다. ROI 관리자에서 측정값을 클릭하여 각 시점의 측정값을 개별적으로 수행한 다음 아래쪽의 막대를 사용하여 이미지 창의 다음 타임포인트로 전환합니다. 스프레드시트에서 모든 측정값을 수집합니다. 이미징 기간 동안 오르가노이드의 개별 적인 모양 및 이동은 수동 방식으로 데이터의 분석을 필요로 합니다.
  10. 각 타임포인트에 대한 오르가노이드 외부의 3개의 ROI의 평균 강도 값을 계산합니다.
  11. 오르가노이드 내부의 ROI 강도를 외부 ROI의 평균 강도와 오르가노이드 내부의 평균 강도로 나눕니다.
  12. 발광 유기성 형광의 상대적 증가를 계산하기 위해, 최소한의 상대 형광에 의해 이미지 된 각 시점에서 상대 형광 (단계 3.11 참조)을 나눕니다.
    참고: 때로는 형광의 확산이 실험의 시작 부분에서 느려질 수 있기 때문에 최소한의 상대 형광을 사용하십시오.

Representative Results

3D 소장용 마우스 오르가노이드를 모델로 하여 장장벽 무결성을 조절하는 화합물의 효과를 정량화하기 위해 IFN-γ를 적용했습니다. 이를 위해, IFN-γ 8에 반응하지 않는 IFN-γ 반응형 및 IFN-γ 수용체-2 녹아웃 마우스로부터 유래된 유기노이드를 분리 및 배양하였다.8 IFN-γ 또는 PBS(대조군)로 48시간 동안 치료시, 모든 오르가노이드는 LY에 노출되었고 공초점 방적 디스크 라이브 세포 현미경으로 70분 동안 5분 간격으로 영상을 화하였습니다. 이 모형에 있는 장 방벽의 기능적 무결성은 LY의 내막 축적이 TJ의 파괴를 의미하는 동안 오르가노이드의 내적 에서 LY의 배제 귀착되었습니다. LY를 가진 배양의 70 분 후에 대표적인 형광 현미경 심상은 명확하게 IFN-γ로 처리된 야생 형 동물에서 오르가노이드에서 만 보였다는 것을 명확하게 보여줍니다. 비자극(PBS) 대조군에서 또는 동물을 녹아웃(IFN-γR2ΔIEC,1)으로부터유래한 오르가노이드에서, 70분 후에 내발형 LY 형광이 존재하지 않았다.

EGTA의 추가는 TJ 공동 인자를 격리하여 장 장벽 무결성의 비특이적 인 고장을 일으킵니다. 이러한 대조군은 항상 실험의 끝에서 LY를 차지하기 위한 각각의 오르가노이드의 능력을 입증하기 위해 활용되었다(도1). EGTA 치료 시 내 발광 LY 형광이 검출되지 않은 경우, 오르가노이드는 실험에서 제외되었다.

현미경 결과의 정량적 평가를 위해, LY 형광은 오르가노이드의 내강 내 및 오르가노이드 의 외부 내에서 측정되었다. 상대 강도 값을 계산하고(내부 + 내부 의 형광 내부) 이미지화될 때마다 표시됩니다. 다양한 크기의 오르가노이드의 이미징을 피하는 것이 좋습니다. 우리는 직경이 80 ± 30 μm(그림 2)의오르가노이드에 집중하기로 결정했습니다. 대표적인 이미지가 있는 프로토콜의 회로도는 그림 3에나와 있습니다. 그림 4에몇 가지 주요 문제 및 문제 해결 기술이 표시되고 설명되어 있습니다.

Figure 1
그림 1: 장 장벽 무결성은 마우스 오르가노이드에서 분석할 수 있습니다. IFN-γR2WT 및 IFN-γR2ΔIEC로부터장 오르가노이드를 48시간 동안 IFN-γ의 존재에서 배양하거나 치료되지 않은 상태로 방치하였다. 장장벽의 무결성을 조사하기 위해, LY(457 Da)를 추가하고 공초점 형광 영상을 총 70분 간격으로 캡처하였다. 축척 막대 = 20 μm). 이 그림은 바덴바처등에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 소장 오르가노이드 장벽 무결성 모델은 정량적 결과를 제공합니다. (A)LY 형광은 오르가노이드 내외에서 결정되었다. 상대 강도 값은 초기 상대 강도 + SEM을 기준으로 계산(내부/형광 외부 + 내부)을 계산하고 각 시점마다 표시됩니다. (B)분석 된 오르가노이드의 크기 분포. 표면 대 부피 비율의 변화로 인한 표준 편차 및 오류를 줄이기 위해, 우리는 단지 80 ± 30 μm의 직경을 가진 오르가노이드를 분석했다.WT IFN-γR2ΔIEC,n = 18). 평균 지름 값은 상이한 그룹(단방향 ANOVA)간에 크게 다르지 않았다. (C)유기체의 투과성은 LY를 첨가한 후 70분 후에 결정되었다. 관찰 기간 동안 측정된 최소 상대형광강도에 의해 70분 후의 내형형광강도를 나누어 정의하였다. 각 막대는 두 개의 독립적인 실험에서 파생된 10개의 오르가노이드로 측정된 평균 값 + SD를 나타낸다(IFN-γR2WT,n = 20; IFN-γR2ΔIEC,n = 18). IFN-γ는 IFN-γR2WT 오르가노이드에서만 LY 섭취량을 현저히 증가시다. 학생의 t-test에서 p-값 & 0.001. 이 그림은 바덴바처등에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 대표 이미지가 있는 회로도 프로토콜입니다. (A)프로토콜의 주요 단계에 대한 개략적 설명입니다. (B)프로토콜의 주요 단계의 대표 사진. (B1) DIC 현미경 이미지는 투과성 분석을 위해 선택된 적합한 오르가노이드를 통해 중앙 슬라이스를 통해. 점선은 LY를 첨가하기 전에(B1)에서동일한 오르가노이드의 89 μm.(B2)의 형광 현미경 사진을 나타낸다.B2 이미지는 오르가노이드의 자가형광을 보여줍니다. (B3) LY를 첨가한 후 70분 간 오르가노이드. 묘사된 오르가노이드는 LY의 아무 과정도 보여주지 않으며 그러므로 온전한 방벽 기능. 점선은 추가 분석을 위해 ROI를 표시합니다. 오르가노이드의 내부 내강구와 오르가노이드 주변의 3 개의 대표적인 영역이 표시됩니다. (B4) EGTA를 첨가 한 후 오르가노이드. 오르가노이드는 EGTA 치료 후 LY 섭취량을 나타내기 때문에 추가 분석에 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 일반적인 문제 해결. (A)일반적인 문제와 해결 방안이 있는 표입니다. (B)예시적인 이미지. (B1) 이 분석에 적합하지 않은 큰 다중 분기 오르가노이드의 DIC 이미지. (B2). LY가 배지에 첨가되기 전에 높은 자가형광을 나타내는 오르가노이드의 공초점 이미지. 유기체는 정량화에서 제외되었다. (B3) LY가 배지에 첨가되기 전에 낮은 자가형광을 나타내는 오르가노이드의 공초점 이미지. 이 경우 형광을 정량화시켰다. (B4) 유기노이드는 EGTA를 첨가한 후 30분 후에 배지로부터 LY 섭취량을 나타내지 않았고 따라서 정량화에서 제외하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 분석은 살아있는 오르가노이드 내의 장 장벽 무결성을 연구하는 기술을 제공합니다. 전체 분석은 소장 마우스 오르가노이드 및 공초점 살아있는 세포 현미경 검사법에 근거를 둔다. 따라서 오르가노이드의 적절한 취급을 사전에 연습해야합니다. 격리시, 오르가노이드는 일상적으로 분할하고 냉동동결 에의해 저장 될 수있다3,9. 이 분석의 경우 치료가 시작되기 전에 오르가노이드 48 h를 분할하는 것이 좋습니다. 이 기간은 오르가노이드가 완전히 닫고 구형 구조를 형성 할 수있는 기회를 제공합니다. 실험을 위한 오르가노이드의 파종은 분석내의 중요한 단계이다. 개별 처리 변형을 줄이려면 시드 프로세스에 대한 일상적인 절차를 권장합니다. 이 단계는 매우 중요하며 일상적인 처리 프로토콜은 실험적 변형을 명확하게 줄입니다.

시딩 절차(단계 1.7) 동안 오르가노이드는 표준 10 μL 파이펫 팁을 통해 반복적으로 통과시킴으로써 단편화됩니다. 이 쪽의 상품의 기공 크기는 회사마다 다릅니다. 이 절차는 사전에 실행되어야하며, 결과는 항상 위상 대비 현미경 검사법에 의해 확인되어야한다. 일단 얻은 오르가노이드가 원하는 크기에 도달하면 절차를 변경하지 마십시오.

오르가노이드의 시드는 사용 가능한 현미경 설정에 맞게 최적화되고 조정되어야 합니다. 적어도 48 시간 동안 배양 및 이미지 오르가노이드를 할 수 있도록, 배양 된 현미경 챔버는 절대적으로 필요하다. 요구 사항에 맞는 챔버 커버 슬립을 선택하십시오. 오르가노이드를 시드 할 때 커버 슬립 표면에 오르가노이드를 집중하십시오. 이것은 세포 매트릭스 오르가노이드 현탁액을 배치 한 후 5 분 동안 얼음 팩에 챔버 커버 슬립을 유지함으로써 가능합니다. 이 단계는 공초점 살아있는 세포 화상 진찰의 질을 증가시키기 위하여 중요합니다. 공초점 현미경 렌즈의 축 해상도 및 작동 거리는 특히 제한적입니다. 샘플을 렌즈에 가까이 가져갈수록 이미지를 더 잘 이미지할 수 있으며 LY 형광을 자극하기 위해 레이저 에너지가 적게 필요합니다.

광택시는 살아있는 세포 현미경 검사법에 관해서 중요한 문제입니다. 이 분석에서는 이 옵션을 제외합니다. 기능성 AJC는 오가노이드의 루멘(도1,PBS)에서 LY를 배제함으로써 볼 수 있다. 실험의 끝에 EGTA의 추가는 AJC 단백질을 위한 공동 인자인 이중 이온의 격리를 일으키는 원인이 됩니다. LY는 기능성 AJC 복합체를 가진 중요한 오르가노이드에서만 오르가노이드의 내성에서 제외됩니다. 일반적으로 형광 분자는 장 장벽의 무결성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 그 원거리에서 정점구획9에장 세포에서 세포전환으로 수송되기 때문에 플루오레세인 표지된 덱천과 같은 그밖 통용되는 형광단 대신에 LY를 선택했습니다. 우리는 또한 작은 크기 때문에 LY를 선택했습니다. LY는 분자량이 457 Da이므로 소분자에 대한 장벽 투과성의 조사를 용이하게 합니다. 형광 분자는 조사된 과학적 질문에 따라 선택되어야 합니다. 광독성 AJC 결함이 존재하기 때문에 레이저 여기 에너지가 감소되거나 이미징 간격이 연장되어야 합니다. 이 분석법을 위한 최적 공초점 화상 진찰 기술은 디스크 현미경 검사법을 회전하고 있습니다. 각 계측기는 낮은 레이저 전력으로 짧은 노출 시간으로 공초점 이미징을 가능하게 합니다.

다른 모델은 이미 시험관에서 장 장벽 무결성을 연구하기 위해 개발되었습니다. 세포주 단층 또는 생체 내 실험에 기초한 실험의 사용이 감소하는 동안, 오르가노이드 기반 방법은 증가하고 있다. 앞서 설명한 방법과는 달리4,5,6,,7,우리의 방법은 시간이 지남에 따라 장벽 기능을 정량화 할 수 있습니다. 이것은 실험의 과정을 통해 추가 자극에 오르가노이드의 노출을 허용합니다. 여기서 우리는 실험의 끝에 두 번째 자극으로서 EGTA를 양성 대조군으로 적용한다.

생체 내 상황과는대조적으로, 우리의 분석에서 LY는 배지에 첨가되고 외부 기단상 상피 측에서 내부 정점 루멘을 향해 오르가노이드를 관통한다. LY는 작고 장 장벽의 압박감을 시각화하는 데만 사용됩니다. 상피 층을 정점 표면에서 조절하는 분자 및 자극은 오르가노이드의 루멘7에주입될 필요가 있다. 실험적 노력을 줄이고 많은 오르가노이드의 장벽 무결성을 동시에 측정할 수 있도록 외부에서 형광 염료를 적용하기로 결정했습니다.

우리는 작은 장 마우스 오르가노이드의 단단한 접합에 IFN-γ의 기능을 조사하기 위하여 분석실험을 이용했습니다. 우리가 살아있는 오르가노이드에 있는 장벽 무결성을 분석할 수 있었다는 사실은 장 방벽의 염증 유도한 고장에 대한 억제제를 기술하기 위하여 이 기술을 적용하는 미래 가능성을 제안합니다. IFN-γ에 의한 장벽 기능을 중화시키는 물질은 염증성 장 질환의 치료를 위한 후보가 될 수 있으며, 이 경우 장벽 기능이 손상되는 병원성 인자 중 하나이다10.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 독일 연구 재단 (DFG) [KFO257, 프로젝트 4에서 M.S.로, C.B.에 프로젝트 1의 보조금에 의해 지원되었다; FOR2438, 프로젝트 2에서 M.S. 및 E.N.에, 프로젝트 5에서 C.B.; SFB1181 프로젝트 C05에서 C.B.; TRR241, 프로젝트 A06 을 N.B.L. 및 M.S.로, A03에서 C.B.로, BR5196/2-1에서 N.B.L.로, BE3686/2에서 C.B.로 프로젝트합니다.]; 임상 센터 에를랑겐 (M.S., E.N., 및 M.B.), W. Lutz Stiftung (M.S.) 및 임상 센터 에를랑겐의 Forschungsstiftung Medizin의 임상 연구 (IZKF)에 대한 학제 간 센터 (M.S.). 본 작품은 마르코 바덴바처 박사의 학위를 취득하기위한 요구 사항의 (부분) 이행에서 수행되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well culture plate Thermo Fisher Scientific #150687
8-well chamber slides Ibidi #80826
96-well culture plate Greiner Bio-One #655101
Axio Observer.Z1 - spinning disc Zeiss excitation laser 488 nm / emission filter 525/25
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3059-100G
Cell strainer Falcon 352350
Centrifugation tube 15 mL Thermo Fisher Scientific 11507411
Centrifugation tube 50 mL Thermo Fisher Scientific 10788561
EDTA Sigma-Aldrich 431788-25g
EGTA Sigma-Aldrich 431788
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma-Aldrich L0259
Matrigel, growth factor reduced, phenol red free Corning 356231 Cell matrix solution
Mice The Jackson Laboratory M. musculus C57/Bl6
Microscope coverslip 24 mm x 60 mm
Organoid Growth Medium mouse Stemcell Technologies #06005
Phosphate buffered saline Biochrom L182-05
Recombinant murine IFN-γ Biolegend Cat#575304

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References

  1. López-Posadas, R., Stürzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1240 (2017).
  2. Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20, (1), 91-99 (2014).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  4. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83, (1), 138-145 (2015).
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  6. Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16, (1), 19 (2018).
  7. Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
  8. Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
  9. Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22, (3), 330-331 (1999).
  10. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews: Immunology. 9, (11), 799-809 (2009).
살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사
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Bardenbacher, M., Ruder, B., Britzen-Laurent, N., Naschberger, E., Becker, C., Palmisano, R., Stürzl, M., Tripal, P. Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids. J. Vis. Exp. (157), e60546, doi:10.3791/60546 (2020).More

Bardenbacher, M., Ruder, B., Britzen-Laurent, N., Naschberger, E., Becker, C., Palmisano, R., Stürzl, M., Tripal, P. Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids. J. Vis. Exp. (157), e60546, doi:10.3791/60546 (2020).

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