Her beskriver vi en teknikk for å kvantifisere barriereintegriteten til små tarmorganoider. Det faktum at metoden er basert på levende organoider muliggjør sekvensiell undersøkelse av ulike barriere integritet modulerende stoffer eller kombinasjoner derav på en tidsbestemt måte.
Organoider og tredimensjonale (3D) cellekulturer tillater undersøkelse av komplekse biologiske mekanismer og forskrifter in vitro, som tidligere ikke var mulig i klassisk cellekultur monolayers. Videre er monolayer cellekulturer gode in vitro-modellsystemer, men representerer ikke de komplekse cellulære differensieringsprosessene og funksjonene som er avhengige av 3D-struktur. Dette har så langt bare vært mulig i dyreforsøk, som er arbeidskrevende, tidkrevende og vanskelig å vurdere ved optiske teknikker. Her beskriver vi en analyse for å kvantitativt bestemme barriereintegriteten over tid i å leve små tarmmusorganoider. For å validere vår modell, brukte vi interferon gamma (IFN-γ) som en positiv kontroll for barriereødeleggelse og organoider avledet fra IFN-γ reseptor 2 slå ut mus som en negativ kontroll. Analysen tillot oss å bestemme virkningen av IFN-γ på tarmbarrierenintegritet og IFN-γ indusert nedbrytning av de stramme koblingsproteinene claudin-2, -7 og -15. Denne analysen kan også brukes til å undersøke virkningen av kjemiske forbindelser, proteiner, toksiner, bakterier eller pasientavledede sonder på tarmbarrierens integritet.
Integriteten til epitelbarrieren opprettholdes av det apikale junctional-komplekset (AJC), som består av tett veikryss (TJ) og festekrysset (AJ) proteiner1. Den polariserte strukturen til AJC er avgjørende for sin funksjon in vivo. Dysregulering av AJC er tilstede i ulike sykdommer og mistenkes for å være en viktig utløser av inflammatorisk tarmpatogenese. Tap av tarmbarrierefunksjon representerer den initierende hendelsen av sykdommen. Følgende translokasjon av kommensale bakterier og inflammatoriske reaksjoner er de smertefulle konsekvensene2.
Ulike in vitro- og in vivo-modeller er utviklet for å undersøke forskriften av AJC. Transwell-analysen er basert på todimensjonale (2D) cellemonolag som ble avledet fra tumorcellelinjer. Disse systemene er gode å vurdere ved optiske og biokjemiske metoder og muliggjøre analyse av mange prøver samtidig, men mangler mange funksjoner i primære celler og differensieringsprosessene som finnes i vivo. Å undersøke barriereintegriteten er også mulig i dyremodeller. I terminaleksperimenter kan effekten av spesifikke behandlinger in vivo på permeabiliteten til hele tarmen kvantifiseres. Disse modellene krever imidlertid et stort antall dyr, og de tillater ikke detaljert visualisering av de underliggende molekylære prosessene. I dag forbedret 3D in vitro modeller er tilgjengelige som nøye rekapitulere celle differensiering prosesser, celle polarisering, og representerer krypt-villus strukturen i tarmen3. Anvendelsen av 3D intestinalorganoider for funksjonelle analyser krever tilpasning av tilgjengelige metoder fra 2D-modeller. Her beskriver vi en modell for å undersøke tarmbarriereintegritet i levende små tarmmusorganoider. Analysen ble etablert for å undersøke effekten av IFN-γ på barriereintegriteten og respektive stramme koblingsproteiner8.
I motsetning til teknikken som brukes av Leslie4, Zietek5, eller Pearce6, som måler fluorescens etter å ha fjernet lucifer gul (LY) fra mediet, tillater vår tilnærming kvantifisering av luminal opptaket av fluorofanforen over tid. Derfor representerer resultatet et dynamisk opptak kinetisk og vår analyse gjør det mulig å bruke flere stimuli eller hemmere i løpet av eksperimentet. Det faktum at begge analysene måler opptaket fra utsiden basolateral side til innsiden apical overflaten er i klar kontrast til situasjonen in vivo. I en modell beskrevet av Hill et al.7, ble dette emnet utforsket. Ved mikroinjeksjon av fluoroforforen i organoidlumen ble fluorescensen kvantifisert. Retningen av diffusjon representerer retningen som finnes i vivo. Den tekniske innsatsen for mikroinjeksjon reduserer tydelig gjennomstrømningen av denne metoden. I motsetning til modellen som er beskrevet her, gjør mikroinjeksjonsmetoden det mulig å måle effekter som krever biologisk aktivering på den apikale epiteloverflaten.
Organoid barriere integritet modellen presentert her er basert på live celle mikroskopi og muliggjør analyse av dynamiske endringer i AJC-forskriften over tid. Oppsettet kan brukes til å teste den farmakologiske virkningen av stoffer som induserer og hemmer integriteten til tarmbarrieren. Videre bidrar organoidbaserte modeller til å redusere antall dyr som brukes til farmakologiske studier.
Denne analysen tilbyr en teknikk for å studere tarmbarriereintegriteten i levende organoider. Hele analysen er basert på små tarmmusorganoider og konfokal levende cellemikroskopi. Derfor er det obligatorisk å praktisere riktig håndtering av organoider på forhånd. Ved isolasjon kan organoider rutinemessig deles og lagres ved kryofrysing3,9. For denne analysen anbefaler vi å dele organoidene 48 timer før behandlingen startes. Denne perioden gir organoidene muligheten til å helt lukke og danne sfæriske strukturer. Seeding av organoider for eksperimentet er et kritisk skritt i analysen. For å redusere individuelle håndteringsvariasjoner anbefaler vi en rutinemessig prosedyre for seeding-prosessen. Dette trinnet er avgjørende, og en rutinemessig håndteringsprotokoll reduserer helt klart eksperimentelle variasjoner.
Under seeding prosedyren (trinn 1.7) organoider bli fragmentert av repeterende passering gjennom en standard 10 μL pipette tips. Porestørrelsen på dette produktet varierer fra selskap til selskap. Denne prosedyren bør praktiseres på forhånd, og resultatet bør alltid kontrolleres av fasekontrastmikroskopi. Når organoidene oppnådd når ønsket størrelse, må du ikke endre prosedyren.
Seeding av organoider må optimaliseres og tilpasses for tilgjengelig mikroskopisk oppsett. For å kunne kultur og bilde organoider i minst 48 timer, er et inkubert mikroskopkammer helt nødvendig. Velg en kamret coverslip som passer dine behov. Når du ser organoidene, sørg for å konsentrere organoidene på dekkslipoverflaten. Dette er mulig ved å holde kamret coverslip på en ispakke i 5 min etter å ha plassert cellematrise-organoid suspensjon. Dette trinnet er viktig å øke kvaliteten på confocal live celle imaging. Den aksiale oppløsningen og arbeidsavstanden til konfokale mikroskoplinser er spesielt begrenset. Jo nærmere du bringer prøven til linsen, jo bedre kan du se det og jo mindre laserenergi er nødvendig for å opphisse LY fluorescens.
Fototaxier er et viktig problem når det gjelder levende cellemikroskopi. Innenfor denne analysen utelukker vi dette alternativet. En funksjonell AJC er synlig ved utelukkelse av LY fra organoidlumen (Figur 1, PBS). Tillegg av EGTA på slutten av eksperimentet forårsaker sequestering av bivalente ioner, som er kofaktorer for AJC proteiner. LY er utelukket fra organoidlumen bare i vitale organoider med et funksjonelt AJC-kompleks. Generelt kan fluorescerende molekyler brukes til å måle integriteten til tarmbarrieren. Vi valgte LY i stedet for andre vanlige fluoroforer som fluorescein merket dextran fordi de transporteres transcellulært i tarmceller fra basal til det apikale rommet9. Vi valgte også LY på grunn av sin lille størrelse. LY har en molekylvekt på 457 Da og letter derfor utredningen av barrierepermeabiliteten for små molekyler. Det fluorescerende molekylet må velges avhengig av det vitenskapelige spørsmålet som undersøkes. Fordi fototoksiske AJC defekter er til stede, laser eksitasjon energi må reduseres eller bildebehandlingsintervallet forlenges. Den optimale konfokale bildeteknikken for denne analysen er roterende platemikroskopi. Respektive instrumenter muliggjør konfokal avbildning med kort eksponeringstid ved lav lasereffekt.
Ulike modeller er allerede utviklet for å studere tarmbarriereintegritet in vitro. Mens bruken av analyser basert på cellelinje monolayers eller eksperimenter in vivo er fallende, organoid-baserte metoder øker. I motsetning til metoder som tidligere er beskrevet4,5,6,7, tillater vår metode kvantifisering av barrierefunksjon over tid. Dette gjør det mulig å eksponering av organoider til ekstra stimuli i løpet av eksperimentet. Her bruker vi EGTA som en andre stimulans på slutten av eksperimentet som en positiv kontroll.
I motsetning til situasjonen in vivo, i vår analyse LY legges inn i mediet og trenger inn i organoid fra utsiden basolateral epitelside mot innsiden apikal lumen. LY er liten og brukes bare til å visualisere tettheten av tarmbarrieren. Molekyler og stimuli som modulerer epitellaget på den apiske overflaten må injiseres i organoidlumen7. For å redusere eksperimentell innsats og for å kunne måle barriereintegriteten til mange organoider samtidig, valgte vi å bruke fluorescerende farge fra utsiden.
Vi brukte analysen til å undersøke funksjonen til IFN-γ på det stramme krysset mellom små tarmmusorganoider. Det faktum at vi var i stand til å analysere barriereintegriteten i levende organoider gir fremtidige muligheter til å bruke denne teknikken for å beskrive hemmere for betennelsesindusert nedbrytning av tarmbarrieren. Stoffer som motvirker den nedsatte barrierefunksjonen forårsaket av IFN-γ kan være kandidater til behandling av inflammatoriske tarmsykdommer, der nedsatt barrierefunksjon er en av de patogene faktorene10.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra German Research Foundation (DFG) [KFO257, prosjekt 4 til M.S. og prosjekt 1 til C.B.; FOR2438, prosjekt 2 til M.S. og E.N. og prosjekt 5 til C.B.; SFB1181 prosjekt C05 til C.B.; TRR241, prosjekt A06 til N.B.L. og M.S., prosjekt A03 til C.B., BR5196/2-1 til N.B.L. og BE3686/2 til C.B.]; Det tverrfaglige senter for klinisk forskning (IZKF) i Det kliniske senteret Erlangen (til M.S., E.N., og M.B.), W. Lutz Stiftung (til M.S.) og Forschungsstiftung Medizin fra Clinical Center Erlangen (til M.S.). Det nåværende arbeidet ble utført i (delvis) oppfyllelse av kravene for å oppnå graden Dr. Med. av Marco Bardenbacher.
48-well culture plate | Thermo Fisher Scientific | #150687 | |
8-well chamber slides | Ibidi | #80826 | |
96-well culture plate | Greiner Bio-One | #655101 | |
Axio Observer.Z1 – spinning disc | Zeiss | excitation laser 488 nm / emission filter 525/25 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
Cell strainer | Falcon | 352350 | |
Centrifugation tube 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 11507411 | |
Centrifugation tube 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 10788561 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 431788-25g | |
EGTA | Sigma-Aldrich | 431788 | |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
Matrigel, growth factor reduced, phenol red free | Corning | 356231 | Cell matrix solution |
Mice | The Jackson Laboratory | M. musculus C57/Bl6 | |
Microscope coverslip | 24×60 mm | ||
Organoid Growth Medium mouse | Stemcell Technologies | #06005 | |
Phosphate buffered saline | Biochrom | L182-05 | |
Recombinant murine IFN-γ | Biolegend | Cat#575304 |