Summary
在这里，我们提供了一种通过核化孢子菌或第二代美罗索特物实现鸡艾梅里亚寄生虫稳定转染的方法。表达异源抗原基因的转基因生物寄生虫可用作疫苗输送工具。
Abstract
转染是一个技术过程，通过它遗传物质，如DNA和双链RNA，被输送到细胞中，以修改感兴趣的基因。目前，转基因技术正在成为研究Eimeria（家禽和牲畜球菌病的病原体）不可缺少的工具。该协议提供了对美洲寄生虫稳定转染的详细描述：孢子石或第二代美罗索石的纯化和核化，以及转染寄生虫在体内传播。利用这个协议，我们实现了几种艾梅里亚的转染。总之，核素是一个有用的工具，以促进基因操作的人类寄生虫。
Introduction
Eimeria spp. 引起球菌病，给畜禽业带来巨大的经济损失。虽然抗凝球药物，并在一定程度上，衰减抗凝细胞疫苗，已被广泛用于控制球菌病，但仍存在缺陷，在耐药性，药物残留，和疫苗菌株的潜在扩散，重新获得毒性1。随着分子生物学的发展，转染已成为研究基因功能、研制新型疫苗、筛选Eimeria新药靶点的重要工具。
在过去的几十年中，转染已经成功地应用于疟原虫寄生虫，如疟原虫和弓形虫贡迪2，3，4，5，6。一项使用β-gal作为E.tenella转染报告员的研究在Eimeria7中试行了这种工作。E. tenella8、9、 E. mitis10和E. acervulina（张等人，未公开的数据）在鸡中成功转染。最近，我们通过核化11，利用E.necatrix的美罗佐特体实现了转染。
研究表明，表达异源抗原的Eimeria具有被开发为重组疫苗的潜力，如那些表达弯曲杆菌抗原A（CjaA）或鸡白莱金2（chIL-2）12，13。因此，该协议描述了对鸡中Eimeria spp的成核研究。该程序描述了孢子或美速物的纯化、用质粒DNA核化、克隆接种/静脉注射和体内繁殖，以帮助研究人员开始研究转基因Eimeria寄生虫。
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Protocol
所有动物实验的鸡按照中国农业大学动物护理与使用委员会的指导方针进行饲养和维护，并遵循《涉及动物的生物医学研究国际指导原则》。实验得到了北京市实验室动物管理委员会的批准。
1. 提取和纯化艾梅里亚孢子石（例如，E. tenella）
- 释放孢子
- 在 2，300 x g处将二铬酸钾溶液中的孢子卵母细胞（2.5%，m/v）离心 1 x 107孢子卵母细胞，5 分钟，用 PBS（磷酸缓冲液）清洗三次。
- 用 1 mL 的 PBS 重新悬浮颗粒，并转移到 15 mL 管中。添加同等体积的玻璃珠（1 毫米 x 1 毫米直径范围），并使用涡旋混合器振荡卵囊悬浮液，以释放孢子。
- 每分钟通过显微镜监测孢子的释放。当超过90%的卵母细胞破碎时，停止涡旋。
注：大多数卵母细胞（如E.tenella、E.necatrix和E.acervulina）在使用涡旋混合器1分钟后被打破。 - 将孢子悬浮液悬浮液转移到新的1.5 mL管和离心机在1，600 x g5分钟。
- 用1 mL的50%密度梯度溶液重新悬浮沉淀物，在1.5 mL管中组合，在10，000 x g下离心1分钟。
注：有关密度梯度组合，请参阅表1。密度梯度是一种基于硅基的胶体介质，由直径为15-30nm（水中23%w/w）的胶体硅颗粒组成，这些颗粒采用聚乙烯苯丙酮（PVP）进行涂层。
- 孢子石的释放
- 用排泄缓冲液重新悬浮沉淀物（表1），在42°C水浴中孵育40-60分钟，以释放孢子菌。当超过90%的孢子子释放时，停止孵育。然后在600 x g下离心10分钟。
注：在排泄期间，每5分钟摇动一次管子。 - 用1 mL的55%密度梯度溶液和10，000 x g的离心机重新悬浮沉淀1分钟。
- 用1 mL的PBS重新悬浮沉淀，并使用造细胞计计算孢子菌。
- 用排泄缓冲液重新悬浮沉淀物（表1），在42°C水浴中孵育40-60分钟，以释放孢子菌。当超过90%的孢子子释放时，停止孵育。然后在600 x g下离心10分钟。
2. E. necatrix的美罗佐特的收集和纯化
注意：在实验中使用7-14d岁的Arbor英亩（AA）肉鸡。无鸡只（n=3）接种了2 x 105卵母细胞的E.necatrix。感染后109小时，这些鸟因宫颈错位而牺牲。肠被移除，以收集第二代美罗佐特人。对于不同的Eimeria物种，有一个不同的时间收集第二代美罗佐特：E.necatrix在109小时，和E.tenella在112小时接种后。对于E.necatrix的转染，由于第二个美罗佐特人易于纯化，因此是最佳选择。
- E. necatrix的第二代美罗佐特人系列
- 纵向切开鸡肠，从蛋黄茎（小肠的中间）到蛋黄孔，用PBS或HBSS（汉克的平衡盐溶液）在培养皿中轻轻洗三次。
- 将肠子切成 0.5 厘米 x 0.5 厘米的片断，并将其放入带消化缓冲液的圆锥形烧瓶中（表 1）。将烧瓶置于 37°C 的磁性混合器上，用搅拌棒搅拌 30-60 分钟释放美罗佐。孵育30分钟后，每5分钟通过显微检查监测美罗索子的释放。
- 通过过滤和离心来净化美罗索特。
- 使用四层纱布14过滤含有消化的美罗索的悬浮液，并在600 x g下离心10分钟。
- 离心后，丢弃含有肠屑的上清液。将沉淀物与纯化的美罗佐特转移到1.5 mL管。
- 用1 mL的PBS重新悬浮降水，并使用细胞计计算美速体。
3. 美罗索石或孢子石的成核
- 寄生虫核素前的准备
- 在一根管中制备约107个美罗索石或孢子石。如果转染美罗佐特，准备3-4管。
- 制备大于或等于10μg的质粒DNA或纯化PCR片段。
注：本研究中使用的质粒包含2个基因：增强型黄色荧光蛋白（EYFP）和二氢叶酸还原酶胸腺酸酯合成酶，从弓形虫（TgDHFR-TS）15中衍生。 - 准备25U的限制酶。如果质粒线性化，限制性酶可以提高转染效率。如果质粒是圆形的，省略限制酶。
- 制备85μL的核素缓冲液：混合20μL的核素缓冲液I和1 mL的核素缓冲液II，并使用溶液的一部分。总缓冲器的体积为 100 μL。
- 核素
- 将孢子石或美罗佐石悬浮液悬浮液在600 x g下离心10分钟。然后丢弃上清液。
- 在以下顺序中，在含有孢子石或美速石的1.5 mL管中加入85μL的核转染缓冲液、10μg的质粒（PCR片段）和25U的限制性酶（通常为5μL）。
- 将悬浮液转移到核转染杯。将杯子放入核转移槽中。
- 使用电源按钮打开核化装置，然后选择转染程序U-033。如果核切装置在"自由程序选择"模式下启动，则按X按钮退出此模式。
- 程序完成后，按成核装置的X按钮，屏幕应显示正常，表示核子处理成功。
- 在核子杯中加入0.5-1 mL的Dulbeco改性鹰介质（DMEM）8，以停止反应，轻轻混合后将悬浮液转移到1.5 mL管。
4. 接种或静脉注射
- 将成核化寄生虫接种到7天大的鸡体内。通过氯酸盐途径接种E. necatrix的梅罗佐菌或E. tenella的孢子石，但通过静脉注射接种E. aavulina孢子菌。将大约 2 x10 7 百万孢子酸盐注入每只鸡中，每只鸟接种 107个异凝动物。
5. 传播和FACS排序
- 接种后5-9天用转染的孢子菌从粪便中收集卵泡。在接种后的第三天收集卵母细胞，用转染的美罗佐菌。
- 使用荧光活性细胞分拣（FACS）和150mg/kg丙胺8连续提高转基因种群比例。
注：通过在饲料中直接添加苯丙胺，使用苯丙胺。为方便使用，可制备水溶性丙胺。将1克丙胺素溶解在0.2 mL pf H2SO4和9.8 mL的N-甲基苯丙酮（NMP），然后将1.5 mL的这种库存溶液加入1L的鸟类饮用水中。
6. 可选列净化
注：如果需要更纯净的孢子石或美罗佐石，有一种可选方法，通过二乙酰-52纤维素（DE-52纤维素）列来净化它们。
- 至少提前一天准备 DE-52 纤维素柱。
- 准备甘氨酸稀释液缓冲液 （表 1）.将甘氨酸脱液液缓冲液的pH值从7.6调整至8.0，预热至41°C。
- 将 2.5 克 DE-52 纤维素添加到列中。加水，浸泡过夜。丢弃上清液。
- 加水浸泡1小时，丢弃上清液。
- 加入 0.1 M NaOH 并浸泡至少 2 小时。重复此步骤。
- 用水替换上清液。纤维素完全沉降到底部（约半小时）后，重复此步骤。
- 丢弃上清液，加入 0.1 M HCl，浸泡至少 2 小时。重复此步骤。
- 丢弃上清液，用甘氨酸洗液缓冲液浸泡纤维素两次。
- 通过添加 0.1 M HCl 或 0.1 M NaOH 来测量和调整 pH 值，从 7.6 到 8.0。
注：在此部分，液体的体积至少比DE-52纤维素的体积大5倍。
- 将流速调整在 40-50 r/min 之间。
- 完成纤维素的沉积后，将孢子石或美罗索石悬浮液添加到色谱柱中。将流速调整为 30-40 r/min。
注：在添加色谱柱之前，用甘氨酸增色剂缓冲液重新悬浮孢子石或美罗佐石沉淀物。 - 用甘氨酸稀释液将液集到50 mL管中。根据洗脱过程中孢子或美罗索石的微观检查结果停止收集。
- 将以600 x g收集的甘氨酸增脂液液液在600 x g处进行10分钟的离心机，将孢子石或美罗佐石沉淀物转移到新的1.5 mL管中。
- 使用造细胞计计算孢子石或美罗索菌。
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Representative Results
该协议已用于转染美洲寄生虫。在这项研究中，图2A和图2B显示了E.necatrix的第二代梅龙特和美罗佐石，而图2C和图2D显示了使用密度梯度溶液后E.tenella的孢子和孢子石。还显示了在核化了麦罗索特或孢子石之后的E.necatrix（图3A）和E.tenella（图3B）的卵泡。第一代卵泡在核化孢子菌后的转染效率一般在3-10%左右。然而，在核化了麦罗索石后，第二代卵泡的转染效率只有几千分之几（无法计算第一代卵泡的转染效率）。
图1：孢子石的纯化。（A） 通过密度梯度离心与密度梯度溶液净化孢子石。（B） 通过 DE-52 纤维素柱净化孢子石。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：E.necatrix的第二代梅龙特和美罗佐特，以及E.tenella的孢子和孢子石。（A）成熟的第二代梅龙特的E. necatrix.（B） 已发行的第二代 E. necatrix的美罗佐特人。（C） 纯化后的E. tenella孢子.（D） 纯化后的孢子球菌E. tenella.刻度条为 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：感染核化的麦罗佐石或孢子菌后获得的卵泡虫。（A） 感染核化美罗佐特菌后，E. necatrix的卵母细胞。（B） 感染核化孢子菌后E.tenella的卵母细胞。刻度条为 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
| 缓冲区 | 组成 |
| 消化缓冲器 | 0.25 g 胰蛋白酶，0.5克陶洛氧胆酸钠水合物，100毫升PBS或HBSS |
| 0.1 M NaOH | 2 克 NaOH，500 毫升水 |
| 0.1 M HCl | 4.3毫升浓缩盐酸，500毫升水 |
| 甘氨酸稀释剂缓冲液 | 0.75克甘氨酸，7.9克纳Cl，500毫升水 |
| 排泄缓冲器 | 0.75% 胰蛋白酶， 10% 鸡胆， PBS |
| 1 = DG 梯度库存溶液（Percoll） | 90% 1 = DG 梯度库存溶液（Percoll），10% PBS （10 X） |
| 核子缓冲器 I | ATP-二钠 2 g，MgCl2-6H2O 1.2 g，10 ml 水 |
| 核子缓冲液II | KH2PO4 6 g，NaHCO3 0.6 g，葡萄糖 0.2 g，500 毫升水 |
| *水：蒸馏水 | |
表1：缓冲区的组成。
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Discussion
在20世纪90年代，为阿皮兰寄生虫开发了转染系统，并用于研究美洲寄生虫。最近，在E.tenella8，9和E.nieschulzi15进行了稳定的转染。通过转染第二代美罗佐特11，实现了E.necatrix的稳定转染。通过翼静脉接种E.acervulina的转染孢子球，解决了E.acervulina孢子菌无法通过氯气途径接种的药管（张等人，未公布的数据）。在这里，我们描述了一个详细的转染过程，以帮助研究人员核化的食环动物寄生虫。
先前的研究表明，在腹腔切除术中将转染的孢子虫注射到兔子的肠道流明中是可行的，以进行E.magna16和E.肠17的体内稳定转染。根据我们的经验，在用FACS而不是卵囊对孢子进行分类时，效率更高。也有关于使用基因枪系统或使用eGFP-Ham-OTU RNA18、19成功电导的E.maxima未孢子卵母细胞转染的报告。因此，我们未来的研究探索卵母细胞或孢子虫的转染，以简化Eimeria寄生虫的转染程序。
艾美拉寄生虫的转染成功可以使转基因的Eimeria被用作携带异源抗原的疫苗工具，如C.jejuni13的CjaA。虽然艾梅里亚的转染效率已显著提高，但基因编辑技术在艾美菌寄生虫方面仍然存在局限性。随着艾梅里亚转染的发展，在艾梅里亚的CRISPR/CAS9技术（Hu等人，未公布的数据）可能导致对艾梅里亚的基因操纵。
总之，该协议为鸡艾梅里亚的核子处理提供了详细的程序。孢子石或美罗索的转染对研究艾梅里亚的基因功能有价值。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
这项工作得到了国家重点研究发展计划（2017YFD0501200）和国家自然科学基金（31572507、31772728和31873007）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
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