Summary
यहां, हमने न्यूक्लीफेकेटिंग स्पोरोज़ोइट्स या दूसरी पीढ़ी के मेरोजोइट्स द्वारा चिकन इमेरिया परजीवी के स्थिर ट्रांसफेक्शन को प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रदान की। विषमलोगोस एंटीजेनिक जीन व्यक्त करने वाले आनुवंशिक रूप से संशोधित ईमेरियन परजीवी का उपयोग वैक्सीन डिलीवरी वाहनों के रूप में किया जा सकता है।
Abstract
ट्रांसफेक्शन एक तकनीकी प्रक्रिया है जिसके माध्यम से आनुवंशिक सामग्री, जैसे डीएनए और डबल-फंसे आरएनए, ब्याज के जीन को संशोधित करने के लिए कोशिकाओं में वितरित किए जाते हैं। वर्तमान में, ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकी Eimeria,पोल्ट्री और पशुधन में coccidiosis के कारक एजेंटों के अध्ययन के लिए एक अनिवार्य उपकरण बनता जा रहा है । यह प्रोटोकॉल ईमेरियन परजीवी में स्थिर ट्रांसफेक्शन का विस्तृत विवरण प्रदान करता है: स्पूरोजोइट्स या दूसरी पीढ़ी के मेरोजोइट्स की शुद्धि और न्यूक्लियोफेक्शन, और ट्रांससंक्रमित परजीवी के वीवो प्रचार में। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने ईमेरियाकी कई प्रजातियों में ट्रांसफेक्शन हासिल किया। एक साथ लिया गया, न्यूक्लियोफेक्शन ईमेरियन परजीवी में आनुवंशिक हेरफेर को सुविधाजनक बनाने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
Introduction
Eimeria spp. coccidiosis का कारण बनता है, जो पशुधन और पोल्ट्री उद्योग में पर्याप्त आर्थिक नुकसान की ओर जाता है । हालांकि एंटीकोसिडायल दवाएं, और एक हद तक, तनु एंटीकोसिडायल टीकों, कोसिडिओसिस के नियंत्रण के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, अभी भी उनकी दवा प्रतिरोध, दवा अवशेषों, और वैक्सीन उपभेदों के संभावित प्रसार के बारे में कमियां हैं जो उग्रता1हासिल करते हैं। आणविक जीव विज्ञान के विकास के साथ, ट्रांसफेक्शन जीन कार्यों का अध्ययन करने, उपन्यास टीकों के विकास और Eimeriaके लिए नई दवा लक्ष्यों की स्क्रीनिंग के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है ।
पिछले दशकों में, प्लाज्मोडियम और टॉक्सोप्लास्मा गोंडी2,3,4,5,6जैसे एपीकॉम्प्लेक्सन परजीवी के लिए ट्रांसफेक्शन सफलतापूर्वक लागू किया गया है। ई. Tenella में ट्रांसफेक्शन के लिए एक रिपोर्टर के रूप में एक लड़की का उपयोग कर एक अध्ययन Eimeria7में इस तरह के काम का संचालन किया । ई. टेनेला8,9, ई मिटिस10,और ई. एसरवुलिना (झांग एट अल., अप्रकाशित डेटा) का ट्रांसफेक्शन मुर्गियों में सफल रहा । हाल ही में, हमने न्यूक्लियोफेक्शन11के माध्यम से ई. नेकेट्रिक्स के मेरोज़ोइट्स का उपयोग करके ट्रांसफेक्शन हासिल किया।
अध्ययनों से पता चला है कि एक विषमजीवस एंटीजन व्यक्त करने वाले ईमेरिया में एक पुनर्संयोजन टीका के रूप में विकसित करने की क्षमता है, जैसे कि कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी एंटीजन ए (CjaA) या चिकन इंटरल्यूकिन 2 (CHIL-2)12,13को व्यक्त करना। इसलिए, यह प्रोटोकॉल मुर्गियों में Eimeria spp के एक नाभिक अध्ययन का वर्णन करता है। यह प्रक्रिया स्पॉरोज़ोइट्स या मेरोजोइट्स की शुद्धि, प्लाज्मिड डीएनए के साथ न्यूक्लियोफेक्शन, क्लोकल इनोक्रेशर/नसों में इंजेक्शन और वीवो प्रचार में शोधकर्ताओं को ट्रांसजेनिक इमेरिया परजीवी पर अध्ययन शुरू करने में मदद करने के लिए वर्णित करती है ।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों के लिए मुर्गियों को चीन कृषि विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार रखा गया और पशुओं को शामिल करते हुए जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए अंतरराष्ट्रीय मार्गदर्शक सिद्धांतों का पालन किया गया । इन प्रयोगों को बीजिंग प्रशासन प्रयोगशाला पशुओं की समिति ने मंजूरी दी ।
1. Eimeria spp के स्पोरोज़ोइट्स की निष्कर्षण और शुद्धि (उदाहरण के लिए, ई. टेनेला)
- स्पोरोसिस्ट की रिहाई
- 5 मिन के लिए 2,300 x ग्राम पर पोटेशियम डिक्रोमेट सॉल्यूशन (2.5%, m/v) में सेंट्रलाइज 1 x 107स्पोरेटेड ओसिस्ट। उन्हें तीन बार पीबीएस (फॉस्फेट बफर सॉल्यूशन) से धोएं।
- पीबीएस के 1 mL के साथ छर्रों को फिर से निलंबित करें और 15 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें। कांच के मोतियों (1 मिमी x 1 मिमी व्यास रेंज) की बराबर मात्रा जोड़ें और स्पोरोसिस्ट को रिलीज करने के लिए भंवर मिक्सर का उपयोग करके ओसिस्ट निलंबन को दोलन करें।
- हर मिनट माइक्रोस्कोपी द्वारा स्पोरोसिस्ट की रिहाई की निगरानी करें। जब 90% से अधिक ओसिस्ट टूट जाते हैं तो भंवर बंद करें।
नोट: अधिकांश ओसिस्ट (जैसे ई टेनेला, ई. नेकेट्रिक्स,और ई. एसरवुलिना)भंवर मिक्सर का उपयोग करके 1 मिन के बाद टूट गए थे। - स्पोरोसिस्ट निलंबन को नए 1.5 मीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 5 मिन के लिए 1,600 x ग्राम पर अपकेंद्री रखें।
- 50% घनत्व ढाल समाधान के 1 mL के साथ उपजी को फिर से निलंबित करें, 1.5 एमएल ट्यूब में गठबंधन करें, और 1 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्री।
नोट: घनत्व ढाल संरचना के लिए, तालिका 1को देखें। घनत्व ढाल एक सिलिका आधारित कोलॉयडल माध्यम है, जिसमें 15-30 एनएम व्यास (पानी में 23% डब्ल्यू/डब्ल्यू) के कोलाइडल सिलिका कण शामिल हैं, जिन्हें पॉलीविनाइलपिरारोलिडोन (पीवीपी) का उपयोग करके लेपित किया गया है ।
- स्पोरोज़ोइट्स की रिहाई
- एक्साइटस्टेशन बफर(टेबल 1)के साथ उपजी को फिर से निलंबित करें और स्पोरोज़ोइट्स को छोड़ने के लिए 40-60 मिन के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेट करें। जब 90% से अधिक स्पोरोज़ोइट जारी किए जाते हैं तो इनक्यूबेटिंग बंद करें। फिर 10 मिन के लिए 600 x ग्राम पर अपकेंद्री।
नोट: एक्साइटस्टेशन के दौरान हर 5 मिनट में एक बार ट्यूब हिलाएं। - 55% घनत्व ढाल समाधान के 1 mL के साथ वर्षा को फिर से निलंबित करें और 1 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्री।
- पीबीएस के 1 एमएल के साथ वर्षा को फिर से निलंबित करें और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके स्पोरोज़ोइट्स की गणना करें।
- एक्साइटस्टेशन बफर(टेबल 1)के साथ उपजी को फिर से निलंबित करें और स्पोरोज़ोइट्स को छोड़ने के लिए 40-60 मिन के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेट करें। जब 90% से अधिक स्पोरोज़ोइट जारी किए जाते हैं तो इनक्यूबेटिंग बंद करें। फिर 10 मिन के लिए 600 x ग्राम पर अपकेंद्री।
2. ई. नेकाट्रिक्स के मेरोजोइट्स का संग्रह और शुद्धिकरण
नोट: प्रयोग में 7-14 डी आयु वर्ग के आर्बर एकड़ (ए. ए.) broilers का उपयोग करें । कोसिडिया-मुक्त मुर्गियों (एन = 3) को ई. नेकेट्रिक्सके 2 x 105 ओसिस्ट के साथ टीका लगाया गया था। संक्रमण के बाद १०९ घंटे में, पक्षियों को सर्वाइकल अव्यवस्था द्वारा बलिदान किया गया । 2पीढ़ी के मेरोजोइट्स के संग्रह के लिए आंत को हटा दिया गया था। विभिन्न Eimeria प्रजातियों के लिए, 2पीढ़ी merozoites के संग्रह के लिए एक अलग समय था: 109 घंटे में ई. नेकेट्रिक्स, और 112 घंटे के बाद टीका पर ई टेनेला। ई. नेकेट्रिक्सके ट्रांसफेक्शन के लिए, मेरोज़ोइट्स इष्टतम विकल्प हैं क्योंकि दूसरे मेरोज़ोइट्स को शुद्ध करना आसान है।
- ई. नेकाट्रिक्स की दूसरी पीढ़ी के मेरोजोइट्स का संग्रह
- चिकन आंत को देशीयरूप से काट लें, जर्दी डंठल (छोटी आंत के मध्य) से इलियोसेकल छिद्र तक, और इसे पीबीएस या एचबीएस (हांक का संतुलित नमक समाधान) के साथ धीरे-धीरे पेट्री डिश में तीन बार धोएं।
- आंत को 0.5 सेमी x 0.5 सेमी टुकड़ों में काट लें और पाचन बफर(टेबल 1)के साथ शंकुत्मक फ्लास्क में रखें। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर मैग्नेटिक मिक्सर पर रखें, जिसमें मेरोजोइट्स को रिलीज करने के लिए 30-60 मिन के लिए एक सरगर्मी बार हो। ऊष्मायन के 30 मिन के बाद, हर 5 मिन में सूक्ष्म परीक्षा द्वारा मेरोजोइट्स की रिहाई की निगरानी करें।
- फिल्ट्रेशन और सेंट्रलाइज़ेशन द्वारा मेरोजोइट्स को शुद्ध करें।
- धुंध14की चार परतों का उपयोग करके पचाने वाले मेरोजोइट्स वाले निलंबन को फ़िल्टर करें, और 10 मिन के लिए 600 x ग्राम पर अपकेंद्री।
- केंद्रीकरण के बाद, आंत के मलबे वाले अधिनेत को त्याग दें। शुद्ध मेरोजोइट्स के साथ वर्षा को 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
- पीबीएस के 1 एमएल के साथ वर्षा को फिर से निलंबित करें और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके मेरोजोइट्स की गणना करें।
3. मेरोजोइट्स या स्पोरोज़ोइट्स का नाभिक
- परजीवी के नाभिक से पहले तैयारी
- एक ट्यूब में करीब 107 मेरोजोइट या स्पोरोज़ोइट ्स तैयार करें। अगर मेरोजोइट्स का ट्रांसफेक्शन करें तो 3-4 ट्यूब तैयार करें।
- प्लाज्मिड डीएनए या शुद्ध पीसीआर टुकड़ा की मात्रा तैयार करें जो 10 μg से अधिक या बराबर है।
नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल प्लाज्मिड में 2 जीन होते हैं: बढ़ी हुई येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EYFP) और डाइहाइड्रोफोलेट रिक्ड्यूलेट थाइमिडलेट सिंथाज टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी (TgDHFR-टीएस)15से प्राप्त होता है । - प्रतिबंध एंजाइम के 25 यू तैयार करें। यदि प्लाज्मिडको को रैखिक किया जाता है, तो प्रतिबंध एंजाइम ट्रांसफेक्शन दक्षता में सुधार कर सकता है। यदि प्लाज्मिड गोलाकार हैं, तो प्रतिबंध एंजाइम को छोड़ दें।
- नाभिक बफर के 85 माइक्रोन तैयार करें: न्यूक्लियोफेक्शन बफर I के 20 माइक्रोन और न्यूक्लियोफेक्शन बफर II के 1 मिलील का मिश्रण करें, और समाधान के एक हिस्से का उपयोग करें। कुल बफर की मात्रा 100 माइक्रोन है।
- नाभिक
- 10 मिन के लिए 600 x ग्राम पर स्पोरोज़ोइट या मेरोजोइट निलंबन को सेंट्रलाइज करें। इसके बाद अधिवक्रमक को त्याग दें।
- निम्नलिखित क्रम में, परमाणु ट्रांसफेक्शन बफर के 85 माइक्रोन, प्लाज्मिड (पीसीआर टुकड़ा) के 10 μg, और प्रतिबंध एंजाइम के 25 यू (आमतौर पर 5 μL) 1.5 mL ट्यूब में स्पॉरोज़ोइट्स या मेरोज़ोइट्स युक्त जोड़ें।
- निलंबन को न्यूक्लियर ट्रांसफेक्शन कप में ट्रांसफर करें । कप को न्यूक्लियर ट्रांसफर ग्रूम में डाल दें ।
- पावर बटन का उपयोग करके न्यूक्लियोफेक्शन डिवाइस चालू करें और ट्रांसफेक्शन प्रक्रिया यू-033का चयन करें। अगर न्यूक्लीफेक्शन डिवाइस फ्री प्रोग्राम चॉइस मोड में शुरू होता है तो एक्स बटन दबाकर इस मोड से बाहर निकलें।
- जब कार्यक्रम खत्म हो जाता है, तो न्यूक्लियोफेक्शन डिवाइस का एक्स बटन दबाएं, और स्क्रीन को ठीकप्रदर्शित करना चाहिए, यह दर्शाता है कि नाभिक सफल है।
- प्रतिक्रिया को रोकने और धीरे-धीरे मिश्रण करने के बाद निलंबन को 1.5 मिलील ट्यूब पर स्थानांतरित करने के लिए न्यूक्लीफेक्शन कप में डुल्बेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम)8 का 0.5-1 मिलील जोड़ें।
4. क्लोकल टीका या नसों में इंजेक्शन
- न्यूक्लियोसंक्रमित परजीवी को 7 दिन पुरानी मुर्गियों में टीका लगाएं। क्लाकल मार्ग के माध्यम से ई. नेकेट्रिक्स या ई टेनेला के स्पोरोज़ोइट्स को टीका लगाएं, लेकिन नसों में इंजेक्शन के माध्यम से ई. एससेरवुलिना स्पोरोज़ोइट्स को टीका लगाएं। प्रत्येक चिकन में लगभग 2 x 107 मिलियन स्पूरोज़ोइट्स का टीका लगाया जाता है, और प्रत्येक पक्षी के लिए मेरोज़ोइट्स 107 को इनोल्यूएट करें।
5. प्रचार और FACS छंटाई
- ट्रांससंक्रमित स्पोरोज़ोइट्स के साथ टीका के 5-9 दिनों के बाद मल से ओसिस्ट ले लीजिए। ट्रांससंक्रमित मेरोजोइट्स के साथ इनोकुलिंग के बाद तीसरे दिन ओसिस्ट ले लीजिए।
- ट्रांसजेनिक जनसंख्या अनुपात को क्रमिक रूप से बढ़ाने के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (एफएसीएस) और 150 मिलीग्राम/किलो पायरिमेथेमाइन8 का उपयोग करें।
नोट: इसे सीधे फ़ीड में जोड़कर पाइरिमेथमिन का उपयोग करें। अधिक सुविधाजनक उपयोग के लिए, पानी में घुलनशील पाइरिमेथामाइन तैयार करें। 0.2 mL पीएफ एच2एसओ4 और एन-मिथाइल पाइरोलिडोन (एनएमपी) के 9.8 मिलील में 1 ग्राम पाइरिमेथमीन को भंग करें, और फिर पक्षियों के लिए पीने के पानी के 1 एल में इस स्टॉक समाधान का 1.5 मिलील जोड़ें।
6. वैकल्पिक कॉलम शुद्धि
नोट: यदि अधिक शुद्ध स्पोरोज़ोइट्स या मेरोज़ोइट्स की आवश्यकता है, तो एक वैकल्पिक विधि है जो उन्हें आहार के माध्यम से शुद्ध करती है- 52 सेल्यूलोज (डीई-52 सेल्यूलोज) कॉलम।
- डीई-52 सेल्यूलोज कॉलम कम से कम एक दिन पहले तैयार करें।
- ग्लाइसिन एल्यूंट बफर(टेबल 1)तैयार करें। ग्लाइसिन एल्यूंट बफर के पीएच को 7.6 से 8.0 तक समायोजित करें और 41 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म करें।
- कॉलम में 2.5 ग्राम डीई-52 सेल्यूलोज जोड़ें। पानी डालकर रात भर भिगो दें। अधिस्थान त्यागें।
- पानी डालकर 1 घंटे के लिए भिगो दें।
- 0.1 एम NaOH जोड़ें और कम से कम 2 घंटे के लिए भिगोएं। इस कदम को दोहराएं।
- अधिस्थान को पानी से बदलें। सेल्यूलोज पूरी तरह से नीचे (लगभग आधे घंटे) तक सुलझेगी के बाद, इस कदम को दोहराएं।
- अधिरत्न को त्यागें, 0.1 एम एचसीएल जोड़ें, और कम से कम 2 घंटे के लिए भिगोएं। इस कदम को दोहराएं।
- अधिनेता को त्यागें, और ग्लाइसिन एल्यूंट बफर के साथ सेल्यूलोज को दो बार भिगो दें।
- 0.1 एम एचसीएल या 0.1 एम नाओएच जोड़कर पीएच को 7.6 से 8.0 तक मापें और समायोजित करें।
नोट: इस भाग में, तरल में डीई-52 सेल्यूलोज की तुलना में कम से कम 5x अधिक मात्रा होती है।
- प्रवाह दर को 40-50 आर/मिन के बीच समायोजित करें।
- जब सेल्यूलोज की तलछट पूरी हो जाती है, तो क्रोमेटोग्राफिक कॉलम में स्पोरोज़ोइट या मेरोजोइट निलंबन जोड़ें। प्रवाह दर को 30-40 आर/मिन में समायोजित करें।
नोट: क्रोमेटोग्राफिक कॉलम जोड़ने से पहले ग्लाइसिन एल्यूंट बफर के साथ स्पोरोज़ोइट या मेरोजोइट वर्षा को फिर से निलंबित करें। - 50 मीटर ट्यूबों में ग्लाइसिन एल्यूंट बफर के साथ लीजिए। एल्यूशन प्रक्रिया के दौरान स्पोरोज़ोइट्स या मेरोजोइट्स की सूक्ष्म परीक्षा के परिणामों के अनुसार संग्रह को रोकें।
- 10 00 x के लिए 600 x ग्राम पर एकत्र ग्लाइसिन एल्यूंट बफर को सेंट्रलाइज करें। स्पोरोज़ोइट या मेरोजोइट वर्षा को नए 1.5 मिलीग्राम ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
- हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके स्पोरोज़ोइट्स या मेरोजोइट्स की गणना करें।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग ईमेरियन परजीवी को स्थानांतरित करने के लिए किया गया है। इस अध्ययन में, ई नेकेट्रिक्स के 2पीढ़ी के मेरोन्ट्स और मेरोज़ोइट्स को फिगर 2ए और फिगर 2बीमें दिखाया गया था, जबकि फिगर 2सी और फिगर 2डी ने घनत्व ग्रेडिएंट सॉल्यूशंस का उपयोग करने के बाद ई टेनेला के स्पोरोसिस्ट और स्पोरोज़ोइट्स को दिखाया। मेरोजोइट्स या स्पोरोज़ोइट्स को न्यूक्लियोटेक्टिंग करने के बाद ई नेकेट्रिक्स(फिगर 3ए)और ई टेनेला (फिगर 3बी)के ओसिस्ट भी दिखाए गए। स्पॉरोज़ोइट्स को न्यूक्लियोइट करने के बाद पहली पीढ़ी के ओसिस्ट की ट्रांसफेक्शन दक्षता सामान्य रूप से लगभग 3-10% है। हालांकि, मेरोज़ोइट्स को न्यूक्लियोइट करने के बाद, दूसरी पीढ़ी के ओसिस्ट की ट्रांसफेक्शन दक्षता केवल कुछ हजारवें (पहली पीढ़ी के ओसिस्ट की ट्रांसफेक्शन दक्षता की गणना नहीं की जा सकती है)।
चित्र 1: स्पोरोज़ोइट्स की शुद्धि। (क)घनत्व ढाल समाधान के साथ घनत्व-ढाल केंद्रीकरण के माध्यम से स्पोरोज़ोइट्स को शुद्ध करें । (ख)डीई-52-सेल्यूलोज कॉलम के माध्यम से स्पोरोज़ोइट्स को शुद्ध करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: ई टेनेलाके स्पोरोस्टिस और स्पोरोज़ोइट्स के साथ ई नेकेट्रिक्स की 2 पीढ़ी के मेरोन्ट्स और मेरोज़ोइट्स। (क) ई. नेकेट्रिक्सकी परिपक्व 2पीढ़ी के मेरोन्ट्स । (ख) ई. नेकेट्रिक्सकी 2पीढ़ी के मेरोजोइट्स का विमोचन किया गया । (ग)शुद्धिकरण के बाद ई टेनेला के स्पोरोसिस्ट। (D)शुद्धिकरण के बाद स्पोरोज़ोइट्स ई तेनेला। स्केल बार 10 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: न्यूक्लियोसंक्रमित मेरोजोइट्स या स्पोरोज़ोइट्स से संक्रमित होने के बाद प्राप्त किए गए ओसिस्ट। (A)न्यूक्लियोसंक्रमित मेरोजोइट्स से संक्रमित होने के बाद ई. नेकेट्रिक्स का ओसिस्ट। (ख)न्यूक्लियोसंक्रमित स्पोरोज़ोइट्स से संक्रमित होने के बाद ई टेनेला का ओसिस्ट। स्केल बार 10 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| बफ़र | संरचना |
| पाचन बफर | 0.25 ग्राम ट्राइप्सिन, 0.5 ग्राम सोडियम टैरोडोऑक्सीकोलेट हाइड्रेट, 100 मिलीलीटर पीबीएस या एचबीएस |
| 0.1 एम नाओएच | 2 ग्राम नाओएच, 500 मिलीलीटर पानी |
| 0.1 एम एचसीएल | 4.3 मिलीलीटर केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड, 500 मिलीलीटर पानी |
| ग्लाइसिन एल्यूंट बफर | 0.75 ग्राम ग्लाइसिन, 7.9 ग्राम नैल, 500 मिलीलीटर पानी |
| एक्ससिस्टेशन बफर | 0.75% ट्रिप्सिन, 10% चिकन पित्त, पीबीएस |
| 1 × डीजी ढाल स्टॉक समाधान (Percoll) | 90% 1 × डीजी ग्रेडिएंट स्टॉक सॉल्यूशन (Percoll), 10% PBS (10 X) |
| न्यूक्लियोफेक्शन बफर I | एटीपी-डिसोडियम 2 ग्राम, एमजीसीएल2-6H2O 1.2 ग्राम, 10 मिलीलीटर पानी |
| न्यूक्लियोफेक्शन बफर II | KH2पीओ4 6 ग्राम, नाहको3 0.6 ग्राम, ग्लूकोज 0.2 ग्राम, 500 मिलीलीटर पानी |
| * पानी: आसुत पानी | |
तालिका 1: बफ़र्स की संरचना।
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Discussion
1 99 0 के दशक में, एपीकॉम्प्लेक्सन परजीवी के लिए एक ट्रांसफेक्शन सिस्टम विकसित किया गया था, और इसका उपयोग ईमेरियन परजीवी पर अध्ययन के लिए किया गया था। हाल ही में, ई. टेनेला8,9 और ई. निशुल्जी15में स्थिर ट्रांसफेक्शन आयोजित किया गया था । हमने दूसरी पीढ़ी के मेरोजोइट्स11को स्थानांतरित करके ई. नेकेट्रिक्स के स्थिर ट्रांसफेक्शन को हासिल किया। विंग नस के माध्यम से ई. एसरवुलिना के ट्रांस्रेड स्पोरोज़ोइट्स के टीका ने ई. एसरवुलिना के स्पोरोज़ोइट्स की अक्षमता को हल किया ताकि क्लोकल मार्ग (झांग एट अल, अप्रकाशित डेटा) के माध्यम से टीका लगाया जा सके। यहां, हमने शोधकर्ताओं को न्यूक्लियोफेक्ट ईमेरियन परजीवी की मदद करने के लिए एक विस्तृत ट्रांसफेक्शन प्रक्रिया का वर्णन किया।
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ई. मैग्ना16 और ई. आंतों17के वीवो स्थिर ट्रांसफेक्शन में खरगोशों के आंतों के लुमेन में ट्रांससंक्रमित स्पोरोज़ोइट्स को इंजेक्ट करना संभव था। हमारे अनुभव के अनुसार, ओसिस्ट के बजाय FACS द्वारा स्पोरोसिस्ट सॉर्टिंग करते समय उच्च दक्षता थी। जीन गन सिस्टम का उपयोग करके ई. मैक्सिमा के अनस्पोर्हाल वाले ओसिस्ट के ट्रांसफेक्शन या ईजीएफपी-हैम-ओटू आरएनए18,19के साथ स्पोरेटेड ओसिस्ट के सफल इलेक्ट्रोपोशन के बारे में भी रिपोर्टें थीं। इस प्रकार, हमारे भविष्य के अध्ययन ईमेरिया परजीवी में ट्रांसफेक्शन प्रक्रियाओं को सरल बनाने के लिए ओसिस्ट या स्पोरोसिस्ट के ट्रांसफेक्शन का पता लगाते हैं।
eimerian परजीवी में ट्रांसफेक्शन सफलता आनुवंशिक रूप से संशोधित Eimeria को टीके वाहनों के रूप में इस्तेमाल करने के लिए इस तरह के सी जेजुनी13से CjaA के रूप में विषमलोगोस एंटीजन, ले जाने के लिए सक्षम हो सकता है । हालांकि Eimeria में ट्रांसफेक्शन दक्षता में काफी सुधार किया गया है, जीन संपादन प्रौद्योगिकी eimerian परजीवी में सीमाएं जारी है । Eimeriaमें ट्रांसफेक्शन के विकास के साथ, CRISPR/Eimeria में CAS9 प्रौद्योगिकी (हू एट अल., अप्रकाशित डेटा) Eimeriaके आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए नेतृत्व कर सकता है ।
निष्कर्ष में, यह प्रोटोकॉल चिकन Eimeriaमें नाभिक के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करता है । इमेरियामें जीन समारोह के अध्ययन के लिए स्पोरोज़ोइट्स या मेरोजोइट्स का ट्रांसफेक्शन मूल्यवान है ।
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Disclosures
कोई नहीं.
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2017YFD0501200) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31572507, 31772728 और 31873007) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
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