Summary
Здесь мы предоставили метод для достижения стабильной трансфекции куриных паразитов Эймерии нуклеэктингом спорозоитов или мерозоитов второго поколения. Генетически модифицированные эймерийские паразиты, выражающие гетерологические антигенные гены, могут быть использованы в качестве средств доставки вакцин.
Abstract
Трансфекция является техническим процессом, с помощью которого генетический материал, такой как ДНК и двухцепочечная РНК, поставляются в клетки для изменения гена, представляющего интерес. В настоящее время трансгенная технология становится незаменимым инструментом для изучения Эймерии,возбудительов кокцидиоза у птицы и скота. Этот протокол содержит подробное описание стабильной трансфекции у эймерских паразитов: очищение и нуклеофеирование спорозоитов или мерозоитов второго поколения, а также виво-распространение транс-инфицированных паразитов. Используя этот протокол, мы достигли трансфекции в нескольких видах Эймерии. В совокупности нуклеофикция является полезным инструментом для облегчения генетических манипуляций с эймерскими паразитами.
Introduction
Eimeria spp. вызывает кокцидиоз, что приводит к значительным экономическим потерям в животноводстве и птицеводстве. Хотя антикоккидные препараты, и в определенной степени, ослабленные антикокцидиальные вакцины, были широко использованы для контроля кокцидиоза, Есть еще недостатки в отношении их лекарственной устойчивости, остатков наркотиков, а также потенциальное распространение вакцин штаммов, которые восстанавливают вирулентность1. С развитием молекулярной биологии, трансфекция стала жизненно важным инструментом для изучения функций генов, разработки новых вакцин, а также скрининга новых целей наркотиков для Эймерии.
В последние десятилетия, трансфекция была успешно применена для апикомплексных паразитов, таких как Plasmodium и Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Исследование с использованием З-гал в качестве репортера для трансфекции в E. tenella пилотировал такую работу в Эймерии7. Трансфекция E. tenella8,9, E. mitis10, и E. acervulina (Чжан и др., неопубликованные данные) была успешной в кур. Недавно мы достигли трансфекции с использованием мерозоитов E. necatrix через нуклеофэкцию11.
Исследования показали, что Eimeria, выражающая гетерологический антиген, имеет потенциал для разработки в качестве рекомбинантной вакцины, например, тех, кто выражает Campylobacter jejuni antigen A (CjaA) или куриный интерлейкин 2 (chIL-2)12,13. Таким образом, этот протокол описывает нуклеофэкционное исследование Eimeria spp. у кур. Процедура описывает очищение спорозоитов или мерозоитов, нуклеофекцию с плазмидной ДНК, клоакальной прививки/внутривенную инъекцию и распространение виво, чтобы помочь исследователям начать исследования трансгенных паразитов Эймерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Куры для всех экспериментов на животных были размещены и поддерживается в соответствии с Китайским сельскохозяйственным университетом институционального ухода за животными и использования Комитета руководящих принципов и следуют Международным руководящим принципам для биомедицинских исследований с участием животных. Эксперименты были одобрены Пекинским административным комитетом лабораторных животных.
1. Извлечение и очистка спорозоитов Эймерии spp. (например, E. tenella)
- Выпуск споцисты
- Centrifuge 1 x 107sporulated яйцеклетки в растворе дихромата калия (2.5%, m/v) на 2300 x g для 5 min. Вымойте их с PBS (решением буфера фосфата) 3 времени.
- Отдохните гранулы с 1 мл PBS и перенесите на трубку 15 мл. Добавьте равный объем стеклянных бусин (диапазон диаметром 1 мм х 1 мм) и осциллизмсируйте суспензию с помощью вихревого смесителя для выпуска споскистов.
- Мониторинг выпуска споцистыстов с помощью микроскопии каждую минуту. Остановить вихрь, когда более 90% яйцеклеток сломаны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство яйцеклеток (таких как E. tenella, E. necatrix, и E. acervulina) были сломаны после 1 мин с помощью вихря смеситель. - Перенесите суспензию на новые трубы мощностью 1,5 мл и центрифугу при 1600 х г в течение 5 мин.
- Приостановите осадку 1 мл 50% градиентного раствора плотности, смешайте в трубке 1,5 мл и центрифугу на 10 000 х г в течение 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для состава градиента плотности, обратитесь к таблице 1. Градиент плотности представляет собой коллоидную среду на основе кремнезема, состоящую из коллоидных частиц кремнезема диаметром 15-30 нм (23% ву/ч в воде), которые были покрыты поливинилпирролидоном (PVP).
- Выпуск спорозоитов
- Приостановите осадок с буфером excystation(Таблица 1) и инкубировать в водяной бане 42 градусов по Цельсию в течение 40-60 минут, чтобы освободить sporozoites. Прекратите инкубировать, когда высвобождается более 90% спорозоитов. Затем центрифуга при 600 х г в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните трубки один раз в 5 минут во время эксцстанции. - Приостановите осадки 1 мл градиентного раствора 55% плотности и центрифугу при 10 000 х г в течение 1 мин.
- Приостановите осадки с 1 мл PBS и рассчитывать sporozoites с помощью гемоситометра.
- Приостановите осадок с буфером excystation(Таблица 1) и инкубировать в водяной бане 42 градусов по Цельсию в течение 40-60 минут, чтобы освободить sporozoites. Прекратите инкубировать, когда высвобождается более 90% спорозоитов. Затем центрифуга при 600 х г в течение 10 мин.
2. Сбор и очистка мерозоитов E. necatrix
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте Арбор Акко (AA) бройлеры в возрасте 7-14 d в эксперименте. Кочцидия-бесплатные куры (n'3) были привиты с 2 х 105 ооцисты e. necatrix. На 109 h после инфекции, птицы были принесены в жертву вывихшей шейки матки. Кишечник был удален для сбора мерозоитов2-го поколения. Для различных видов Эймерии, было другое время для сбора2-го поколения мерозоитов: E. necatrix на 109 ч, и E. tenella на 112 ч после прививки. Для трансфекции E. necatrix,merozoites являются оптимальным выбором, как второй мерозоиты легко очистить.
- Коллекция мерозоитов второго поколения E. necatrix
- Вырезать куриный кишечник продольно, от желтка стебля (середина тонкой кишки) в илеоцекальной норифика, и мыть его с PBS или HBSS (Хэнк сбалансированное решение соли) мягко три раза в чашке Петри.
- Нарежьте кишечник на 0,5 см х 0,5 см и поместите его в коническую колбу с буфером пищеварения(таблица 1). Поместите колбу на магнитный миксер при 37 градусах Цельсия с перемешиванием бар в течение 30-60 минут, чтобы освободить merozoites. После 30 минут инкубации, контролировать высвобождение merozoites микроскопическим обследованием каждые 5 минут.
- Очистите мерозоиты путем фильтрации и центрифугации.
- Фильтр подвески, содержащие переваренные merozoites с помощью четырех слоев марли14, и центрифуга на 600 х г в течение 10 мин.
- После центрифугации отбросьте супернатант, содержащий кишечный мусор. Перенос осадков с очищенными мерозоитами в трубы 1,5 мл.
- Приостановите осадки с 1 мл PBS и рассчитывать merozoites с помощью гемоситометра.
3. Нуклеофизкиция мерозоитов или спорозоитов
- Препарат перед нуклеофецией паразитов
- Приготовьте около 107 мерозоитов или спорозоитов в одной трубке. При трансфектии мерозоитов подготовьте 3-4 трубки.
- Подготовьте количество плазмидной ДНК или очищенного фрагмента ПЦР, которое больше или равно 10 мкг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида, используемая в этом исследовании, содержит 2 гена: улучшенный желтый флуоресцентный белок (EYFP) и дигидрофолат редуктаза тимидилат анаазы, полученные из Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15. - Приготовьте 25 U фермента ограничения. Если плазмиды линейно, фермент ограничения может повысить эффективность трансфекции. Если плазмиды круглые, опустите фермент ограничения.
- Подготовьте 85 йл буфера нуклеотекции: смешайте 20 злну нуклеофеционного буфера I и 1 мл нуклеофеционного буфера II и используйте часть раствора. Объем общего буфера составляет 100 л.
- Нуклеофекция
- Центрифуга спорозоит или мерозоит подвески на 600 х г в течение 10 мин. Затем отбросьте супернатант.
- В следующем порядке добавьте 85 мл ядерного трансфекционного буфера, 10 мкг плазмида (фрагмент ПЦР) и 25 У фермента ограничения (обычно 5 л) в трубку 1,5 мл, содержащую спорозоиты или мерозоиты.
- Перенесите подвеску на ядерную трансфекционную чашку. Положите чашку в ядерный паз передачи.
- Включите нуклеофективное устройство с помощью кнопки питания и выберите процедуру трансфекции U-033. Если нуклеофективное устройство запускается в режиме Free Program Choice, выйдите из этого режима, нажав кнопку X.
- Когда программа заканчивается, нажмите кнопку X нуклеофекционного устройства, и экран должен отображать OK, указывая, что нуклеофекта является успешным.
- Добавьте 0,5-1 мл модифицированного орела Dulbecco Medium (DMEM)8 в чашку нуклеофеции, чтобы остановить реакцию и перенести подвеску на трубку 1,5 мл после мягкого смешивания.
4. Клоаковая прививка или внутривенная инъекция
- Привить нуклеоинфицированных паразитов в 7-дневных кур. Прививать мерозоиты E. necatrix или sporozoites E. tenella через клоакальный маршрут, но прививать E. acervulina sporozoites через внутривенные инъекции. Прививать около 2 х 107 миллионов sporozoites в каждой курицы, и инколуат merozoites 107 для каждой птицы.
5. Распространение и сортировка FACS
- Собирайте яйцеклетки из кала 5-9 дней после прививки с трансинфицированными спозоитами. Сбор яйцеклеток на третий день после прививки с трансинфицированных мерозоитов.
- Используйте флуоресцентную сортировку клеток (FACS) и 150 мг/кг пириметамина8, чтобы последовательно увеличить соотношение трансгенной популяции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пириметамин, добавляя его непосредственно в канал. Для более удобного использования приготовьте водорастворимый пириметамин. Растворите 1 г пириметамина в 0,2 мл pf H2SO4 и 9,8 мл N-метилпиролидона (NMP), а затем добавьте 1,5 мл этого бульонного раствора в 1 л питьевой воды для птиц.
6. Необязательная очистка столбца
ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимы более чистые порозоиты или мерозоиты, существует факультативный метод, который очищает их через колонку целлюлозы диэтиламиноэтил-52 (DE-52 целлюлозы).
- Подготовьте колонку cellulose DE-52 по крайней мере за один день.
- Подготовка глицин eluent буфера(Таблица 1). Отрегулируйте рН глицина eluent буфера от 7,6 до 8,0 и предварительно нагревается до 41 градусов по Цельсию.
- Добавьте в колонку 2,5 г целлюлозы DE-52. Добавить воду и замочить на ночь. Отбросьте супернатант.
- Добавить воду и замочить на 1 ч. Отбросьте супернатант.
- Добавить 0,1 М НаОХ и замочить, по крайней мере 2 часа. Повторите этот шаг.
- Замените супернатант водой. После того, как целлюлоза полностью оседает на дно (около получаса), повторите этот шаг.
- Откажитесь от супернатанта, добавьте 0,1 М HCl и замочите не менее 2 часов. Повторите этот шаг.
- Откажитесь от супернатанта и замочите целлюлозу дважды с глицином eluent буфера.
- Измерьте и отрегулируйте pH от 7.6 до 8.0 путем добавлять 0.1 M HCl или 0.1 M NaOH.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части, жидкость имеет по крайней мере 5x больше объема, чем у DE-52 целлюлозы.
- Отрегулируйте скорость потока между 40-50 r/min.
- Когда осадки целлюлозы завершена, добавить спорозоит или мерозоит суспензии в хроматографической колонке. Отрегулируйте скорость потока до 30-40 р/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрежьте спорозоит или мерозоит осадков с глицином eluent буфера перед добавлением хроматографической колонки. - Соберите с глицином eluent буфера в 50 мл труб. Остановить сбор в соответствии с результатами микроскопического исследования спорозоитов или мерозоитов в процессе elution.
- Centrifuge глицин eluent буфер собраны на 600 х г в течение 10 мин. Передача спорозоита или мерозоита осадков в новые трубы 1,5 мл.
- Подсчитайте спорозоиты или мерозоиты с помощью гемоситометра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол был использован для трансфектирующих эймерских паразитов. В этом исследовании,2-го поколения меронты и merozoites E. necatrix были показаны на рисунке 2A и Рисунок 2B, в то время как рисунок 2C и Рисунок 2 D показал sporocysts и sporozoites E. tenella после использования градиентных решений плотности. Также были показаны яйцеклетки E. necatrix (рисунок 3A)и E. tenella (рисунок 3B) после нуклеофектингирования мерозоитов или спорозоитов. Эффективность трансфекции яйцеклеток первого поколения после нуклеоэктинга сорозоитов составляет около 3-10%, в целом. Однако после нуклеофекции мерозоитов эффективность трансфекции ооцизтов второго поколения составляет всего несколько тысячных (эффективность трансфекции яйцеклеток первого поколения не могла быть рассчитана).
Рисунок 1: Очистка спорозоитов. (A)Очистка спорозоитов через плотность градиента центрифугирования с плотностью градиентных решений. (B) Очистка спорозоиты через DE-52-целлюлозы колонки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Меронты2-го поколения и мерозоиты E. necatrix вместе с порисистами и спорозоитами E. tenella. (A) Зрелые меронты2-го поколения E. necatrix. (B) Выпущенные2-го поколения мерозоитов E. necatrix. (C) Sporocysts E. tenella после очищения. (D) Sporozoites E. tenella после очищения. Панель масштаба составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Ооцисты, полученные после заражения нуклеоинфицированными мерозоитами или спорозоитами. ()Ооцисты E. necatrix после заражения нуклеоинфицированных мерозоитов. (B) Оосы E. tenella после заражения нуклеоинфицированных спорозоитов. Панель масштаба составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Буфера | Состав |
| Буфер пищеварения | 0,25 г трипсина, 0,5 г гидрата натрия тауродеоксихолат, 100 мл PBS или HBSS |
| 0.1 M NaOH | 2 г NaOH, 500 мл воды |
| 0,1 M HCl | 4,3 мл концентрированной соляной кислоты, 500 мл воды |
| Глицин eluent буфер | 0,75 г глицина, 7,9 г NaCl, 500 мл воды |
| Буфер Excystation | 0,75% трипсин, 10% куриная желчь, PBS |
| 1 - градиентное решение для акций DG (Percoll) | 90% 1 - градиентный акционерный раствор DG (Percoll), 10% PBS (10 X) |
| Нуклеофекционный буфер I | АТФ-динай 2 г, MgCl2-6H2O 1,2 г, 10 мл воды |
| Нуклеофизация буфера II | KH2PO4 6 г, NaHCO3 0,6 г, глюкоза 0,2 г, 500 мл воды |
| Вода: дистиллированная вода | |
Таблица 1: Состав буферов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В 1990-х годах была разработана трансфекционная система для паразитов-апикомплексных, и она использовалась для исследований эймерских паразитов. Недавно, стабильная трансфекция была проведена в E. tenella8,9 и E. nieschulzi15. Мы достигли стабильной трансфекции E. necatrix путем трансфектации мерозоитов второго поколения11. Прививка трансфицированных спорозоитов E. acervulina через вену крыла разрешила неспособность спорозоитов E. acervulina быть привитым через cloacal трассу (Чжан и др., неопубликованные данные). Здесь мы описали подробную процедуру трансфекции, чтобы помочь исследователям нуклеофекта эймерских паразитов.
Предыдущие исследования показали, что было возможно вводить трансинфицированных спорозоитов в просвет кишечника кроликов в лапаротомии для in vivo стабильной трансфекции E. magna16 и E. intestinalis17. По нашему опыту, была более высокая эффективность при сортировке sporocysts по FACS вместо ооцизтов. Были также сообщения о трансфекции непоспорлиных яйцеклеток E. maxima с использованием генной системы пушки или успешной электропорации спорных яйцеклеток с eGFP-Ham-OTU RNA18,19. Таким образом, наши будущие исследования исследуют трансфекцию яйцеклеток или споцистыдлядов для упрощения процедур трансфекции у паразитов Эймерии.
Успех трансфекции в eimerian паразитов может позволить генетически модифицированных Eimeria, которые будут использоваться в качестве вакцины транспортных средств для перевозки гетерологических антигенов, таких как CjaA от C. jejuni13. Хотя эффективность трансфекции в Эймерии была значительно улучшена, технология редактирования генов по-прежнему имеет ограничения в эймерских паразитов. С развитием трансфекции в Эймерии,технология CRISPR/CAS9 в Эймерии (Hu et al., неопубликованные данные) может привести к генетическим манипуляциям Эймерии.
В заключение, этот протокол предусматривает подробную процедуру нуклеофекции в куриной Эймерии. Трансфекция спорозоитов или мерозоитов ценна для изучения генной функции в эймерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальной программой исследований и разработок Китая (2017YFD0501200) и Национальным фондом естественных наук Китая (31572507, 31772728 и 31873007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, Office for official publications of the European communities. Luxembourg. 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
