Summary
Här gav vi en metod för att uppnå stabil transfection av kyckling Eimeria parasiter genom nucleofecting sporozoiter eller andra generationens merozoiter. Genetiskt modifierade eimerianparasiter som uttrycker heterologa antigena gener kan användas som vaccinleveransfordon.
Abstract
Transfection är en teknisk process genom vilken genetiskt material, såsom DNA och dubbelsträngade RNA, levereras till celler för att ändra genen av intresse. För närvarande är transgen teknik blir ett oumbärligt verktyg för studier av Eimeria, orsaksmedel coccidiosis i fjäderfä och boskap. Detta protokoll ger en detaljerad beskrivning av stabil transfection i eimerian parasiter: rening och nukleofection av sporozoiter eller andra generationens merozoiter, och in vivo förökning av transfected parasiter. Med hjälp av detta protokoll uppnådde vi transfection i flera arter av Eimeria. Tillsammans är nukleofection ett användbart verktyg för att underlätta genetisk manipulation hos eimerianparasiter.
Introduction
Eimeria spp. orsakar coccidiosis, vilket leder till betydande ekonomiska förluster inom boskaps- och fjäderfäindustrin. Även om antikoccidial läkemedel, och i viss mån, försvagade antikkockvacciner, har använts i stor utsträckning för kontroll av koccidios, det finns fortfarande brister när det gäller deras läkemedelsresistens, läkemedelsrester, och den potentiella spridningen av vaccin stammar som återfår virulens1. Med utvecklingen av molekylärbiologi har transfection blivit ett viktigt verktyg för att studera genfunktioner, utveckla nya vacciner och screening nya läkemedelsmål för Eimeria.
Under de senaste decennierna har transfection tillämpats framgångsrikt för apicomplexan parasiter som Plasmodium och Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. En studie med β-gal som reporter för transfection i E. tenella lotsas sådant arbete i Eimeria7. Transfection en E. tenella8,9, E. mitis10, och E. acervulina (Zhang et al., opublicerade data) var framgångsrik i kycklingar. Nyligen uppnådde vi transfection med hjälp av merozoiter av E. necatrix genom nukleofection11.
Studier visade att Eimeria uttrycker ett heterologous antigen har potential att utvecklas som ett rekombinant vaccin, såsom de som uttrycker Campylobacter jejuni antigen A (CjaA) eller kyckling interleukin 2 (chIL-2)12,13. Därför beskriver detta protokoll en nukleofection studie av Eimeria spp. i kycklingar. Förfarandet beskriver rening av sporozoiter eller merozoiter, nukleofection med plasmid DNA, cloacal inokulering/intravenös injektion och in vivo förökning för att hjälpa forskare att starta studier om transgena Eimeria parasiter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kycklingar för alla djurförsök var inrymt och underhålls enligt China Agricultural University Institutional Animal Care and Use Committee riktlinjer och följde de internationella vägledande principerna för biomedicinsk forskning som involverar djur. Experimenten godkändes av Pekingadministrationens kommitté av försöksdjur.
1. Extraktion och rening av sporozoiter av Eimeria spp. (t.ex. E. tenella)
- Utsläpp av sporocyster
- Centrifug 1 x 107sporulated oocysts i kalium dichromate lösning (2,5%, m/v) vid 2.300 x g för 5 min. Tvätta dem med PBS (fosfat buffertlösning) tre gånger.
- Resuspend pellets med 1 ml PBS och överför till ett 15 ml-rör. Tillsätt en lika stor volym av glaspärlor (1 mm x 1 mm diameterintervall) och sväng oocystsuspensionen med en virvelmixer för att frigöra sporocysterna.
- Övervaka frisättningen av sporocyster genom mikroskopi varje minut. Sluta virvla när mer än 90% av oocysts bryts.
OBS: De flesta av oocysts (såsom E. tenella, E. necatrix, och E. acervulina) bröts efter 1 min med hjälp av virvelmixer. - Överför sporocystsuspensionen till nya 1,5 ml-rör och centrifuger vid 1 600 x g i 5 min.
- Resuspend fällningen med 1 ml av 50% densitetgradientlösning, kombinera i ett 1,5 ml-rör och centrifugera vid 10 000 x g i 1 min.
OBS: För densitetsgradientsammansättningen, se tabell 1. Densitetsgradienten är ett kiselbaserat kolloidalt medium som består av kolloidala kiseldioxidpartiklar med diameter nm diameter på 15-30 nm (23 % w/w i vatten), som har belagts med polyvinylpyrrolion (PVP).
- Utsläpp av sporozoiter
- Resuspend fällningen med excystation buffert(tabell 1) och inkubera i en 42 ° C vattenbad för 40-60 min för att frigöra sporozoiterna. Sluta ruva när mer än 90% av sporozoiter släpps. Sedan centrifugera vid 600 x g i 10 min.
OBS: Skaka rören en gång var 5:e minut under utcystation. - Resuspend nederbörden med 1 ml av 55% densitet gradientlösning och centrifug era på 10.000 x g för 1 min.
- Resuspend nederbörden med 1 ml PBS och räkna sporozoiterna med hjälp av en hemocytometer.
- Resuspend fällningen med excystation buffert(tabell 1) och inkubera i en 42 ° C vattenbad för 40-60 min för att frigöra sporozoiterna. Sluta ruva när mer än 90% av sporozoiter släpps. Sedan centrifugera vid 600 x g i 10 min.
2. Insamling och rening av merozoiter av E. necatrix
OBS: Använd Arbor Acre (AA) slaktkycklingar i åldern 7-14 d i experimentet. Coccidia-fria kycklingar (n =3) var inokuleras med 2 x 105 oocysts av E. necatrix. Vid 109 h efter infektion, fåglarna offrades av livmoderhalscancer störning. Tarmen togs bort för insamling av2: a generationenmerozoiter. För olika Eimeria arter, det fanns en annan tid för insamling av2: a generationenmerozoiter: E. necatrix på 109 h, och E. tenella vid 112 h post-inokulering. För transfection av E. necatrix, merozoiter är det optimala valet eftersom den andra merozoiter är lätta att rena.
- Samling av andra generationens merozoiter av E. necatrix
- Skär kycklingtarmen längsgående, från äggula stjälk (mitten av tunntarmen) till ileocecal öppning, och tvätta den med PBS eller HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) försiktigt tre gånger i en Petri maträtt.
- Skär tarmen i 0,5 cm x 0,5 cm bitar och placera den i en konisk kolv med en matsmältningsbuffert(tabell 1). Placera kolven på en magnetisk mixer vid 37 °C med en omrörningsstång i 30-60 min för att frigöra merozoiter. Efter 30 minuters inkubation, övervaka utsläpp av merozoiter genom mikroskopisk undersökning var 5 min.
- Rena merozoiterna genom filtrering och centrifugering.
- Filtrera suspensionen som innehåller smälta merozoiter med fyra lager gasväv14och centrifugera vid 600 x g i 10 min.
- Efter centrifugering, kasta supernatant innehållande tarm skräp. Överför nederbörden med renade merozoiter till 1,5 ml-rör.
- Resuspend nederbörden med 1 ml PBS och räkna merozoiterna med hjälp av en hemocytometer.
3. Nukleofection av merozoiter eller sporozoiter
- Förberedelse före nukleofection av parasiter
- Förbered ca 107 merozoiter eller sporozoiter i ett rör. Om transfecting merozoiter, förbereda 3-4 rör.
- Förbered en mängd plasmid DNA eller renat PCR-fragment som är större än eller lika med 10 μg.
OBS: Den plasmid som används i denna studie innehåller 2 gener: förbättrat gult fluorescerande protein (EYFP) och dihydrofolate reduktas timduktas som härrör från Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15. - Förbered 25 U av begränsningenzym. Om plasmider är linjäriserade, kan begränsningsenzymet förbättra transfection effektiviteten. Om plasmiderna är cirkulära utelämnar du begränsningsenzymet.
- Förbered 85 μl nukleofektionsbuffert: blanda 20 μl nukleofektionsbuffert I och 1 ml nukleofetionsbuffert II och använd en del av lösningen. Volymen av den totala bufferten är 100 μL.
- Nukleofection
- Centrifugera sporozoiten eller merozoitsuspensionen vid 600 x g i 10 min. Släng sedan supernatanten.
- I följande ordning, tillsätt 85 μl kärn- transfectionbuffert, 10 μg plasmid (PCR fragment) och 25 U av begränsningenzym (vanligt 5 μL) in i 1.5 mL röret som innehåller sporozoites eller merozoites.
- Överför avstängningen till en kärnvapentransfection cup. Sätt koppen i ett kärnvapentransferspår.
- Slå på nukleofetionsenheten med hjälp av strömbrytaren och välj transfectionproceduren U-033. Om nukleofetionsenheten startar i läget Gratis programval avslutar du det här läget genom att trycka på X-knappen.
- När programmet är klart trycker du på X-knappen på nukleofetionsenheten och skärmen ska visas OK,vilket indikerar att nukleofektionen lyckas.
- Lägg 0,5-1 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)8 till nukleofection kopp för att stoppa reaktionen och överföra suspensionen till 1,5 ml röret efter blandning försiktigt.
4. Cloacal inokulering eller intravenös injektion
- Vaccinera de nukleininfekterade parasiterna i 7-dagsgamla kycklingar. Inokulera merozoiterna av E. necatrix eller sporozoiterna av E. tenella via den cloacal rutten, men inokulera E. acervulina sporozoiter via intravenös injektion. Inokulera ca 2 x 107 miljoner sporozoiter i varje kyckling, och incoluate merozoiter 107 för varje fågel.
5. Förökning och FACS sortering
- Samla oocysts från avföring 5-9 dagar efter inokulering med transfected sporozoiter. Samla oocysts på den tredje dagen efter inokulera med transfected merozoiter.
- Använd fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och 150 mg/kg pyrimehamin8 för att successivt öka det transgena populationsförhållandet.
OBS: Använd pyrimehamin genom att lägga till den direkt i matningen. För bekvämare användning, förbereda vattenlösliga pyrimehamin. Lös upp 1 g pyrimehamin i 0,2 ml pf H2SO4 och 9,8 ml N-metylpyrrolidon (NMP), och tillsätt sedan 1,5 ml av denna lagerlösning i 1 L dricksvatten för fåglar.
6. Valfri kolumnrening
OBS: Om mer rena sporozoiter eller merozoiter behövs, det finns en valfri metod som renar dem genom en diethylaminoethyl-52 cellulosa (DE-52 cellulosa) kolumn.
- Förbered CELLulosakolonnen DE-52 minst en dag i förväg.
- Förbered glycineluentbuffert (tabell 1). Justera pH-värdet för glycineluentbuffert från 7,6 till 8,0 och förvärmt till 41 °C.
- Lägg till 2,5 g DE-52 cellulosa i kolumnen. Tillsätt vatten och blöta över natten. Kasta supernatanten.
- Tillsätt vatten och blöt lägg till 1 h. Kasta supernatanten.
- Lägg till 0,1 M NaOH och blötlägg i minst 2 timmar. Upprepa det här steget.
- Byt ut supernatanten med vatten. När cellulosan helt lägger sig till botten (ungefär en halvtimme), upprepa detta steg.
- Kasta supernatanten, tillsätt 0,1 M HCl och blötlägg i minst 2 timmar. Upprepa det här steget.
- Kassera supernatanten och blötlägg cellulosan två gånger med glycinebuffert.
- Mät och justera pH från 7,6 till 8,0 genom att lägga till 0,1 M HCl eller 0,1 M NaOH.
OBS: I denna del har vätskan minst 5x mer volym än de-52 cellulosa.
- Justera flödeshastigheten mellan 40-50 r/min.
- När sedimenteringen av cellulosa är klar, tillsätt sporozoiteller merozoitfjädring till den kromatografiska kolonnen. Justera flödeshastigheten till 30-40 r/min.
OBS: Resuspend den sporozoit eller merozoite nederbörd med glycin eluent buffert innan du lägger till den kromatografiska kolumnen. - Samla in med glycin eluent buffert i 50 ml rör. Stoppa samlingen enligt resultaten av den mikroskopiska undersökningen av sporozoiter eller merozoiter under elutionprocessen.
- Centrifugera glycinebufferten som samlats in vid 600 x g i 10 min. Överför sporozoiten eller merozoitnederbörden till nya 1,5 ml-rör.
- Räkna sporozoiterna eller merozoiterna med hjälp av en hemocytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll har använts för att transfect eimerian parasiter. I denna studie, den2: a generationenmeronts och merozoiter av E. necatrix visades i figur 2A och figur 2B, medan figur 2C och figur 2D visade sporocyster och sporozoiter av E. tenella efter att ha använt densitetgradientlösningar. Oocysts av E. necatrix (Figur 3A) och E. tenella (figur 3B)efter nucleofecting merozoiterna eller sporozoiterna visades också. Transfection effektiviteten i första generationens oocysts efter nukleofecting sporozoiterna är ca 3-10%, i allmänhet. Men efter nukleofecting merozoiterna, transfection effektivitet andra generationens oocysts är bara några tusendelar (Transfection effektivitet första generationens oocysts kunde inte beräknas).
Figur 1: Rening av sporozoiter. (A)Rena sporozoiter genom densitetsgradientcentrifugering med densitetgradientlösningar. (B)Rena sporozoiter genom DE-52-cellulosakolonnen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Den2: a generationenmeronts och merozoiter av E. necatrix tillsammans med sporocyster och sporozoiter av E. tenella. (A) Mogna2: a generationens meronts av E. necatrix. (B)Den släppta2: a generationens merozoiter av E. necatrix. (C)Sporocysts av E. tenella efter rening. (D)Sporozoites E. tenella efter rening. Skalstången är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Oocysts erhålls efter att ha infekterat med nukleoinfekterade merozoiter eller sporozoiter. (A)Oocysts av E. necatrix efter att ha infekterat med nukleofected merozoiter. (B)Oocysts av E. tenella efter att ha infekterat med nukleofected sporozoiter. Skalstången är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffert | Sammansättning |
| Matsmältningsbuffert | 0,25 g trypsin, 0,5 g natriumtaurodeoxycholate hydrat, 100 ml PBS eller HBSS |
| 0,1 M NaOH | 2 g NaOH, 500 ml vatten |
| 0,1 M KHö | 4,3 ml koncentrerad saltsyra, 500 ml vatten |
| Glycin eluent buffert | 0,75 g glycin, 7,9 g NaCl, 500 ml vatten |
| Buffert för excystation | 0,75% trypsin, 10% kyckling galla, PBS |
| 1 × GD Lutning lagerlösning (Percoll) | 90% 1 × GD Lutning lagerlösning (Percoll), 10% PBS (10 X) |
| Nukleofektionsbuffert I | ATP-disnatrium 2 g, MgCl2-6H2O 1,2 g, 10 ml vatten |
| Nukleofection buffert II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glukos 0,2 g, 500 ml vatten |
| *vatten: destillerat vatten | |
Tabell 1: Buffertars sammansättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På 1990-talet utvecklades ett transfectionsystem för apicomplexanparasiter, och det användes för studier på eimerianparasiter. Nyligen genomfördes stabil transfection i E. tenella8,9 och E. nieschulzi15. Vi uppnådde den stabila transfection av E. necatrix genom att transfecting andra generationens merozoiter11. Inokulering av transfected sporozoiter av E. acervulina genom vingvenen löste oförmåga sporozoiter av E. acervulina att inokuleras via cloacal rutten (Zhang et al., opublicerade data). Här beskrev vi ett detaljerat transfection-förfarande för att hjälpa forskare nukleofect eimerian parasiter.
Tidigare studier visade att det var möjligt att injicera transfected sporozoiter i tarmlumen av kaniner i en laparotomy för in vivo stabil transfection av E. magna16 och E. intestinalis17. Enligt vår erfarenhet fanns det högre effektivitet vid sortering av sporocysts av FACS istället för oocysts. Det fanns också rapporter om transfection av unsporulated oocysts av E. maxima med hjälp av en gen pistol system eller framgångsrik elektroporation av sporulated oocysts med eGFP-Ham-OTU RNA18,19. Således utforskar våra framtida studier transfection av oocysts eller sporocysts för att förenkla transfection förfaranden i Eimeria parasiter.
Transfection framgång i eimerian parasiter kan möjliggöra genetiskt modifierade Eimeria att användas som vaccin fordon för att bära heterologantigener, såsom CjaA från C. jejuni13. Även om transfection effektivitet i Eimeria har förbättrats avsevärt, genredigeringsteknik fortsätter att ha begränsningar i eimerian parasiter. Med utvecklingen av transfection i Eimeria, CRISPR/CAS9 teknik i Eimeria (Hu et al., opublicerade data) kan leda till genetisk manipulation av Eimeria.
Sammanfattningsvis innehåller detta protokoll ett detaljerat förfarande för nukleofektion i kyckling Eimeria. Transfection av sporozoiter eller merozoiter är värdefullt för studier av genfunktion i Eimeria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Key Research and Development Program of China (2017YFD0501200) och National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 och 31873007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, Office for official publications of the European communities. Luxembourg. 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
