Summary
Hier wird eine effiziente und kostengünstige Methode zur Reinigung, Kultur und Unterscheidung von Stammzellen aus weißer Materie von postnatalen Maus-Kleinhirnen demonstriert.
Abstract
Die meisten kleinhirnförmigen Neuronen entstehen aus zwei embryonalen Stammnischen: einer rhombischen Lippennische, die alle zwieslösenden erregenden glutamatergen Neuronen erzeugt, und einer ventrikulären Zonennische, die die hemmenden GABAerge Purkinje-Zellen erzeugt, die Neuronen sind, die die tiefen kleinhirnigen Kerne und Bergman-Glia bilden. Kürzlich wurde eine dritte Stammzellnische beschrieben, die als sekundäre Keimzone aus der ventrikulären Zonennische entsteht. Die Zellen dieser Nische werden durch den Zelloberflächenmarker Prominin-1 definiert und sind auf die sich entwickelnde weiße Materie des postnatalen Kleinhirns lokalisiert. Diese Nische ist für die spätgeborene molekulare Schicht GABAerge interneurons zusammen mit postnatal erzeugten Kleinhirn-Astrozyten. Neben ihrer Entwicklungsrolle gewinnt diese Nische hinsichtlich ihrer Beteiligung an Neurodegeneration und Tumorgenese an translationaler Bedeutung. Die Biologie dieser Zellen war aufgrund des Mangels an effizienten Techniken für ihre Reinigung schwer zu entziffern. Hier werden effiziente Methoden zur Reinigung, Kultur und Differenzierung dieser postnatalen Kleinhirnstammzellen demonstriert.
Introduction
Das Kleinhirn ist seit langem als ein wichtiger neuronaler Schaltkreis anerkannt, der die freiwillige Bewegung1koordiniert. Es erhält Input aus den weiten Schwaden der Neuroaxis, die propriozeptive Informationen aus der Peripherie enthält, um die Motorleistung zu optimieren und die Bewegung zu koordinieren. In jüngerer Zeit wurde es auch in die Regulierung von Kognition und Emotionen durch potenziell die Verwendung ähnlicher Informationsverarbeitungsnetzwerke2,3,4.
Das erwachsene Kleinhirn besteht aus einem äußeren Kleinhirnkortex und einer inneren weißen Materie. Zwischen diesen Strukturen sind tief intracerebellare Kerne. Ähnlich wie beim Rest des Nervensystems wird die Entwicklung des Kleinhirns durch die Proliferation multipotenter Vorläuferzellen (Stammzellen) angetrieben, die migrieren und differenzieren, um diese gut organisierte Struktur zu ergeben. In der frühen Entwicklung (E10.5–E13.5) erzeugt eine ventrikuläre Stammnische um den sich entwickelnden vierten Ventrikel GABAerge Neuronen (d.h. Purkinje-Zellen, Lugaro-Zellen, Golgi-Zellen) zusammen mit Bergmann glia5,6,7,8.
Später in der Entwicklung (postnatale Woche eins) erzeugt eine zweite Stammzellnische in der rhomben Lippe MATH1- und Nestin-exezigraphische Vorläufer, die zu erregenden Granulatneuronen9,10,11,12führen. Kürzlich wurde eine dritte Stammzellnische beschrieben13. Diese Zellen exprimieren Prominin-1 (auch bekannt als CD133), ein membranübergreifendes Glykoprotein, das eine Teilmenge von Stammzellen im Darm und hämatopoetischen Systemen14,15,16definiert. Die In-vivo-Schicksalskartierung zeigt, dass diese Stammzellen in den ersten drei postnatalen Wochen wichtige molekulare Schicht-Interneuronen (d. h. Korbzellen und stellate Zellen) zusammen mit Astrozyten erzeugen. In der Vergangenheit war es schwierig, diese Zellen in vitro zu untersuchen, da frühere Methoden kostspielige und zeitaufwändige Techniken (d. h. fluoreszaktivierte Zellsortierung [FACS]) erforderten, die von Prominin-1-Färbung12,13,17abhängig sind. Dieses Protokoll beschreibt eine immunmagnetische Methode zur Isolierung dieser Stammzellen, die dann leicht kultiviert und differenziert werden kann.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011) durchgeführt und von der Northwestern University IACUC (Protokoll IS00011368) genehmigt.
1. Vorbereitung von Lösungen
- Bereiten Sie gewebedissoziationslösung aus sterilem Phenol rot haltigen Dulbecco Phosphat-gepufferten Saline (DPBS) mit Papain (100 U/ml), Cystein (0,2 mg/ml) und DNase (250 U/ml) vor.
- Zur Herstellung der DNase-Lösung 100 mg des lyophilisierten Pulvers von DNase I (eine Flasche) in 50 mlH2O verdünnen und die Stammlösung filtern. Bereiten Sie 10 ml Lager aliquots vor. Teilen Sie ein Stockrohr in 0,5 ml Einweg-Aliquots auf. Bewahren Sie diese Einweg-Aliquots bei -80 °C auf.
- Bereiten Sie magnetische Trennreagenzien vor, indem Sie magnetischen Säulenpuffer X: 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA-Lösung vorbereiten.
- Zur Vorbereitung von Neurosphärenmedien verwenden Sie neurobasales Medium, das Penicillin/Streptomycin mit L-Glutamin enthält, und ergänzen Sie es mit 2% B27, 20 ng/ml humanem rekombinanten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 20 ng/ml humanem rekombinantem Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF).
- Zur Vorbereitung von Differenzierungsmedien verwenden Sie neurobasales Medium und ergänzen Sie mit 10 ng/ml differenzierten Faktor Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF-AA) oder 10 ng/mL Leukämie-Hemmfaktor (LIF) und 2% B27.
- Verwenden Sie ultra-niedrige Befestigung 12 gut (3,5 cm2) und 6 gut (9,6 cm2) Kulturplatten.
2. Zerlegung von Zerebellum
- Anästhetisieren Sie Mauswelpen (P3-P7) mit Isofluran und enthaupten Sie mit chirurgischer Schere.
- Sprühen Sie den abgetrennten Kopf der Welpen mit 70% Ethanol.
- Übertragen Sie jeden Kopf in eine leere sterile 10 cm Kulturschale. Trennen Sie die Haut mit der Mikrodissektionschere, dann entfernen Sie den Schädel, indem Sie die Schere sagittal entlang der Mittellinie laufen.
- Mit #7 Zange, schälen Sie die Schädelknochen beginnend kauarisch aus dem Hirnstamm. Heben Sie das Gehirn vorsichtig mit einem Spachtel an, halten Sie das Kleinhirn intakt und übertragen Sie das Gehirn auf eine frische sterile 10,0 cm-Schale, die 15 ml eiskalte Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) enthält.
- Legen Sie die Schale mit dem Gehirn unter ein Seziermikroskop. Mit feinen #5 Zangen, entfernen Sie die Hirnhirne und große Blutgefäße aus dem Kleinhirn und trennen Sie das Kleinhirn vom Hirnstamm mit dem Spachtel.
- Das Kleinhirn in ein 15 ml Zentrifugenrohr mit 5,0 ml eiskalter HBSS-Lösung geben. Waschen Sie das Kleinhirn durch Spülen und Dekantieren 3x mit 5,0 ml HBSS.
HINWEIS: Jedes Kleinhirn sollte zur Weiterverarbeitung in ein eigenes Rohr gelegt werden.
3. Vorbereitung der Zellsuspension
- Nach der letzten Spülung 5 ml papainbasierte Gewebedissoziationslösung (basierend auf früheren Arbeiten13,18) hinzufügen, die auf 37 °C vorgewärmt wurde. Inkubieren Sie das Gewebe 15 min bei 37 °C in einem Wasserbad. Mischen Sie den Inhalt langsam, indem Sie das Rohr 3x–5x alle 3 Minuten entweder mit einem Nutating-Mixer oder von Hand nach oben und unten drehen.
- Bereiten Sie einen breiten Durchmesser (normale Glaspipette) und schmalen Durchmesser Pasteur Pipette (feuerpoliert durch Erhitzen über einem Bunsenbrenner) wie zuvor beschrieben19.
- Waschen Sie das Gewebe 3x mit 5 ml HBSS-Lösung, um den Verlust des Gewebes zu vermeiden, während Sie von Hand dekantieren.
- Entfernen Sie die letzte HBSS-Waschanlage und fügen Sie dem Gewebe 5 ml DPBS-Lösung mit 250 L DNase-Lösung hinzu. Dissoziieren Sie das Gewebe durch Trituieren 10x–15x mit der Pasteur Pipette mit breitem Durchmesser. Führen Sie diesen Schritt vorsichtig aus, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.
- Dann die Gülle für weitere 10 min bei 37 °C im Wasserbad inkubieren, durch Invertieren und Richten des Rohres mischen.
- Verwenden Sie die pasteur-Pipette mit reduziertem Durchmesser, um die Gewebeschlämme 10x weiter zu trituieren. Wenn große Gewebestücke übrig bleiben, drücken Sie die Gewebestücke mit der Spitze der Pipette vorsichtig gegen den Boden des Rohres und leiten Sie das Pipettieren fort, bis die Zellen eine feine Suspension erreichen.
- Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 °C für weitere 10 min, wobei die vorherigen Mischschritte wiederholt werden.
4. Immunolabeling von Stammzellen
- Legen Sie die Zentrifugenrohre auf Eis und verwenden Sie eiskalte Lösungen für die nächsten Schritte. Die dissoziierten Zellen durch ein 40-m-Zellsieb in ein 50 ml Zentrifugenrohr abseihen. Obere den Filter mit 10,0 ml HBSS-Lösung, um sicherzustellen, dass Zellen in dieser zusätzlichen Lösung durch das Netz geleitet werden.
- Übertragen Sie die gefilterten Zellen in ein frisches 15 ml Zentrifugenrohr und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand vollständig, indem Sie einen Vakuumsauger sorgfältig verwenden.
- Setzen Sie das Pellet in 160 l magnetischen Säulenpuffer aus. Um die einzellige Suspension vor der magnetischen Beschriftung zu erhalten, passieren Sie Zellen durch ein 30 m großes Nylongewebe, um Zellklumpen zu entfernen, die andernfalls die Säule verstopfen können.
- Fügen Sie 40 L Anti-Prominin-1-Mikroperlen zu jeder 15 ml-Röhre hinzu, mischen und in einem Kühlschrank für 15 min brüten, damit der Antikörper an Prominin-1-exemittende Zellen bindet.
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie 1,0–2,0 ml Säulenpuffer X und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min hinzufügen.
- Setzen Sie das Pellet in 1,0 ml Dessäulenpuffers X wieder aus.
HINWEIS: Wenn nach der Resuspension des Pellets mit 1,0 ml Säulenpuffer X kleine Klumpen gesehen werden, sollten sie sorgfältig mit einer Spitze der Pasteur-Pipette entfernt werden, da sonst diese Klumpen die Magnetsäule während der Zellsortierung blockieren können.
5. Magnetsäulenvorbereitung, Zellsortierung und Beschichtung
HINWEIS: Die magnetische Trennung von verschiedenen Genotyp-Bedingungen (Krankheit vs. Kontrolle) muss gleichzeitig durchgeführt werden, da jede Verzögerung die Neurosphärenmorphologie beeinflussen kann.
- Bereiten Sie die Magnetsäulen vor, indem Sie sie auf dem magnetischen Ständer platzieren, der dem Magnetfeld ausgesetzt ist. Spülen Sie die Säule einmal mit 500 l Puffer X, indem Sie Puffer auftragen, der in ein zentrifugendes Rohr tropft, das verworfen werden soll.
HINWEIS: Vorbereiten des frischen magnetischen Säulenpuffers X für jedes Experiment; wenn nicht, dann wird die Stammzellausbeute niedrig sein. - Tragen Sie die beschriftete Zellsuspension auf die Spalte auf. Sammeln Sie den Durchfluss, der nicht beschriftete Zellen enthält, die hauptsächlich aus kleinhirn-neuronalen/glialen Mischzellen bestehen, in frische 15 ml-Röhren(Abbildung 1A).
- Waschen Sie die Säule 3x mit 500 l Puffer X (jede Wäsche dauert etwa 2–4 min).
HINWEIS: Die mit Kleinhirn-Granulat-Neuronen angereicherte kleinhirnförmige neuronale/gliaale Mischkultur kann als nützliches Nebenprodukt dieses Reinigungsschritts dienen. - Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld und legen Sie sie in ein 1,5 ml-Rohr. Fügen Sie 1,0 ml Kulturmedium (Neurosphärenmedium) in die Säule ein und schieben Sie den Kolben in die Säule, um die mit Prominin-1-Perlen markierten Zellen in ein frisches 1,5 ml Falkenrohr zu spülen.
- Um die Reinheit von Prominin-1-markierten Zellen zu verbessern, übergeben Sie die eluierten Zellen über eine zweite Spalte nach den Schritten 5.1–5.4.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Die typische Ausbeute beträgt 107 Zellen pro Kleinhirn. Die Zellen auf ultraniedrige Befestigungsplatten (6 oder 12 gut, basierend auf der dichte, die für nachgeschaltete Experimente erforderlich ist) zu verdichten.
6. Passierung von Neurosphären und Differenzierung
- Die Prominin-1-markierten Stammzellen auf ultraniedrigem Aufsatz 12 Brunnenplatten im Neurosphärenmedium (5.000 Zellen/Well) verplatten.
- Nach 7-10 Tagen teilen sich die Zellen, um kugelförmige schwimmende Neurosphären (primäre Neurosphären) zu ergeben.
HINWEIS: In diesem Experiment werden sekundäre Neurosphären erzeugt, die sich in Zahlen ausdehnen, für die weitere Verwendung. Primäre Neurosphärenpopulationen werden für diese Experimente nicht verwendet, da sie kontaminierende Zellen enthalten können, die keine Stammzelleigenschaften haben und sich mit Neurosphären verklumpen können. - Übertragen Sie für die Passaging die primären Neurosphären zusammen mit den Kulturmedien mit 1,0 ml Pipettenspitzen auf ein 15 ml steriles Zentrifugenrohr. Pellet die Neurosphären durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min und entsorgen Sie den Überstand.
- Setzen Sie das Pellet in 5 ml Gewebedissoziationsmedien, die Papain oder 0,05% Trypsinlösung enthält, aus. Bei 37 °C für 10 min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min. Setzen Sie die Zellen in 5 ml Neurosphärenmedium aus und dissoziieren Sie die Zellen mechanisch mit einer Kunststoff-Pasteur-Pipette und leiten sie 10x langsam auf und ab.
- Plate die Zellen (wieder) in Neurosphärenmedien, wie zuvor beschrieben. Nach 7-10 Tagen in der Kultur sollte die Platte mit sekundären Neurosphären angereichert werden.
HINWEIS: Diese Kulturen können bis zu 8x mit guter Effizienz durchzogen werden, nach denen Neurosphärengröße tendenziell kleiner und auf eine Abnahme der Proliferation hindeutet. - Zählen Sie die Zellen auf dem Hämozytometer und verschichten Sie die optimale Anzahl für zukünftige Experimente an Poly-D-Lysin-beschichteten Platten (6 oder 12 Brunnen).
- Um die Stammzellen zu unterscheiden, sammeln Sie Neurosphären aus dem zweiten bis achten Durchgang durch Zentrifugation, wie zuvor beschrieben, außer Differenzierungsmedium zum Pellet hinzuzufügen.
HINWEIS: Nach 7 Tagen in vitro differenzieren sich die Stammzellen in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten, wie die Färbung mit dem neuronalen Marker -III Tubulin, dem astrozytischen Marker GFAP und dem Oligodendrozytenhersteller O4 zeigt.
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Representative Results
Prominin-1-positive postnatale Kleinhirnstammzellen bildeten Neurosphären in Neurosphärenmedium reich an Wachstumsfaktoren (EGF und bFGF). Diese Neurosphären waren positiv für Prominin-1-Färbung, der Marker für die Isolierung verwendet, und auch als Fleck für andere Stammzellmarker wie Nestin und GFAP13 (Abbildung 1). Der Stammzellmarker-Ausdruck wurde kultur- und für mindestens acht Passagen20beibehalten. Nach Abzug von Wachstumsfaktoren und in Gegenwart von LIF und PDGF-AA (die Faktoren sind, die neuronale und gliale Differenzierung unterstützen21,22), unterschieden sich die Neurosphären in neuronale und gliale Linien (Abbildung 2).
Abbildung 1: Isolierung von Prominin-1-Stammzellen aus postnatalen Kleinhirn. (A) Kleinhirnstammzellen wurden mit immunmagnetischen Prominin-1-Perlen isoliert. Oberes Panel: Gereinigte Stammzellen (säulengebunden) bildeten Neurosphären mit umfangreichen Proliferations- und Selbsterneuerungseigenschaften. Die Zellen, die nicht an die Spalte gebunden sind (Flowthrough), konnten keine Neurosphären bilden. Stattdessen wurden sie zu kleinhirnförmigen neuronalen/gliaalen Mischzellen (-III Tubulin/GFAP). Untere Platte: die Neurosphären, die aus Prominin-1+ Zellen gebildet werden, die Stammzell-spezifische Marker exdrücken: Nestin, Prominin-1 und GFAP. (B) Zellen im Durchfluss gefärbt negativ für Stammzellmarker Prominin-1 und Nestin und positiv für neuronalen Marker -III Tubulin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Differenzierung von Prominin-1-positiven Neurosphären. In Gegenwart von Differenzierungsfaktoren (PDGF-AA oder LIF) unterschieden sich Prominin-1-positive Neurosphären in Neuronen (-III Tubulin), Astrozyten (GFAP) und Oligodendrozyten (O4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Prominin-1-exättige Kleinhirnstammzellen befinden sich in den ersten 3 Wochen des postnatalen Lebens in der prospektiven weißen Materie. Ihre Proliferation wird durch den schallenden Igelweg, der von Purkinje-Zellen unterstützt wird, streng kontrolliert17. Diese Stammzellen/Vorläufer tragen zu später geborenen GABAergen Interneuronen bei, die Korbzellen und stellate Zellen genannt werden. Diese Interneuronen befinden sich in der molekularen Schicht, wo sie auf Purkinje-Zellen synapisieren und PC-Topographie und Funktion über GABAerge Hemmung13,17,23formen. Neben der Bildung von Interneuronen erzeugt diese Stammzellpopulation auch alle postnatal abgeleiteten Kleinhirnastrozyten17,24.
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Methode zur Reinigung von Prominin-1/CD133-Stammzellen aus dem postnatalen Maus-Kleinhirn. Stammzellen müssen in ultraniedrigen Befestigungsplatten kultiviert werden. Das Kultivieren dieser Stammzellen in normale Platten kann dazu führen, dass sich die Neurosphären an der Oberfläche anheften und zu einer geringen Stammzellproliferation und Differenzierung führen. Hier entspricht die Ausbeute von 200–300 Neurosphären pro 5.000 Zellen einer Stammzellausbeute von etwa 1 x 107 Zellen aus einem einzelnen Kleinhirn. Dies ist vergleichbar mit dem, was für eine FACS-basierte Strategie beschrieben wurde, die 10-x teurer ist. Darüber hinaus erfordert FACS-Ausrüstung eine teure Einrichtung und gut ausgebildetes Personal und ist nicht ohne weiteres verfügbar.
Diese Stammzellen gewinnen auch zunehmend an translationaler Bedeutung in der Krebsforschung sowie neuroentwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen25,26,27. Die unkontrollierte Proliferation dieser Stammzellen im frühen Leben führt zu Medulloblastom28, während Untersuchungen aus unserem eigenen Labor darauf hindeuten, dass ihre abnormale Proliferation und Differenzierung zu einer späteren Hirnfalldegeneration in der genetischen Krankheit Spinokerebellar Ataxie Typ 120beitragen kann. Diese neuen Protokolle werden für die Untersuchung dieser Zellen wertvoll sein und neue Einblicke in ihre Rolle bei Gesundheit und Krankheit geben. Diese Methoden können auch zu Fortschritten in regenerativen Therapien nach Schlaganfall oder Trauma und anderen Beleidigungen des Gehirns führen, die Neuroregeneration rechtfertigen würden. Es ist denkbar, dass diese Techniken verallgemeinert werden können, um Prominin-1-exprimierende Stammzellen aus anderen Geweben wie Darm und Knochenmark zu extrahieren, wo sie auch15,29ausgedrückt werden.
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Disclosures
Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern des Opal-Labors für ihre Vorschläge. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien 1RO1 NS062051 und 1RO1NS08251 (Opal P) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2 mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Culture plates ultra - low attachment | Corning | 3473 | |
| Cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/mL |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/mL |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/mL) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/mL |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 μm |
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