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Neuroscience

प्रसवोत्तर माउस सेरिबैलम से प्रोमिनिन-1+ स्टेम सेल का शुद्धिकरण

Published: April 12, 2020 doi: 10.3791/60554
Automatic Translation
1, 1,2
1Davee Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine Chicago, 2Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University Feinberg School of Medicine Chicago

Summary

यहां प्रदर्शित प्रसवोत्तर माउस सेरिबैलम से सफेद पदार्थ स्टेम कोशिकाओं को शुद्ध करने, संस्कृति और अंतर करने के लिए एक कुशल और लागत प्रभावी तरीका है।

Abstract

अधिकांश सेरिबैलर न्यूरॉन्स दो भ्रूणीय स्टेम निकस से उत्पन्न होते हैं: एक रॉम्बिक लिप आला, जो सभी सेरिबेलर उत्तेजक ग्लूटाम्बिक न्यूरॉन्स, और एक वेंट्रिकुलर जोन आला उत्पन्न करता है, जो निरोधात्मक गैबार्गिक पुरकिंजे कोशिकाओं को उत्पन्न करता है, जो न्यूरॉन्स हैं जो गहरे सेरिबेलर न्यूक्लिरी और बर्गमैन ग्लिया का गठन करते हैं। हाल ही में, एक तिहाई स्टेम सेल आला का वर्णन किया गया है कि वेंट्रिकुलर क्षेत्र आला से एक माध्यमिक अंकुरित क्षेत्र के रूप में उठता है । इस आला की कोशिकाओं को सेल सतह मार्कर प्रोमिनिन-1 द्वारा परिभाषित किया गया है और प्रसवोत्तर सेरिबैलम के विकासशील सफेद पदार्थ के लिए स्थानीयकृत हैं। यह आला प्रसवोत्तर उत्पन्न सेरिबैलर एस्ट्रोसाइट्स के साथ देर से जन्म लेने वाले आणविक परत गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स के लिए खाता है। उनकी विकासात्मक भूमिका के अलावा, यह आला न्यूरोडिजेनरेशन और ट्यूमरजेनेसिस में इसकी भागीदारी के संबंध में अनुवाद महत्व प्राप्त कर रहा है। इन कोशिकाओं के जीव विज्ञान को समझने के लिए मुश्किल हो गया है क्योंकि उनके शुद्धिकरण के लिए कुशल तकनीकों की कमी है । यहां प्रदर्शित इन प्रसवोत्तर सेरिबैलर स्टेम कोशिकाओं को शुद्ध करने, संस्कृति और अंतर करने के लिए कुशल तरीके हैं।

Introduction

सेरिबैलम को लंबे समय से स्वैच्छिक आंदोलन के समन्वय वाले एक प्रमुख न्यूरोनल सर्किटकेरूप में पहचाना जाता रहा है । यह न्यूरोएक्सिस के व्यापक swathes से इनपुट प्राप्त करता है, जिसमें परिधि से प्रोप्रोसेप्टिव जानकारी शामिल है, ताकि मोटर आउटपुट को ठीक किया जा सके और गति का समन्वय किया जा सके। हाल ही में, इसे संभावित रूप से इसी तरह के सूचना,प्रसंस्करण नेटवर्क2,3,4का उपयोग करके अनुभूति और भावनाओं को विनियमित करने में भी फंसाया गया है।4

वयस्क सेरिबैलम एक बाहरी सेरिबेलर कॉर्टेक्स और आंतरिक सफेद पदार्थ से बना है। इन संरचनाओं के भीतर इंटरस्पर्ड गहरे इंट्रारिबेलर नाभिक हैं। तंत्रिका तंत्र के बाकी हिस्सों के समान, सेरिबैलम का विकास बहुशक्तिशाली जनक कोशिकाओं (स्टेम सेल) के प्रसार से प्रेरित होता है जो इस अच्छी तरह से संगठित संरचना को उपज देने के लिए माइग्रेट और अंतर करते हैं। प्रारंभिक विकास (E10.5-E13.5) में, विकासशील चौथे वेंट्रिकल के चारों ओर एक वेंट्रिकुलर स्टेम आला बर्गमैन ग्लिया5,,6,,7,,8के साथ गैबाएर्गिक न्यूरॉन्स (यानी, पुरकिंजे कोशिकाओं, लुगरो कोशिकाओं, गोल्गी कोशिकाओं) उत्पन्न करता है।

बाद में विकास (प्रसवोत्तर सप्ताह एक) में, रोम्बिक होंठ में एक दूसरा स्टेम सेल आला MATH1 उत्पन्न करता है- और नेटिन-व्यक्त करने वाले जनक जो उत्तेजक कणिका न्यूरॉन्स9,,10,,11,,12को जन्म देते हैं। हाल ही में एक तिहाई स्टेम सेल आला13वर्णित किया गया है । ये कोशिकाएं प्रोमिनिन-1 (जिसे सीडी 133 के नाम से भी जाना जाता है) को व्यक्त करती हैं, एक झिल्ली-फैले ग्लाइकोप्रोटीन जो आंत में स्टेम कोशिकाओं के सबसेट और हेमेटोपोइटिक सिस्टम14,15,,16को परिभाषित करता है। वीवो भाग्य मानचित्रण में पता चलता है कि ये स्टेम सेल पहले तीन प्रसवोत्तर सप्ताहों के दौरान एस्ट्रोसाइट्स के साथ-साथ प्रमुख आणविक परत इंटरन्यूरॉन्स (यानी, टोकरी कोशिकाओं और स्टेलेट कोशिकाओं) उत्पन्न करते हैं। अतीत में, इन कोशिकाओं का अध्ययन करना मुश्किल रहा है क्योंकि पूर्व तरीकों में महंगी और समय लेने वाली तकनीकों (यानी, फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई [FACS]) की आवश्यकता होती है जो प्रोमिनिन-1 धुंधला12,,13,,17पर निर्भर हैं। यह प्रोटोकॉल इन स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक इम्यूनोमैग्नेटिक आधारित विधि का वर्णन करता है जिसे फिर आसानी से सुसंस्कृत और विभेदित किया जा सकता है।

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Protocol

प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग (2011) के लिए एनआईएच के गाइड के अनुपालन में सभी पशु प्रयोग किए गए थे और नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय आईएसएसीयूसी (प्रोटोकॉल IS00011368) द्वारा अनुमोदित किए गए थे।

1. समाधान की तैयारी

  1. बाँझ फिनॉल लाल युक्त Dulbecco के फॉस्फेट-बफरलव (DPBS) के साथ पाकिन (१०० यू/एमएल), साइस्टीन (०.२ मिलीग्राम/एमएल) और DNase (२५० U/ml) से बने ऊतक विसोशन समाधान तैयार करें ।
  2. DNase समाधान तैयार करने के लिए एच2ओ के 50 मिलीग्राम में DNase I (एक बोतल) के लिओफिलेइज्ड पाउडर के 100 मिलीग्राम पतला अच्छी तरह से मिलाएं और स्टॉक समाधान को फ़िल्टर करें। 10 एमएल स्टॉक एलिकोस तैयार करें। एक स्टॉक ट्यूब को 0.5 मिलीएल एकल उपयोग में विभाजित करें। इन एकल उपयोग को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. चुंबकीय कॉलम बफर एक्स: 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 2 एमएम ईटीए समाधान तैयार करके चुंबकीय पृथक्करण अभिकर्मक तैयार करें।
  4. न्यूरोस्फीयर मीडिया तैयार करने के लिए, 2% बी 27, 20 एनजी/एमएल ह्यूमन रिकॉम्बिनेंट एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) और 20 एनजी/एमएल ह्यूमन रिकॉम्बिनेंट बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ) के साथ पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त न्यूरोबेसल मीडियम का इस्तेमाल करें ।
  5. विभेदन मीडिया तैयार करने के लिए 10 एनजी/एमएल विभेदित कारक प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक (पीडीजीएफ-एए) या 10 एनजी/एमएल ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (एलआईएफ) और 2% B27 के साथ न्यूरोबेसल मीडियम और सप्लीमेंट का इस्तेमाल करें ।
  6. अल्ट्रा-कम लगाव 12 अच्छी तरह से (3.5 सेमी2)और 6 अच्छी तरह से (9.6 सेमी2)संस्कृति प्लेटों का उपयोग करें।

2. सेरिबैलम का विच्छेदन

  1. सर्जिकल कैंची का उपयोग करके आइसोफ्लोरीन और डेपुटके के साथ एनेस्थेटाइज़ माउस पिल्ले (पी 3-पी7)।
  2. पिल्ले के अलग सिर को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
  3. प्रत्येक सिर को एक खाली बाँझ 10 सेमी संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें। माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग कर त्वचा को अलग करें, फिर मिडलाइन के साथ कैंची सगितताल चलाकर खोपड़ी को हटा दें।
  4. #7 संदंश का उपयोग करके, ब्रेनस्टेम से काउडली शुरू होने वाली खोपड़ी की हड्डियों को छील दें। ध्यान से एक स्पैटुला का उपयोग कर मस्तिष्क लिफ्ट, सेरिबैलम बरकरार रखते हुए, और एक ताजा बाँझ १०.० सेमी बर्फ के 15 मिलील युक्त पकवान के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण-ठंडा हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान (HBSS) समाधान ।
  5. मस्तिष्क युक्त पकवान को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। ठीक #5 संदंश का उपयोग करके, मेनिंग्स और बड़ी रक्त वाहिकाओं को सेरिबैलम से हटा दें और स्पैटुला का उपयोग करके मस्तिष्क से सेरिबैलम को अलग करें।
  6. सेरिबैलम को 15 मिलील सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें बर्फ-ठंडा एचबीएसएस समाधान का 5.0 मिलीएल हो। एचबीएसएस के 5.0 mL के साथ 3x को धोकर और डिकेंट करके सेरिबैलम धोएं।
    नोट: प्रत्येक सेरिबैलम को आगे की प्रक्रिया के लिए अपनी ट्यूब में रखा जाना चाहिए।

3. सेल निलंबन की तैयारी

  1. पिछले कुल्ला के बाद, पाकिन आधारित ऊतक विच्छेदन समाधान (पिछले काम13,,18के आधार पर) के 5 मिलील जोड़ें जो 37 डिग्री सेल्सियस तक पहले से गर्म हो गया है। पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए ऊतक को इनक्यूबेट करते हैं। धीरे-धीरे ट्यूब को 3x-5x हर 3 x को उलटकर या तो एक न्यूटेड मिक्सर का उपयोग करके या हाथ से सामग्री मिलाएं।
  2. एक व्यापक व्यास (नियमित रूप से ग्लास पिपेट) और संकीर्ण व्यास पाश्चर पिपेट (एक Bunsen बर्नर पर हीटिंग द्वारा आग पॉलिश) के रूप में पहले19वर्णित तैयार करें ।
  3. ऊतक 3x को एचबीएसएस समाधान के 5 mL के साथ धोएं, हाथ से डिकेंट करते समय ऊतक के नुकसान से बचें।
  4. पिछले एचबीएस वॉश को हटा दें और ऊतक के लिए DNase समाधान के 250 माइक्रोन युक्त डीपीबीएस समाधान के 5 mL जोड़ें। व्यापक व्यास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके 10x-15x को ट्रिट करके ऊतक को अलग करें। बुलबुले के गठन से बचने के लिए इस कदम को धीरे से करें।
  5. फिर पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 10 मिन के लिए घोल इनक्यूबेट करें, नली को उलटा करके और सीधा करके मिलाएं।
  6. ऊतक घोल 10x को आगे बढ़ाने के लिए कम व्यास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। यदि ऊतक के बड़े टुकड़े रहते हैं, तो धीरे-धीरे पिपेट की नोक के साथ ट्यूब के नीचे के खिलाफ ऊतक के टुकड़ों को दबाएं और कोशिकाओं के ठीक निलंबन तक पहुंचने तक पाइपिंग जारी रखें।
  7. ऊतक को अतिरिक्त 10 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जो पिछले मिश्रण चरणों को दोहराते हैं।

4. स्टेम सेल की इम्यूनोलेबलिंग

  1. बर्फ पर अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें और अगले चरणों के लिए बर्फ-ठंडे समाधानों का उपयोग करें। एक 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से एक 50 मीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में विसोशिएट कोशिकाओं तनाव। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं इस अतिरिक्त समाधान में जाल से गुजरती हैं, एचबीएसएस समाधान के 10.0 एमएल के साथ फ़िल्टर को ऊपर करें।
  2. फ़िल्टर की गई कोशिकाओं को एक ताजा 15 मिलीग्राम अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए 300 x ग्राम पर सेल निलंबन को केंद्रीकृत करें। एस्पिरेट और ध्यान से एक वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके सुपरनेट को पूरी तरह से त्यागदें।
  3. चुंबकीय स्तंभ बफर के 160 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें। चुंबकीय लेबलिंग से पहले एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए, कोशिका झुरमुट को हटाने के लिए 30 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से कोशिकाओं को पास करें, जो अन्यथा कॉलम को रोकना कर सकते हैं।
  4. प्रत्येक 15 मीटर ट्यूब के लिए एंटी-प्रोमिनिन-1 माइक्रोमोतियों के 40 माइक्रोन जोड़ें, मिश्रण करें, और 15 मीटर के लिए रेफ्रिजरेटर में इनक्यूबेट करें ताकि एंटीबॉडी को प्रोमिनिन-1-व्यक्त कोशिकाओं से बांध सकें।
  5. 10 00 0 0 0 0 के लिए कॉलम बफर एक्स और सेंट्रलाइज x g के 1.0-2.0 mL को जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  6. कॉलम बफर एक्स के 1.0 mL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट: यदि कॉलम बफर एक्स के 1.0 मिलील के साथ पैलेट के पुनर्निलंबन के बाद छोटे झुरमुट देखे जाते हैं, तो उन्हें पाश्चाँचे पाइपेट की नोक का उपयोग करके सावधानीपूर्वक हटा दिया जाना चाहिए, अन्यथा ये झुरमुट सेल छंटाई के दौरान चुंबकीय स्तंभ को अवरुद्ध कर सकते हैं।

5. चुंबकीय कॉलम तैयारी, सेल छंटाई, और चढ़ाना

नोट: विभिन्न जीनोटाइप स्थितियों (रोग बनाम नियंत्रण) से चुंबकीय पृथक्करण एक ही समय में किया जाना चाहिए, क्योंकि किसी भी देरी न्यूरोस्फीयर आकृति विज्ञान को प्रभावित कर सकती है।

  1. चुंबकीय क्षेत्र के संपर्क में आने वाले चुंबकीय स्टैंड पर रखकर चुंबकीय स्तंभों को तैयार करें। बफर एक्स के 500 माइक्रोन के साथ एक बार कॉलम को कुल्ला करके बफर लगाएं जो एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में टपकता है जिसे छोड़ दिया जाएगा।
    नोट: प्रत्येक प्रयोग के लिए ताजा चुंबकीय कॉलम बफर एक्स तैयार करें; यदि नहीं, तो स्टेम सेल उपज कम हो जाएगा।
  2. कॉलम पर लेबल वाले सेल सस्पेंशन लागू करें। अवेलेबल कोशिकाओं वाले प्रवाहों को एकत्र करें जिनमें मुख्य रूप से सेरिबेलर न्यूरोनल/ग्लियल मिश्रित कोशिकाएं ताजा 15 मिलील ट्यूब(चित्रा 1ए)में शामिल हैं ।
  3. कॉलम 3x को बफर एक्स के 500 माइक्रोन के साथ धोएं (प्रत्येक धोने में लगभग 2-4 मिन लगते हैं)।
    नोट: सेरिबैलर दानेदार न्यूरॉन्स से समृद्ध सेरिबेलर न्यूरोनल/ग्लियल मिश्रित संस्कृति इस शुद्धि कदम के उपयोगी प्रतिफल के रूप में काम कर सकती है ।
  4. कॉलम को चुंबकीय क्षेत्र से निकालें और 1.5 मिलील ट्यूब में रखें। कॉलम में संस्कृति माध्यम (न्यूरोस्फीयर मीडियम) के 1.0 मिलील जोड़ें और प्रोमिनिन-1 मोतियों के साथ टैग की गई कोशिकाओं को ताजा 1.5 एमएल फाल्कन ट्यूब में फ्लश करने के लिए कॉलम में प्लंजर को धक्का दें।
  5. प्रोमिनिन-1 लेबल कोशिकाओं की शुद्धता को बढ़ाने के लिए, चरण 5.1-5.4 के बाद एक दूसरे स्तंभ पर eluted कोशिकाओं को पारित करें।
  6. कोशिकाओं को हीमोसाइटोमीटर से गिनें। ठेठ उपज प्रति सेरिबैलम 107 कोशिकाएं हैं। अल्ट्रा-कम अटैचमेंट प्लेटों (6 या 12 अच्छी तरह से, डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए आवश्यक घनत्व के आधार पर) पर कोशिकाओं को प्लेट करें।

6. न्यूरोस्फीयर और भेदभाव की पासिंग

  1. प्लेट प्रोमिनिन-1 लेबल स्टेम सेल अल्ट्रा कम लगाव पर स्टेम सेल 12 अच्छी तरह से न्यूरोस्फीयर माध्यम में प्लेट (५,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से) ।
  2. 7-10 दिनों के बाद, कोशिकाएं गेंद के आकार के फ्लोटिंग न्यूरोस्फीयर (प्राथमिक न्यूरोस्फीयर) को उपज देने के लिए विभाजित होती हैं।
    नोट: इस प्रयोग में, संख्यामें विस्तार करने वाले माध्यमिक न्यूरोस्फीयर आगे के उपयोग के लिए उत्पन्न होते हैं। प्राथमिक न्यूरोस्फीयर आबादी का उपयोग इन प्रयोगों के लिए नहीं किया जाता है, क्योंकि उनमें दूषित कोशिकाएं हो सकती हैं जिनमें स्टेम सेल गुण नहीं होते हैं और न्यूरोस्फीयर के साथ एक साथ झुरमुट हो सकते हैं।
  3. passaging के लिए, 1.0 mL पिपेट युक्तियों का उपयोग करके प्राथमिक न्यूरोस्फीयर को 15 मिलीस बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब पर स्थानांतरित करें। 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा न्यूरोस्फीयर को गोली मारें और सुपरनेटेंट को त्याग दें।
  4. ऊतक विच्छेदन मीडिया के 5 mL में गोली को फिर से निलंबित करें जिसमें पैपाइन या 0.05% ट्रिप्सिन समाधान शामिल है। 10 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  5. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रलाइज करें न्यूरोस्फीयर मीडियम के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से अलग करें और धीरे-धीरे 10x ऊपर और नीचे पिलेटिंग करें।
  6. पहले वर्णित न्यूरोस्फीयर मीडिया में कोशिकाओं (फिर से) को प्लेट करें। संस्कृति में 7-10 दिनों के बाद, प्लेट को माध्यमिक न्यूरोस्फीयर से समृद्ध किया जाना चाहिए।
    नोट: इन संस्कृतियों को अच्छी दक्षता के साथ 8x तक चलाया जा सकता है, जिसके बाद न्यूरोस्फीयर आकार प्रसार में कमी के छोटे और विचारोत्तेजक हो जाता है।
  7. हीमोसाइटोमीटर पर कोशिकाओं की गणना करें और पॉली-डी-लाइन कोटेड प्लेट (6 या 12 कुओं) पर भविष्य के प्रयोगों के लिए इष्टतम संख्या प्लेट करें।
  8. स्टेम सेल में अंतर करने के लिए, पहले वर्णित केंद्रीकरण द्वारा दूसरे से आठवें मार्ग तक न्यूरोस्फीयर एकत्र करें, सिवाय गोली में भेदभाव माध्यम जोड़ें।
    नोट: विट्रो में 7 दिनों के बाद, स्टेम सेल न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स में अंतर करते हैं, जैसा कि न्यूरोनल मार्कर-III ट्यूबलिन, एस्ट्रोसाइटिक मार्कर जीएफएपी और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट निर्माता O4 के साथ धुंधला करके प्रदर्शित किया गया है।

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Representative Results

प्रोमिनिन-1- पॉजिटिव पोस्टनेटल सेरिबेलर स्टेम सेल ने विकास कारकों (ईजीएफ और बीएफएफएफएफ) में समृद्ध न्यूरोस्फीयर मीडियम में न्यूरोस्फीयर का गठन किया। ये न्यूरोस्फीयर प्रोमिनिन-1-धुंधला, अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्कर, और नेटिन और जीएफएपी13 (चित्रा 1)जैसे अन्य स्टेम सेल मार्कर के लिए एक दाग के रूप में भी सकारात्मक थे। स्टेम सेल मार्कर अभिव्यक्ति को पूरे संस्कृति में और कम से कम आठ मार्ग20तक बनाए रखा गया था । विकास कारकों की वापसी पर और एलआईएफ और पीडीजीएफ-एए (जो कारक हैं जो न्यूरोनल और ग्लियल विभेदन21,,22का समर्थन करते हैं), न्यूरोस्फीयर न्यूरोनल और ग्लियल वंश(चित्रा 2)में विभेदित होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रसवोत्तर सेरिबैलम से प्रोमिनिन-1 स्टेम कोशिकाओं का अलगाव। (A)सेरिबैलर स्टेम सेल इम्यूनोमैग्नेटिक प्रोमिन-1 मोतियों का उपयोग करके अलग-थलग पड़ गए थे। शीर्ष पैनल: शुद्ध स्टेम सेल (कॉलम-बाउंड) ने व्यापक प्रसार और आत्म-नवीकरण गुणों के साथ न्यूरोस्फीयर का गठन किया। कोशिकाएं कॉलम (प्रवाह के माध्यम से) के लिए असीम न्यूरोस्फीयर बनाने में असमर्थ थीं; इसके बजाय, वे सेरिबेलर न्यूरोनल/ग्लिअल मिश्रित कोशिकाएं (-III ट्यूबलिन/GFAP) बन गए। नीचे पैनल: स्टेम सेल-विशिष्ट मार्कर व्यक्त करने वाली प्रोमिनिन-1+ कोशिकाओं से गठित न्यूरोस्फीयर: नेस्टिन, प्रोमिनिन-1 और जीएफएपी। (ख)स्टेम सेल मार्कर प्रोमिनिन-1 और नेस्टिन और न्यूरोनल मार्कर के लिए सकारात्मक-III ट्यूबलिन के लिए सना हुआ नकारात्मक के माध्यम से प्रवाह में कोशिकाओं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोमिनिन-1 सकारात्मक न्यूरोस्फीयर का भेदभाव। विभेदन कारकों (पीडीजीएफ-एए या एलआईएफ) की उपस्थिति में, प्रोमिनिन-1-सकारात्मक न्यूरोस्फीयर न्यूरॉन्स (-III ट्यूबलिन), एस्ट्रोसाइट्स (जीएफएपी), और ओलिगोडेन्रोकसाइट्स (O4) में अंतर करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रोमिनिन-1- व्यक्त करने वाले सेरिबेलर स्टेम सेल प्रसवोत्तर जीवन के पहले 3 हफ्तों के दौरान संभावित सफेद पदार्थ में रहते हैं। उनके प्रसार को पुरकिंजे कोशिकाओं द्वारा समर्थित ध्वनि हेजहोग मार्ग द्वारा कसकर नियंत्रित किया जाता है। ये स्टेम सेल/जनक बाद में जन्मे गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स को बास्केट कोशिकाओं और स्टेलेट कोशिकाओं नामक योगदान देते हैं । ये इंटरन्यूरॉन्स आणविक परत में रहते हैं, जहां वे पुरकिंजे कोशिकाओं पर सिनेप्स करते हैं और गैबार्गिक अवरोध13,,17,,23के माध्यम से पीसी स्थलाकृति और कार्य करते हैं। इंटरन्यूरॉन्स बनाने के अलावा, यह स्टेम सेल आबादी सभी पोस्टनेटल लीव्ड सेरिबेलर एस्ट्रोसाइट्स17,24को भी उत्पन्न करती है।

यह प्रोटोकॉल प्रसवोत्तर माउस सेरिबैलम से प्रोमिनिन-1/सीडी133 स्टेम कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए एक आसान और लागत प्रभावी विधि का वर्णन करता है । स्टेम सेल अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों में सुसंस्कृत होना चाहिए । सामान्य प्लेटों में इन स्टेम कोशिकाओं को संजोने से न्यूरोस्फीयर सतह से जुड़ सकते हैं और कम स्टेम सेल प्रसार और भेदभाव का कारण बन सकते हैं। यहां, प्रति 5,000 कोशिकाओं पर 200-300 न्यूरोस्फीयर की उपज एक ही सेरिबैलम से लगभग 1 x 107 कोशिकाओं की स्टेम सेल यील्ड से मेल खाती है। यह एक FACS आधारित रणनीति है कि 10x अधिक महंगा है के लिए वर्णित किया गया है के बराबर है । इसके अलावा, FACS उपकरण एक महंगी सेट अप और उच्च प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता है, और आसानी से उपलब्ध नहीं है ।

इन स्टेम सेल कैंसर के साथ - साथ न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोडीजेनेरेटिव डिसऑर्डर25,26,,27पर शोध में भी बढ़ रहे हैं । प्रारंभिक जीवन में इन स्टेम कोशिकाओं के अनियंत्रित प्रसार से मेडुलोब्लास्टोमा28हो जाता है , जबकि हमारी अपनी प्रयोगशाला से शोध से पता चलता है कि उनके असामान्य प्रसार और भेदभाव आनुवंशिक रोग स्पिनोसेरिबैलर एटैक्सिया टाइप 120में बाद में सेरिबेलर पतन में योगदान दे सकते हैं । ये नए प्रोटोकॉल इन कोशिकाओं का अध्ययन करने और स्वास्थ्य और रोग में अपनी भूमिकाओं में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए मूल्यवान होंगे। इन तरीकों से स्ट्रोक या आघात के बाद पुनर्योजी उपचारों में प्रगति हो सकती है और मस्तिष्क के अन्य अपमान जो न्यूरोरेजेनरेशन का वारंट होगा। यह बोधगम्य है कि इन तकनीकों को आंत और अस्थि मज्जा जैसे अन्य ऊतकों से प्रोमिनिन-1-व्यक्त स्टेम कोशिकाओं को निकालने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है, जहां उन्हें15,,29भी व्यक्त किया जाता है।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया जाता है ।

Acknowledgments

हम ओपल लैब के सदस्यों को उनके सुझावों के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच ग्रांट 1RO1 NS062051 और 1RO1NS08251 (Opal P) द्वारा समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05%Trypsin Thermo Fisher Scientific 25300054 0.05%
2% B27 Gibco; Thermo Fisher Scientific 17504001
2 mM EDTA solution Corning 46-034-CI
Anti- Prominin-1 microbeads Miltenyi Biote 130-092-333
Bovine serum albumin Sigma A9418
Column MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Culture plates ultra - low attachment Corning 3473
Cysteine Sigma C7880
DNase Sigma D4513-1VL 250 U/ml
Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline Thermo Fisher Scientific 14040141
Hank's balanced salt solution-HBSS Gibco 14025-092
Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor Promega G507A 20 ng/mL
Human recombinant Epidermal Growth Factor Promega G502A 20 ng/mL
Leukemia Inhibitory Factor Sigma L5158
l-glutamine Gibco 25030081
Microscopy Lieca TCS SP5 confocal microscopes
MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-102
Mouse anti-Prominin-1 Affymetrix eBioscience 14-1331 1 in 100
Nestin Abcam ab27952 1 in 200
Neurobasal medium Thermo Fisher 25030081
O4 Millopore MAB345
Papain Worthington LS003126 (100 U/mL)
Platelet- Derived Growth Factor Sigma H8291 10 ng/mL
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Rabbit anti-tubulin, b-III Sigma T2200 1 in 500
Rabit anti-GFAP Dako Z0334 1 in 500
Separation columns-MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Sterile cell strainer Fisher Scientific 22363547 40 μm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
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Edamakanti, C. R., Opal, P.… More

Edamakanti, C. R., Opal, P. Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum. J. Vis. Exp. (158), e60554, doi:10.3791/60554 (2020).

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