Summary
Demonstrert her er en effektiv og kostnadseffektiv metode for å rense, kultur, og skille hvite materie stamceller fra postnatal mus cerebellum.
Abstract
De fleste cerebellar nevroner oppstår fra to embryonale stammen nisjer: en rhombic leppe nisje, som genererer alle cerebellar excitatory glutamatergic nevroner, og en ventrikulær sone nisje, som genererer hemmende GABAergic Purkinje celler, som er nevroner som utgjør dyp cerebellar kjerner og Berg glimana. Nylig har en tredje stamcellenisje blitt beskrevet som oppstår som en sekundær germinal sone fra ventrikulær sone nisje. Cellene i denne nisjen er definert av celleoverflatemarkøren prominin-1 og er lokalisert til den utviklende hvite saken om postnatal cerebellum. Denne nisjen står for det avdøde fødte molekylære laget GABAergic interneurons sammen med postnatalt genererte cerebellar astrocytter. I tillegg til deres utviklingsrolle, er denne nisjen økende translasjonell betydning i forhold til sitt engasjement i nevrodegenerasjon og tumorigenesis. Biologien til disse cellene har vært vanskelig å tyde på grunn av mangel på effektive teknikker for rensing. Demonstrert her er effektive metoder for å rense, kultur, og skille disse postnatale cerebellar stamceller.
Introduction
Lillehjernen har lenge blitt anerkjent som en stor nevronal krets som koordinerer frivillig bevegelse1. Den mottar innspill fra de brede swathes av nevroaksen, som inkluderer proprioceptive informasjon fra periferien, slik som å finjustere motorutgang og koordinere bevegelse. Mer nylig har det også vært innblandet i å regulere kognisjon og følelser ved potensielt å bruke lignende informasjonsbehandlingsnettverk2,3,4.
Den voksne lillehjernen består av en ytre cerebellar cortex og indre hvit materie. Ispedd i disse strukturene er dype intracerebellar kjerner. I likhet med resten av nervesystemet, er utviklingen av lillehjernen drevet av spredning av multipotente stamceller (stamceller) som migrerer og skiller seg ut for å gi denne velorganiserte strukturen. I tidlig utvikling (E10.5–E13.5), en ventrikulær stamme nisje rundt den utviklende fjerde ventrikkelen genererer GABAergic nevroner (dvs. Purkinje celler, Lugaro celler, Golgi celler) sammen med Bergmann glia5,6,7,8.
Senere i utviklingen (postnatal uke en), en andre stamcelle nisje i rhombic leppegenererer MATH1- og Nestin-uttrykkende forfedre som gir opphav til eksitatoriskgranule nevroner9,10,11,12. Nylig har en tredje stamcelle nisje blitt beskrevet13. Disse cellene uttrykker prominin-1 (også kjent som CD133), en membran-spenner glykoprotein som definerer en undergruppe av stamceller i tarmen og hematopoetiske systemer14,15,16. In vivo skjebne kartlegging viser at disse stamcellene genererer viktige molekylære lag interneurons (dvs. kurvceller og stellate celler), sammen med astrocytter, i løpet av de tre første postnatal uker. Tidligere har det vært vanskelig å studere disse cellene in vitro fordi tidligere metoder har krevd kostbare og tidkrevende teknikker (dvs. fluorescensaktivert cellesortering [FACS]) som er avhengig av prominin-1 farging12,13,17. Denne protokollen beskriver en immunomagnetisk basert metode for isolering av disse stamcellene som deretter lett kan dyrkes og differensieres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med NIHs veiledning for pleie og bruk av laboratoriedyr (2011) og ble godkjent av Northwestern University IACUC (protokoll IS00011368).
1. Utarbeidelse av løsninger
- Forbered vevdissosiasjonsoppløsning laget av steril fenol rødholdig Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS) med papain (100 E/ml), cystein (0,2 mg/ml) og DNase (250 E/ml).
- For å forberede DNase-oppløsningen fortynnes 100 mg av det lyofiliserte pulveret til DNase I (en flaske) i 50 ml H2O. Bland godt og filtrer lageroppløsningen. Forbered 10 ml lager aliquots. Del ett buljongrør i 0,5 ml engangsbruk aliquots. Oppbevar disse engangsaliquotene ved -80 °C.
- Forbered magnetiskseparasjonsreagenser ved å klargjøre magnetisk kolonnebuffer X: 0,5% storfe serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA-løsning.
- For å forberede nevrosfæremedier, bruk neurobasal medium som inneholder penicillin/streptomycin med L-glutamin og supplement med 2% B27, 20 ng / ml humanrekombinant epidermal vekstfaktor (EGF), og 20 ng / ml human rekombinant grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF).
- For å forberede differensieringsmidler, bruk neurobasal medium og supplement med 10 ng / ml differensiert faktor blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF-AA) eller 10 ng / ml leukemi hemmende faktor (LIF) og 2% B27.
- Bruk ultra-lav feste 12 brønn (3,5 cm2) og 6 brønn (9,6 cm2)kulturplater.
2. Disseksjon av Cerebellum
- Bedøve musevalper (P3-P7) med isofluran og halshugge ved hjelp av kirurgisk saks.
- Spray det separerte hodet til valpene med 70% etanol.
- Overfør hvert hode til en tom steril 10 cm kulturrett. Skill huden ved hjelp av mikrodisseksjonsaksen, fjern deretter skallen ved å kjøre saksen sagittal langs midtlinjen.
- Ved hjelp av #7 tang, skrelle av skallen bein starter caudally fra hjernestammen. Løft hjernen forsiktig med en slikkepott, hold lillehjernen intakt, og overfør hjernen til en frisk steril 10,0 cm tallerken som inneholder 15 ml iskald Hanks' balanserte saltløsning (HBSS) løsning.
- Plasser parabolen som inneholder hjernen under et disseksjonsmikroskop. Bruk fine #5 tang, fjern meninges og store blodkar fra lillehjernen og skille lillehjernen fra hjernestammen ved hjelp av slikkepotten.
- Overfør lillehjernen til et 15 ml sentrifugerør som inneholder 5,0 ml iskald HBSS-oppløsning. Vask lillehjernen ved å skylle og dekantere 3x med 5,0 ml HBSS.
MERK: Hver lillehjernen bør plasseres i sitt eget rør for videre behandling.
3. Forberedelse av cellesuspensjon
- Etter siste skylling, tilsett 5 ml papain-basert vevdissosiasjonsløsning (basert på tidligere arbeid13,18) som er forvarmet til 37 °C. Inkuber vevet i 15 min ved 37 °C i et vannbad. Bland innholdet langsomt ved å snu røret opp og ned 3x–5x hver 3.
- Forbered en bred diameter (vanlig glasspipette) og smal diameter Pasteur pipette (brannpolert ved oppvarming over en Bunsen-brenner) som beskrevet tidligere19.
- Vask vevet 3x med 5 ml HBSS-oppløsning, unngå tap av vevet mens du dekanterer for hånd.
- Fjern den siste HBSS-vasken og tilsett 5 ml DPBS-oppløsning som inneholder 250 μL DNase-oppløsning til vevet. Dissosiere vevet ved å triturating 10x–15x ved hjelp av den brede diameteren Pasteur pipette. Utfør dette trinnet forsiktig for å unngå dannelse av bobler.
- Inkuber deretter slurry for ytterligere 10 min ved 37 °C i vannbadet, bland ved å invertere og rette røret.
- Bruk den reduserte diameteren Pasteur pipette til å trere vevsslammen 10x ytterligere. Hvis store biter av vev forblir, trykk vevsbitene mot bunnen av røret med spissen av pipetten forsiktig og fortsett pipettering til cellene når en fin suspensjon.
- Inkuber vevet ved 37 °C i ytterligere 10 min, gjenta de forrige blandetrinnene.
4. Immunmerking av stamceller
- Plasser sentrifugerørene på is og bruk iskalde løsninger for de neste trinnene. Sil de dissosierte cellene gjennom en 40 μm cellesil i et 50 ml sentrifugerør. Topp filteret med 10,0 ml HBSS-løsning for å sikre at cellene passerer gjennom nettet i denne ekstra løsningen.
- Overfør de filtrerte cellene til et friskt 15 ml sentrifugerør og sentrifuge cellesuspensjonen ved 300 x g i 10 min ved 4 °C. Aspirer og kast supernatanten helt ved å forsiktig bruke en vakuumaspirator.
- Resuspender pelleten i 160 μL magnetisk kolonnebuffer. For å oppnå encellede suspensjon før magnetisk merking, send celler gjennom et 30 μm nylonnett for å fjerne celleklumper, som ellers kan tette kolonnen.
- Tilsett 40 μL anti-prominin-1 mikroperler til hvert 15 ml rør, bland og inkuber i kjøleskap i 15 min for at antistoffet skal binde seg til prominin-1-uttrykkende celler.
- Vask cellene ved å legge til 1,0–2,0 ml kolonnebuffer X og sentrifuge på 300 x g i 10 min. Aspirer supernatanten helt.
- Resuspender pelleten i 1,0 ml kolonnebuffer X.
MERK: Hvis små klumper ses etter resuspensjon av pellet med 1,0 ml kolonnebuffer X, bør de fjernes nøye ved hjelp av en spiss av Pasteur-pipetten, ellers kan disse klumpene blokkere magnetkolonnen under cellesortering.
5. Magnetisk kolonneforberedelse, cellesortering og plating
MERK: Den magnetiske separasjonen fra forskjellige genotypeforhold (sykdom vs. kontroll) må utføres samtidig, siden enhver forsinkelse kan påvirke nevrosfærenmorfologi.
- Forbered de magnetiske kolonnene ved å plassere dem på det magnetiske stativet som er utsatt for magnetfeltet. Skyll kolonnen én gang med 500 μL buffer X ved å bruke buffer som drypper inn i et sentrifugerør som skal kastes.
MERK: Forbered fersk magnetisk kolonnebuffer X for hvert eksperiment; hvis ikke, vil stamcelleutbyttet være lav. - Bruk den merkede cellesuspensjonen på kolonnen. Samle gjennomstrømningen som inneholder umerkede celler som hovedsakelig består av cerebellære nevronale / glial blandede celler i friske 15 ml rør (Figur 1A).
- Vask kolonnen 3x med 500 μL buffer X (hver vask tar rundt 2-4 min).
MERK: Cerebellar nevronal / glial blandet kultur beriket med cerebellar granulære nevroner kan tjene som et nyttig biprodukt av dette rensetrinnet. - Fjern kolonnen fra magnetfeltet og plasser i et 1,5 ml rør. Legg 1,0 ml kulturmedium (nevrosfæremedium) til kolonnen og skyv stempelet inn i kolonnen for å skylle ut cellene merket med prominin-1 perler i et friskt 1,5 ml falkerør.
- Hvis du vil forbedre renheten til prominin-1-merkede celler, sender du de eluted cellene over en andre kolonne etter trinn 5.1-5.4.
- Tell cellene med et hemocytometer. Den typiske avkastningen er 107 celler per lillehjernen. Plate cellene på ultra-lav festeplater (6 eller 12 brønn, basert på tettheten som kreves for nedstrøms eksperimenter).
6. Passering av nevrosfærer og differensiering
- Plate prominin-1-merkede stamceller på ultra-lav vedlegg 12 brønnplater i nevrosfæremedium (5000 celler / brønn).
- Etter 7-10 dager deler cellene seg for å gi ballformede flytende nevrosfærer (primære nevrosfærer).
MERK: I dette eksperimentet genereres sekundære nevrosfærer som ekspanderer i tall for videre bruk. Primære nevrosfærepopulasjoner brukes ikke til disse eksperimentene, siden de kan inneholde forurensende celler som ikke har stamcelleegenskaper og kan klumpe seg sammen med nevrosfærer. - For passaging, overfør de primære nevrosfærene sammen med kulturmediene ved hjelp av 1,0 ml pipettetips til et 15 ml sterilt sentrifugerør. Pellet nevrosfærene ved sentrifugering på 300 x g i 5 min og kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i 5 ml vevdissosiasjonsmedier som inneholder papain eller 0,05% trypsinoppløsning. Inkuber ved 37 °C i 10 min.
- Sentrifugercellesuspensjonen ved 300 x g i 5 min. Resuspend cellene i 5 ml nevrosfæremedium og dissosiercellene mekanisk ved hjelp av en plast Pasteur pipette og sakte piptting opp og ned 10x.
- Plate cellene (igjen) i nevrosfæremedier som beskrevet tidligere. Etter 7–10 dager i kulturen skal platen berikes med sekundære nevrosfærer.
MERK: Disse kulturene kan passeres opptil 8x med god effektivitet, hvoretter nevrosfærestørrelse har en tendens til å være mindre og antydet en reduksjon i spredning. - Tell cellene på hemocytometeret og plate det optimale antallet for fremtidige eksperimenter på poly-D-lysin belagtplater (6 eller 12 brønner).
- For å skille stamcellene, samle nevrosfærer fra andre til åttende passasje ved sentrifugering som beskrevet tidligere, bortsett fra legg differensieringmedium til pellet.
MERK: Etter 7 dager in vitro, stamcellene skiller seg inn nevroner, astrocyocytter, og oligodendrocytes, som demonstrert ved farging med neuronal markør β-III tubulin, astrocytisk markør GFAP, og oligodendrocyte maker O4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prominin-1-positive postnatale cerebellar stamceller dannet nevrosfærer i nevrosfære medium rik på vekstfaktorer (EGF og bFGF). Disse nevrosfærene var positive for prominin-1-farging, markøren som brukes til isolasjon, og også som en flekk for andre stamcellemarkører som Nestin og GFAP13 (Figur 1). Stamcellemarkøruttrykket ble opprettholdt gjennom hele kulturen og i opptil minst åtte passasjer20. Ved tilbaketrekking av vekstfaktorer og i nærvær av LIF og PDGF-AA (som er faktorer som støtter nevronal og glial differensiasjon21,22), nevrosfærene differensiert til nevronale og glial avstamninger (Figur 2).
Figur 1: Isolering av prominin-1 stamceller fra postnatal cerebellum. (A) Cerebellar stamceller ble isolert ved hjelp av immunomagnetiske prominin-1 perler. Topppanel: Rensede stamceller (kolonnebundne) dannet nevrosfærer med omfattende spredning og selvfornyelsesegenskaper. Cellene som var ubundet til kolonnen (gjennomstrømning) var ikke i stand til å danne nevrosfærer; I stedet ble de lillehjernen neuronal / glial blandede celler (β-III tubulin / GFAP). Bunnpanel: nevrosfærene dannet fra prominin-1+ celler som uttrykker stamcellespesifikke markører: Nestin, prominin-1 og GFAP. (B) Celler i gjennomstrømningen farget negativt for stamcellemarkører prominin-1 og nestin og positiv for nevronal markør β-III tubulin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Differensiering av prominin-1 positive nevrosfærer. I nærvær av differensieringsfaktorer (PDGF-AA eller LIF) differensiert prominin-1-positive nevrosfærer til nevroner (β-III tubulin), astrocytter (GFAP) og oligodendrocytes (O4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prominin-1-uttrykkende cerebellære stamceller bor i den potensielle hvite substansen i løpet av de første 3 ukene av postnatal liv. Deres spredning er tett kontrollert av den soniske pinnsvinbanen som støttes av Purkinje celler17. Disse stamcellene/stamfarene bidrar til senere fødte GABAergic interneurons kalt kurvceller og stellateceller. Disse interneurons bor i det molekylære laget, hvor de synapse på Purkinje celler og forme PC topografi og funksjon via GABAergic hemming13,,17,23. Foruten å danne interneurons, genererer denne stamcellepopulasjonen også alle postnatalt avledede cerebellære astrocytes17,24.
Denne protokollen beskriver en enkel og kostnadseffektiv metode for å rense prominin-1/CD133 stamceller fra den postnatale musen cerebellum. Stamceller må dyrkes i ultralave festeplater. Å lagre disse stamcellene i normale plater kan føre til at nevrosfærene festes til overflaten og fører til spredning og differensiering av lav stamcelle. Her tilsvarer utbyttet av 200–300 nevrosfærer per 5000 celler en stamcellekapasitet på rundt 1 x 107 celler fra et enkelt lillehjernen. Dette kan sammenlignes med det som er beskrevet for en FACS-basert strategi som er 10x dyrere. Videre krever FACS-utstyr et dyrt oppsett og høyt utdannet personell, og er ikke lett tilgjengelig.
Disse stamcellene får også økende translasjonell betydning i forskning på kreft samt nevroutviklings- og nevrodegenerative lidelser25,26,27. Ukontrollert spredning av disse stamcellene tidlig i livet fører til medulloblastom28, mens forskning fra vårt eget laboratorium tyder på at deres unormale spredning og differensiering kan bidra til senere cerebellar degenerasjon i den genetiske sykdommen spinocerebellar ataxia type 120. Disse nye protokollene vil være verdifulle for å studere disse cellene og gi ny innsikt i deres roller i helse og sykdom. Disse metodene kan også føre til fremskritt i regenerative terapier etter hjerneslag eller traumer og andre fornærmelser mot hjernen som ville garantere nevroregenerering. Det er tenkelig at disse teknikkene kan generaliseres for å trekke ut prominin-1-uttrykkende stamceller fra andre vev, som tarm og benmarg, hvor de også uttrykkes15,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter er erklært.
Acknowledgments
Vi takker Opal-laboratoriemedlemmene for deres forslag. Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd 1RO1 NS062051 og 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2 mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Culture plates ultra - low attachment | Corning | 3473 | |
| Cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/mL |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/mL |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/mL) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/mL |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 μm |
References
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J.
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al.
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition. Cerebellum. 13, London, England. 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
