Summary
Demonstreras här är en effektiv och kostnadseffektiv metod för att rena, odla och skilja vit materia stamceller från postnatalmus lillhjärnan.
Abstract
De flesta cerebellar nervceller uppstår från två embryonala stam nischer: en rombisk läpp nisch, som genererar alla cerebellar excitatoriska glutamatergic nervceller, och en ventrikulär zon nisch, som genererar hämmande GABAergic Purkinje celler, som är nervceller som utgör den djupa cerebellar kärnor och Bergman glia. Nyligen har en tredje stamcellsnisch beskrivits som uppstår som en sekundär germinal zon från ventrikulära zonen nisch. Cellerna i denna nisch definieras av cellytan markör prominin-1 och är lokaliserade till den växande vita frågan av postnatala lillhjärnan. Denna nisch står för den sena födda molekylära skiktet GABAergic interneurons tillsammans med postnatally genererade cerebellar astrocyter. Förutom deras utvecklingsmässiga roll, denna nisch vinner translationell betydelse när det gäller dess engagemang i neurodegeneration och tumorigenesis. Biologin hos dessa celler har varit svår att dechiffrera på grund av brist på effektiva tekniker för deras rening. Demonstreras här är effektiva metoder för att rena, kultur och differentiera dessa postnatala cerebellar stamceller.
Introduction
Lillhjärnan har länge erkänts som en stor neuronal krets samordna frivillig rörelse1. Den får indata från de breda strängarna av neuroaxis, som innehåller proprioceptive information från periferin, för att finjustera motoreffekt och samordna rörelse. På senare tid har det också varit inblandad i regleringen av kognition och känslor genom att eventuellt använda liknande nätverk för informationsbehandling2,3,4.
Den vuxna lillhjärnan består av en yttre cerebellar cortex och inre vit materia. Interspersed inom dessa strukturer är djupa intracerebellar kärnor. I likhet med resten av nervsystemet drivs utvecklingen av lillhjärnan av spridningen av multipotenta stamceller (stamceller) som migrerar och differentierar för att ge denna välorganiserade struktur. I tidig utveckling (E10.5–E13.5), en ventrikulär stam nisch runt den växande fjärde ventrikeln genererar GABAergic nervceller (dvs. Purkinje celler, Lugaro celler, Golgi celler) tillsammans med Bergmann glia5,6,7,8.
Senare i utvecklingen (postnatal vecka ett), en andra stamceller nisch i den rombiska läppen genererar MATH1- och Nestin-uttrycker förfäder som ger upphov till excitatoriska granulat nervceller9,10,11,12. Nyligen har en tredje stamcellsnisch beskrivits13. Dessa celler uttrycker prominin-1 (även känd som CD133), ett membran-spänner glykoprotein som definierar en delmängd av stamceller i tarmen och hematopoietiska system14,15,16. In vivo öde kartläggning visar att dessa stamceller genererar viktiga molekylära lager interneurons (dvs. korgceller och stellate celler), tillsammans med astrocyter, under de första tre postnatala veckorna. Tidigare har det varit svårt att studera dessa celler in vitro eftersom tidigare metoder har krävt kostsamma och tidskrävande tekniker (dvs. fluorescensaktiverad cellsortering [FACS]) som är beroende av prominin-1 färgning12,13,17. Detta protokoll beskriver en immunomagnetisk-baserad metod för isolering av dessa stamceller som sedan lätt kan odlas och differentieras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med NIH:s guide för vård och användning av försöksdjur (2011) och godkändes av Northwestern University IACUC (protokoll IS00011368).
1. Utarbetande av lösningar
- Förbered vävnadsdissociationslösning tillverkad av steril fenol som innehåller Dulbeccos fosfatbuffertade koksaltlösning (DPBS) med papain (100 U/ml), cystein (0,2 mg/ml) och DNase (250 U/ml).
- För att förbereda DNase lösning späd 100 mg av det frystorkade pulvret av DNase I (en flaska) i 50 ml H2O. Blanda väl och filtrera stamlösningen. Förbered 10 ml-lager. Dela ett lager röret i 0,5 ml engångsbruk alikvoter. Förvara dessa alikvoter för engångsbruk vid -80 °C.
- Förbered magnetiska separationsreagenser genom att förbereda magnetisk kolumnbuffert X: 0,5 % bovinumserumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA-lösning.
- För att förbereda neurosfärmedia, använd neurobasalmedium som innehåller penicillin/streptomycin med L-glutamin och komplettera med 2% B27, 20 ng/mL human rekombinant epidermal tillväxtfaktor (EGF) och 20 ng/ml human rekombinant grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF).
- För att förbereda differentiering media, använda neurobasal medium och komplettera med 10 ng/mL differentierad faktor trombocyt-härledda tillväxtfaktor (PDGF-AA) eller 10 ng/mL leukemi hämmande faktor (LIF) och 2% B27.
- Använd extremt lågt fäste 12 brunn (3,5 cm2) och 6 brunnsplattor (9,6 cm2).
2. Dissekering av Cerebellum
- Bedöva musungar (P3-P7) med isofluran och halshugga med kirurgisk sax.
- Spraya valparnas separerade huvud med 70% etanol.
- Överför varje huvud till en tom steril 10 cm odla maträtt. Separera huden med hjälp av mikrodissection sax, ta sedan bort skallen genom att köra saxen sagittal längs mittlinjen.
- Med hjälp av #7 pincett, skala av skallbenen börjar caudally från hjärnstammen. Lyft försiktigt hjärnan med hjälp av en spatel, hålla lillhjärnan intakt och överför hjärnan till en färsk steril 10,0 cm maträtt som innehåller 15 ml iskall Hanks Balanced Salt-lösning (HBSS).
- Placera skålen som innehåller hjärnan under ett dissektionsmikroskop. Med hjälp av fina #5 pincett, ta bort hjärnhinnorna och stora blodkärl från lillhjärnan och separera lillhjärnan från hjärnstammen med hjälp av spatel.
- Överför lillhjärnan till ett 15 ml centrifugrör som innehåller 5,0 ml iskall HBSS-lösning. Tvätta lillhjärnan genom att skölja och dekantera 3x med 5,0 ml HBSS.
OBS: Varje lillhjärnan bör placeras i sitt eget rör för vidare bearbetning.
3. Förberedelse för cellsustning
- Efter den senaste sköljningen tillsätts 5 ml papainbaserad vävnadsdissociationslösning (baserat på tidigare arbete13,,18) som har värmts upp till 37 °C. Inkubera vävnaden i 15 min vid 37 °C i ett vattenbad. Blanda långsamt innehållet genom att vända röret upp och ner 3x–5x var tredje minut, antingen med en nötande mixer eller för hand.
- Förbered en bred diameter (vanlig glaspipette) och pastörpipet (eldpolerad genom uppvärmning över en Bunsen-brännare) enligt beskrivningen tidigare19.
- Tvätta vävnaden 3x med 5 ml HBSS-lösning, undvik förlust av vävnaden medan du dekanterar för hand.
- Ta bort den sista HBSS-tvätten och tillsätt 5 ml DPBS-lösning som innehåller 250 μl DNase-lösning till vävnaden. Koppla bort vävnaden genom att triturera 10x–15x med pasteur pipetten med bred diameter. Utför detta steg försiktigt för att undvika bildandet av bubblor.
- Inkubera sedan slammet i ytterligare 10 min vid 37 °C i vattenbadet, blanda genom att vända och räta ut röret.
- Använd pastörpipet med reducerad diameter för att ytterligare triturera vävnadslamret 10x. Om stora bitar av vävnad kvarstår, tryck vävnadsbitarna mot botten av röret med spetsen på pipetten försiktigt och fortsätt pipettera tills cellerna når en fin suspension.
- Inkubera vävnaden vid 37 °C i ytterligare 10 minuter och upprepa de föregående blandningsstegen.
4. Immunmärkning av stamceller
- Placera centrifugrören på is och använd iskall lösningar för nästa steg. Sila de dissocierade cellerna genom en 40 μm cellsiler i ett 50 ml centrifugrör. Toppa filtret med 10,0 ml HBSS-lösning för att säkerställa att cellerna passerar genom nätet i denna extra lösning.
- Överför de filtrerade cellerna till ett färskt centrifugrör på 15 ml och centrifugera cellfjädringen vid 300 x g i 10 min vid 4 °C. Aspirera och kasta supernatanten helt genom att försiktigt använda en vakuumaspirator.
- Resuspend pelleten i 160 μL magnetiska kolumn buffert. För att få encellig suspension före magnetisk märkning, passera celler genom ett 30 μm nylonnät för att avlägsna cellklump, som annars kan täppa till kolonnen.
- Tillsätt 40 μl anti-prominin-1 mikropärlor till varje 15 ml-rör, blanda och inkubera i kylskåp i 15 min för att antikroppen ska binda till prominin-1-uttrycksceller.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1,0–2,0 ml kolumnbuffert X och centrifugera vid 300 x g i 10 min. Aspirera supernatanten helt.
- Resuspend pelleten i 1,0 ml kolumn buffert X.
OBS: Om små klumpar ses efter resuspension av pellet med 1,0 ml kolumn buffert X, bör de tas bort försiktigt med hjälp av en spets av Pasteur pipetten, annars dessa klumpar kan blockera den magnetiska kolumnen under cellsortering.
5. Magnetisk kolonnberedning, cellsortering och plätering
OBS: Den magnetiska separationen från olika genotyp villkor (sjukdom vs kontroll) måste utföras samtidigt, eftersom eventuella förseningar kan påverka neurosfär morfologi.
- Förbered de magnetiska kolumnerna genom att placera dem på det magnetiska stativet som utsätts för magnetfältet. Skölj kolonnen en gång med 500 μL buffert X genom att applicera buffert som droppar i ett centrifugrör som ska kasseras.
OBS: Förbered färsk magnetisk kolumnbuffert X för varje experiment. om inte, då stamcellsavkastningen kommer att vara låg. - Använd den märkta cellfjädringen på kolumnen. Samla flöde genom att innehålla omärkta celler som huvudsakligen består av cerebellar neuronala / glia blandade celler i färska 15 ml-rör (figur 1A).
- Tvätta kolonnen 3x med 500 μl buffert X (varje tvätt tar ca 2–4 min).
OBS: Cerebellar neuronal/gliaial blandad kultur berikad med cerebellar granulat nervceller kan fungera som en användbar biprodukt av denna rening steg. - Ta bort kolonnen från magnetfältet och placera i ett 1,5 ml-rör. Tillsätt 1,0 ml odlingsmedium (neurosfärmedium) i kolonnen och tryck in kolven i kolonnen för att spola ut cellerna som är märkta med prominin-1-pärlor i ett nytt 1,5 ml falkrör.
- För att öka renhetsgraden hos prominin-1 märkta celler, skicka de eluerade cellerna över en andra kolumn efter steg 5.1–5.4.
- Räkna cellerna med en hemocytometer. Den typiska avkastningen är 107 celler per lillhjärnan. Platta cellerna på ultralåga fästplattor (6 eller 12 brunn, baserat på den densitet som krävs för nedströms experiment).
6. Passaging av Neurospheres och differentiering
- Platta prominin-1-märkta stamceller på ultra-låg fastsättning 12 väl plattor i neurosfären medium (5.000 celler / väl).
- Efter 7–10 dagar delar sig cellerna för att ge bollformade flytande neurosfärer (primära neurosfärer).
OBS: I detta experiment genereras sekundära neurosfärer som expanderar i antal för vidare användning. Primära neurosfär populationer används inte för dessa experiment, eftersom de kan innehålla förorenande celler som inte har stamceller egenskaper och kan klumpa ihop sig med neurosfärer. - För passaging, överför de primära neurospheres tillsammans med kulturmedia med 1,0 ml pipett tips till en 15 ml steril centrifug rör. Pelletna neurosfärerna genom centrifugering vid 300 x g i 5 min och kasta supernatanten.
- Resuspend pelleten i 5 ml vävnad dissociation media som innehåller papain eller 0,05% trypsin lösning. Inkubera vid 37 °C i 10 min.
- Centrifugera cellfjädringen vid 300 x g i 5 min. Resuspend cellerna i 5 ml neurosfärmedium och separera cellerna mekaniskt med hjälp av en plastpaspipeett och rör långsamt upp och ner 10x.
- Platta cellerna (igen) i neurosfären media som beskrivits tidigare. Efter 7–10 dagar i kultur ska plattan berikas med sekundära neurosfärer.
OBS: Dessa kulturer kan passages upp till 8x med god effektivitet, varefter neurosfären storlek tenderar att vara mindre och tyder på en minskning av spridningen. - Räkna cellerna på hemocytometern och plattan det optimala antalet för framtida experiment på poly-D-lysinbelagda plattor (6 eller 12 brunnar).
- För att skilja stamcellerna, samla neurosfärer från den andra till åttonde passagen genom centrifugering som beskrivits tidigare, förutom lägga differentiering medium till pelleten.
OBS: Efter 7 dagar in vitro, stamcellerna differentiera i nervceller, astrocyter och oligodendrocyter, vilket framgår av färgning med neuronal markör β-III tubulin, astrocytic markör GFAP och oligodendrocyte maker O4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prominin-1-positiva postnatala cerebellar stamceller bildade neurosfärer i neurosfären medium rik på tillväxtfaktorer (EGF och bFGF). Dessa neurosfärer var positiva för prominin-1-färgning, markören som används för isolering, och även som en fläck för andra stamceller markörer såsom Nestin och GFAP13 (Figur 1). Stamcellsmarköruttrycket bibehölls i hela kulturen och i upp till minst åtta passager20. Vid återkallande av tillväxtfaktorer och i närvaro av LIF och PDGF-AA (som är faktorer som stöder neuronal och glial differentiering21,22), neurosfärerna differentieras till neuronala och gliala härstamningar ( figur2).
Figur 1: Isolering av prominin-1 stamceller från postnatal lillhjärnan. (A)Cerebellar stamceller isolerades med hjälp av immunomagnetiska prominin-1 pärlor. Övre panelen: Renade stamceller (kolumnbundna) bildade neurosfärer med omfattande spridning och självförnyelseegenskaper. Cellerna som inte är inkommande till kolumnen (flowthrough) kunde inte bilda neurosfärer. Istället blev de cerebellar neuronal/glial blandade celler (β-III tubulin/GFAP). Nedre panelen: de neurospheres bildas från prominin-1+ celler som uttrycker stamceller-specifika markörer: Nestin, prominin-1 och GFAP. (B)Celler i flödet genom färgas negativt för stamceller markörer prominin-1 och nestin och positiva för neuronal markör β-III tubulin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Differentiering av prominin-1 positiva neurosfärer. I närvaro av differentiering faktorer (PDGF-AA eller LIF), prominin-1-positiva neurospheres differentieras till nervceller (β-III tubulin), astrocyter (GFAP), och oligodendrocyter (O4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prominin-1-uttrycker cerebellar stamceller bor i den potentiella vita frågan under de första 3 veckorna av postnatala liv. Deras spridning är hårt kontrollerad av sonic igelkott väg stöds av Purkinje celler17. Dessa stamceller/stamfater bidrar till senare födda GABAergic interneurons som kallas korgceller och stellateceller. Dessa interneurons bor i det molekylära lagret, där de synaps på Purkinje celler och skulptera PC topografi och funktion via GABAergic hämning13,17,23. Förutom att bilda interneurons, denna stamcellspopulation genererar också alla postnatally härledda cerebellar astrocyter17,24.
Detta protokoll beskriver en enkel och kostnadseffektiv metod för att rena prominin-1/CD133 stamceller från postnatala mus lillhjärnan. Stamceller måste odlas i extremt låga fästplattor. Odling av dessa stamceller i normala plattor kan orsaka att neurosfärerna fäster på ytan och leder till låg stamcellsproliferation och differentiering. Här motsvarar avkastningen på 200–300 neurosfärer per 5 000 celler en stamcellsutbyte på cirka 1 x 107 celler från ett enda lillhjärnan. Detta är jämförbart med vad som har beskrivits för en FACS-baserad strategi som är 10x dyrare. Dessutom kräver FACS-utrustning en dyr uppsättning och välutbildad personal, och är inte lätt tillgänglig.
Dessa stamceller får också allt större translationell betydelse inom forskning om cancer samt neuroutvecklings- och neurodegenerativa sjukdomar25,,26,27. Okontrollerad spridning av dessa stamceller i början av livet leder till medulloblastom28, medan forskning från vårt eget labb tyder på att deras onormala spridning och differentiering kan bidra till senare cerebellar degeneration i den genetiska sjukdomen spinocerebellar ataxi typ 120. Dessa nya protokoll kommer att vara värdefulla för att studera dessa celler och ge ny inblick i deras roller i hälsa och sjukdom. Dessa metoder kan också leda till framsteg i regenerativa terapier efter stroke eller trauma och andra förolämpningar mot hjärnan som skulle motivera neuroregeneration. Det är tänkbart att dessa tekniker kan generaliseras för att extrahera prominin-1-uttrycker stamceller från andra vävnader, såsom tarm och benmärg, där de också uttrycks15,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Opal lab medlemmar för deras förslag. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag 1RO1 NS062051 och 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2 mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Culture plates ultra - low attachment | Corning | 3473 | |
| Cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/mL |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/mL |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/mL) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/mL |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 μm |
References
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition. Cerebellum. 13, London, England. 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
