Summary
Denne protokol beskriver de skridt, der er taget for at fremkalde KRAS lungetumorer i mus samt kvantificering af dannede tumorer ved ultralydsscanning. Små tumorer visualiseres i tidlige tidspunkter som B-linjer. På senere tidspunkter, relative tumor volumen målinger opnås ved måleværktøjet i ultralyd software.
Abstract
Med ~ 1,6 millioner ofre om året, lungekræft bidrager enormt til den verdensomspændende byrde af kræft. Lungekræft er til dels drevet af genetiske ændringer i onkogener som KRAS oncogene, som udgør ~ 25% af lungekræft tilfælde. Vanskeligheden ved terapeutisk målretning KRAS-drevet lungekræft skyldes til dels at have dårlige modeller, der kan efterligne udviklingen af sygdommen i laboratoriet. Vi beskriver en metode, der tillader relativ kvantificering af primære KRAS lungetumorer i en Cre-inducible LSL-KRAS G12D musemodel via ultralydsscanning. Denne metode er afhængig af lysstyrke (B)-mode erhvervelse af lunge parenkym. Tumorer, der oprindeligt er dannet i denne model er visualiseret som B-linjer og kan kvantificeres ved at tælle antallet af B-linjer til stede i de erhvervede billeder. Disse ville repræsentere den relative tumor nummer dannet på overfladen af musen lunge. Som de dannede tumorer udvikle sig med tiden, de opfattes som dybe kløfter i lungerne parenkym. Da omkredsen af den dannede tumor er veldefineret, beregning af den relative tumor volumen opnås ved at måle længden og bredden af tumoren og anvende dem i formlen anvendes til tumor kaliper målinger. Ultralydsscanning er en ikke-invasiv, hurtig og brugervenlig teknik, der ofte bruges til tumorkvantificeringer i mus. Selv om artefakter kan forekomme, når de opnår ultralydbilleder, har det vist sig, at denne billeddannelsesteknik er mere fordelagtig for tumorkvantificeringer i mus sammenlignet med andre billeddannelsesteknikker såsom computertomografi (CT) billeddannelse og bioluminescensscanning (BLI). Forskere kan undersøge nye terapeutiske mål ved hjælp af denne teknik ved at sammenligne lungetumor indledning og progression mellem forskellige grupper af mus.
Introduction
Som den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, lungekræft forbliver ildfaste til behandlinger, primært på grund af mangel på relevante prækliniske modeller, der kan opsummere sygdommen i laboratoriet1. Omkring 25% af lungekræft tilfælde skyldes mutationer i KRAS oncogene2. KRAS-drevet lungekræft er ofte forbundet med dårlig prognose og lav respons på behandling, fremhæver betydningen af yderligere undersøgelser i denne sygdom2.
Vi optimerede en metode, der gør det muligt at evaluere lungetumorvæksten i realtid i KRAS lungekræft-induceret immun-kompetente mus. Vi bruger Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) mus, hvor KRAS G12D oncogene kan udtrykkes ved Cre lentivirale vektorer3,4. Disse vektorer er drevet af carbonic anhydrase 2, så virusinfektion en der skal finde sted specifikt i alveolær epitelceller5. Hertil kommer, at fremskynde indledningen og progression af lungetumorer, den lentivirale konstruktion udtrykker også P53 shRNA fra en U6/H1 promotor (den lentivirale konstruktion heri vil blive omtalt som Ca2Cre-shp53)6. Den biologiske relevans af denne metode ligger i det naturlige forløb af lungetumor udvikling hos mus i modsætning til xenografts af ikke-ortotopiske tumorer i mus. En hindring ved hjælp af ortotopisk metode overvåger lungetumor vækst uden at ofre musen. For at overvinde denne begrænsning optimerede vi ultralydsscanning en e-scanning for at muliggøre analyse af lungetumorprogression i todimensionel (2D) tilstand i denne musemodel. Påbegyndelse af tumorer på 7 uger efter infektion afspejles som B-linjer i ultralyd billeder, som kan tælles, men vil ikke afspejle det nøjagtige antal tumorer til stede på lungerne. B-linjer er karakteriseret ved laser-lignende lodrette hvide linjer som følge af pleural linje i lungeparenkym7,8. Store tumorer kan visualiseres efter 18 ugers infektion. Den relative mængde af disse tumorer er kvantificeret ved 2D målinger udført på ultralyd.
Denne metode er optimal for forskere, der undersøger effekten af farmakologiske lægemidler på lungetumorvækst i LSL-KRAS G12D musemodellen. Desuden kan lungetumor progression sammenlignes mellem mus med forskellige genetiske slægter, at undersøge betydningen af tilstedeværelsen eller fraværet af visse gener / proteiner på udviklingen af lungetumor volumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med CGill Universitys institutionelle dyrepleje- og anvendelseskomité (IACUC), og procedurerne blev godkendt af McGill Universitys dyrevelfærdskomité (protokol om anvendelse af dyr # 2009-5754).
1. Generation af CA2Cre-shp53 Lentiviral Titre
BEMÆRK: Følgende protokol er den samme som den, der er beskrevet i Xia et al.6, med mindre ændringer.
- Fremstilling af lentivirus (for 15 cm x 10 cm retter)
- På dag 1, plade sunde HEK293T celler (7,5 x 106 celler pr 10 cm fad) med 10 ml Dulbecco's modificerede Eagle medium) (DMEM), 10% føtal kvæg serum (FBS), og 1% pen / strep. Kultur i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Blandblandingen til calciumfosfatomfektion (blanding til 15 plader). Under klargør rør A indeholdende 225 μg (15 μg/plade) af den lentivirale vektor (Ca2Cre-shp53), 75 μg (5 μg/plade) pspax2 plasmid (indeholdende HIV-1 gag og HIV-1 polgener), 75 μg (5 μg/plade) pMD2.G plasmid (indeholdende VSV-G-gen) til emballage en endelig koncentration på 0,15 M CaCl2 og fyld røret med destilleret H2O op til 3,75 ml. Forbered rør B indeholdende 3,75 ml 2x HEPES-buffered saltvand (HBS; 50 mM HEPES, pH 7,05, 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4·2H2O og 12 mM D-dextrose).
- Vortex rør A og tilsæt det dropwise til rør B under kontinuerlig vortexing.
BEMÆRK: Den samlede volumen vil være 7,5 ml. - Inkuber ved stuetemperatur i mørke i 20−30 min.
- Ca. 9 timer efter plating af cellerne, tilsættes 500 μL af omfektionsblandingen dråbevis i cellemediet (7,5 ml/15 retter: 0,5 ml pr. skål).
- Swirl forsigtigt hver skål til at blande, og inkubere alle retter på 37 °C, 5% CO2.
- På dag 2, 12−18 h efter omladning, erstattes mediet med 10 ml antibiotikafri reduceret serummedie (Materialetabel)pr. 10 cm fad. Placer retter ne tilbage i 37 °C, 5% CO 2-inkubatoren.
- På dag 3 indsamles mediet, der indeholder lentivira, der udtrykker Ca2Cre-shp53, og filtreres gennem 0,45 μm filtre. Genopfyld medierne med friske antibiotika-fri reduceret serum medier.
BEMÆRK: De indsamlede medier kan opbevares ved 4 °C i højst 3 dage. - På dag 4 indsamles for anden gang de medier, der indeholder lentivirus, og filtreres gennem et filter på 0,45 μm. Opbevares ved 4 °C (højst 3 dage).
- Kombiner virus supernatants fra trin 1.1.8 og 1.1.9. Centrer dem gennem centrifugalfilterenheder (materialetabel) ved centrifugering ved 1.372 x g i 30 min ved 4 °C. Gentag processen, indtil alle de indsamlede medier er passeret gennem kolonnerne.
BEMÆRK: Efter hver centrifugering kan der høstes 100−200 μL koncentreret filtrat. - Saml og bland de koncentrerede filtrates i et 15 ml iskoldt rør. Bland de koncentrerede lentivira godt og derefter aliquot (f.eks. 100 μL/rør). Opbevares ved -80 °C.
- Lentiviral titrering
BEMÆRK: Udødeliggjorte museembryonale fibroblaster (MEF' er), der udtrykker en loxP-flankeret allel af grønt fluorescerende protein (GFP), anvendes i denne protokol til kvantificering af viral titer. Enhver cellelinje med en loxP-GFP-allel skal dog være egnet til dette trin.- Kulturceller, der udtrykker en loxP-flankeret allel af GFP med DMEM, 10% FBS og 1% pen/strep ved 37 °C, 5% CO2.
- Plade 2 x 105 celler i to 50 mm brønde af en 6-brønds plade.
BEMÆRK: Cellerne i den ene brønd vil blive anvendt til lentiviral infektion, mens den anden vil blive brugt som en negativ kontrol. - Den næste dag, genopfylde cellerne med 2 ml DMEM, 10% FBS, og 1% pen / strep 2 h før lentiviral infektion.
- Der tilsættes 20 μL af CA2Cre-shp53 lentivirus (volumen kan variere, når det er nødvendigt) i den lentivirale infektion godt.
- Efter 3 dage i kulturen bestemmes hyppigheden af de GFP-positive celler, der er fremstillet af cre-induceret GFP, ved flowcytometri, som vist i figur 1. Vask celler med fosfatbufferen (PBS), afbryd ved trypsinisering, og opsaml celler ved centrifugering ved 112 x g.
- Vask cellerne to gange med PBS. Endelig skal cellerne suspenderes i 100 μL PBS. Bestemme procentdelen af GFP-positive celler med en celleanalysator (Materialetabel).
- Den lentivirusinfeinfeinfe/funktionelle titer beregnes ved hjælp af følgende formel:
hvor F er hyppigheden af GFP-positive celler og beregnet ved at trække hyppigheden af GFP-positive celler efter infektion (Fi) fra hyppigheden af GFP-positive celler (baggrund) før infektion (Fc) som vist i figur 1 (F = Fi-Fc), er Cn antallet af forgyldte celler (2 x 105),V er mængden af inoculum (ml), og DF er virusfortyndingsfaktoren.
BEMÆRK: Den infektiøse/funktionelle koncentration = ~2 x 106 TU/ml.
2. Intratrakal Intubation af lentivira i LSL-KRASG12D Mus
BEMÆRK: Metoden til intratrakal intubation blev anvendt som beskrevet i den offentliggjorte protokol af Vandivort et al.9. I denne protokol anvendes mus LSL-KRASG12D-mus i C57BL/6-baggrund i en alder af 6-8 uger. Et hjemmelavet arbejdsprocedureudvalg anvendes som beskrevet i Vandivort et al.9. Brættet er placeret foran eksperimentatoren i en bekvem arbejdsplads (ca. 1 m2).
- Der fremstilles et spirometer ved at fjerne stemplet på en 1 ml sprøjte og læsse 60 μL PBS i sprøjten.
- Fastgør en 22 G kateterspids i sprøjten og sæt til side.
- Bedøve musene ved intraperitoneal injektion af en 1 μL/g mus kropsvægt af ketamin (50 mg/ml)/xylazine (5 mg/ml)/acepromazine (1 mg/ml) cocktail. Sørg for korrekt sedation af musen ved en lav respirationsfrekvens (1 ånde hver 2 s).
- Aspirate 20 μL AF CA2Cre-shp53 lentivirus i en pipettor og der er afsat.
- Placer den bedøvede mus på arbejdsprocedurekortet ved at tilslutte dens øverste fortænder i boardets tråd.
BEMÆRK: Musens dorsum skal være flad mod platformen. - Tape caudal del af brysthulen til platformen for at sikre tilpasning af musen under proceduren.
- Juster en halsbrækkende illuminator mellem 80−100% intensitet, og anbring lyset 1−2 cm fra hudoverfladen.
- Bag perronen trækkes tungen ud af musens mundhule ved hjælp af sterile pincet.
- Mens du sikrer tungen, indsætte en depressor i mundhulen af musen derefter frigive tungen.
- Placer gåsehalsen på hovedstilken bronkier at belyse luftrør.
BEMÆRK: Luftrøret kan være synlig ved respiration, der forårsager udsving i lyset. - Når luftrøret er tydeligt set, skal spirometeret sættes (sprøjte med PBS og kateter) i luftrørsstien.
- Fjern depressoren, og overhold PBS' stigning og fald i sprøjten med hvert åndedrag.
BEMÆRK: Dette er en indikator for, at kateteret er placeret korrekt i luftrøret. - Fjern sprøjten, der indeholder PBS, samtidig med at kateteret holdes inde i luftrøret som den foregående position.
- 20 μL CA2Cre-shp53 lentivirus i midten af kateteret.
- Mens kateteret holdes på plads, injiceres 300 μL luft i kateteret ved hjælp af en tom sprøjte for at sikre korrekt fordeling af lentivirus i lungerne.
- Hold kateteret på plads, og sæt spirometeret ind i kateteret igen.
BEMÆRK: PBS-boblens stigning og fald vil sikre, at proceduren lykkes. - Fjern kateteret og tape. Anbring dyret på et varmt og tørt sted, indtil det genoplives.
3. Ultralydsscanning af lungetumorer i mus
BEMÆRK: Ultralydsscanning en e-scanning blev udført efter 7 og 18 ugers lentiviral intubation ved hjælp af det system, der er anført i Materialetabellen; Enhver model kan dog bruges til analysen.
- En dag før billeddannelse fjernes pels en fra brystet af den intuberede mus.
BEMÆRK: Musen skal bedøves i løbet af dette trin ved at placere dem i et induktionskammer på 3% isofluran og 2L/minute O2. - På billeddagen skal du konfigurere arbejdsområdet som vist i figur 2. Tænd for varmepumpen til ultralydsgel og temperaturmåleren.
- Opstil en varm 33 °C-inkubator for at placere musene i post-imaging.
- Placer den tredimensionale (3D) motor(figur 2F)på det integrerede jernbanesystem.
- Sørg for, at 3D-motoren og transducermonteringssystemet er sikkert på plads.
- Tilslut en foretrukken transducer (frekvens: 40 MHz; Figur 2E og materialetabel) til tumormålinger vinkelret på 3D-motoren.
- Start en ny undersøgelse af ultralydssoftwaren.
- Vælg Studiebrowser, og vælg derefter Ny nederst på skærmen.
- Vælg Ny undersøgelse, et nyt vindue vil blive vist, der gør det muligt at tilføje en undersøgelse Navn ud over yderligere oplysninger om undersøgelsen, dvs dato for undersøgelsen, navn forsker, osv.
- Udfyld oplysningerne i serienavn, dvs.
- Vælg Udført, ændres der automatisk for B-tilstand.
- Sæt en varmelampe i en bekvem position over dyreplatformen.
- Placer musen i induktionkammer (3,5% isofluran).
BEMÆRK: Korrekt anæstesibekræftelse bekræftes af bevidstløshed af musen, og langsommere respirationsfrekvens på omkring 1 ånde dragen pr. 2 sekunder. - Når musen er bedøvet, ændre forbindelsen af den anæstesi maskine, der skal rettes mod dyret platform, reducere isofluran til 2,5%.
- Placer musen på dyret platform i decubitus ventral, med sin mundhule rettet mod bedøvelsesrør.
- Påfør smøremiddel på øjnene af musen.
- Placer musen i decubitus dorsale og tape sine hænder og fødder fast på dyret platform.
- Påfør et lille lag ultralydsgel på musebrystet.
- Sænk anskaffelsessonden ved hjælp af højdekontrolknappen for at røre ved musens overflade. Placer sonden således, at hjertet af musen er omtrent centreret.
- Brug mikro-knapper til at erhverve billeder af hele brystet, fra begge ekstremiteter, i den tværgående retning ideelt indsamling 500 rammer pr mus (antallet af rammer kan variere afhængigt af personlige valg).
- Når billeddannelse er færdig, skal du fjerne gelen fra musens bryst og placere musen i den varme kuvøse.
4. 2D Analyse af ultralydbilleder
- Efter åbning erhvervede rammer på ultralyd software, scanne rammerne for tumorer.
- For små igangsættende tumorer, tælle antallet af B-linjer med jævne mellemrum hver 10 rammer for den fulde længde af de 500 erhvervede rammer.
Derfor tælles B-linjer i alt 50 billeder, hvert billede er adskilt af 10 billeder. B-linjer er kendetegnet ved langsgående hvide lige linjer fuldt gennemkører skærmen. - For 2D målinger af store tumorer, skal du vælge det lineære værktøj og måle bredden og længden af tumoren til stede.
- Brug følgende formel for at beregne tumormængden:
hvor L og W er længden og bredden af tumoren, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter at have opnået en lentiviral infektiøs titer på ~ 2 x 106 TU/ml (figur 1) blev Ca2Cre-shp53 lentivirus intratrachealt injiceret, da LSL-KRAS G12D-mus nåede en passende alder (6−8 uger)9. Ultralydsscanning blev udført efter 7 ugers infektion ved indledning af tumorer (Figur 3B). Billeddannelse blev udført på 7 uger for at inkludere de forskellige typer af prækursorlæsioner, der forekommer i LSL-KRASG12D musemodellen, lige fra hyperplasi til adenom3 som vist i figur 4A efter 8 ugers infektion. Imaging tidligere end 6 uger vil ikke sikre inddragelse af adenom-dannende tumorer i analysen3. Disse prækursorier visualiseres som B-linjer i ultralyd og kan tælles med øjet, da de kan identificeres som smalle stråler af hvidt lys lodret gennemkører skærmen og er resultatet af en stærk afspejling af ultralydbølge (figur 3B)10. B-linjer repræsenterer små tumorer, der er på overfladen af lungerne; tumorer, der indledes i dybere strukturer af lungerne, såsom tæt på luftrøret vil ikke blive afspejlet som B-linjer. Antallet af tumorer, der indledes på pleural overfladen kan kvantificeres ved at tælle B-linjer, da de er for små til volumen målinger. Vi erhvervede 500 rammer, der spænder over hele lungeområdet i 5 mus. B-linjer blev talt hver 10 frames; således blev de talt i i alt 50 billeder pr. mus, der spænder over de fulde 500 erhvervede billeder. Punktplottet i figur 3D viser summen af B-linjer, der tælles i hver 10 billeder (100 billeder) for 5 mus. Antallet af B-linjer pr. mus opsummeres derefter til at omfatte B-linjer, der findes i hele lungeområdet. Den gennemsnitlige mængde B-linjer, der repræsenterer tumorer i de fem mus, var 141,6 ± 41,52 (figur 3E). Figur 3A viser et ultralydsbillede erhvervet af en ikke-inficeret muselunge til sammenligning.
Ifølge Jackson et al.3, 16 uger efter intubation omfatter adenom samt adenocarcinom, som er tumor typer af interesse i KRAS lungekræft. For at sikre inddragelse af disse typer af tumorer, når man analyserer volumen målinger via ultralyd i vores model, vi afbildet lungerne af mus på 18 uger efter infektion. For at kvantificere mængden af de store tumorer via ultralyd, brugte vi 2D-analyse på ultralydssoftwaren. Store tumorer fremstår som dybe kløfter, der afbryder pleuraloverfladen som vist på billedet af figur 3C. Når en tumor er spottet, måler vi længden (L) og bredden (W) af tumoren, ved hjælp af måleværktøjet af ultralydssoftware. Når opnået, L og W anvendes i den konventionelle formel, der anvendes til beregning af tumor volumen (protokol trin 4.4). Vi analyserede tumorvolumen på 10 mus, som vist i figur 3F, hvor antallet af tumorer dannet i hver mus varierede fra 5 til 26 tumorer. Mængderne af alle tumorer dannet pr mus er derefter opsummeret til at repræsentere tumor volumen per mus. Til denne analyse antager vi, at tumorer dannet i lungerne af mus er epileptiske i form, således bredden af tumoren betragtes som vinkelret på billeddannelse flyet. Relativ volumenkvantificering kan gøres, når lineær størrelse af tumorer når 0,3 mm (enten længde eller bredde). Efter at have analyseret lungeparenkymien på 10 mus var den gennemsnitlige tumorvolumen 31,8 ± 6,61 mm3 (figur 3G). Hematoxylin og Eosin (H&E) farvninganalyse på lungesektioner bekræftede dannelsen af store tumorer ved 20 uger efter infektion (figur 4B) og bekræftet dannelse af adenom og adennocarcinom. Det skal bemærkes, at som tumor vækst skrider frem, forskellige tumorer kan fusionere sammen til at danne store, som vist i figur 4B. Selv om ultralyd software tillader 3D-analyse af tumorer, denne type analyse viste sig vanskeligt i vores model, primært på grund af den høje dynamiske bevægelse af de primære tumorer dannet, der er i overensstemmelse med lunge glidende (flytning af pleural linje med respiration) samt hjertebeats11. Vi begrundede, at 2D-analyse ville give konsistens i relative tumor volumen målinger, især når man sammenligner lungetumor progression mellem forskellige grupper af mus.
Figur 1: Flow cytometri analyse af MEFs med en GFP LoxP-allel. Repræsentative flow cytometri billeder, der viser hyppigheden af GFP-positive MEFs, der ikke er inficerede (Fc) (A) og inficeret (Fi) med Ca2Cre-shp53 lentivirus (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Arbejdsområde med integreret skinnesystem af ultralydsscanning. (A) X-akse mikro-knop. (B) Y-akse mikro-knop. (C) Dyreplatform. (D) Højdekontrolknappen for scanningshovedsonde. (E) Transducer. (F) 3D-motor. (G) Varmelampe. (H) Bedøvelsesrør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative ultralydsbilleder af muselunger før og efter lungetumorinduktion. (A) Billede af en ikke-inficeret mus lunge sektion. Røde pile peger på ribben (R) og lungeoverfladen (PS). (B) Billede af en mus lunge 7 uger efter tumor induktion ved intratrakal intubation af lentivirus. Pile angiver B-linjer, der afspejler små tumorer på lungeoverfladen. (C) Billede af en mus lunge sektion 18 uger efter tumor induktion. Blå linjer angiver målinger af længden (L: mm) og bredden (W: mm) af den viste tumor. (D) Scatter plot viser B-line kvantificering i 10 billeder, der spænder over 500 billeder (hvert billede er adskilt af 10 billeder). (E) Kvantificering af relative tumortal i lungerne efter 7 uger efter induktion. (F) Scatter plot viser den relative mængde af de forskellige tumorer dannet i lungerne af 10 mus på 18 uger efter infektion. (G) Kvantificering af lungetumorvolumen i mus (n = 10). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativ H&E-farvning af LSL-KRAS G12D-lungesektioner. (A) Lungesektion ved 8 ugers efterinfektion ved 500 μm forstørrelse. Pile peger på prækursorlæsioner dannet på dette tidspunkt, som afspejles som B-linjer i ultralyd. Sorte pile peger på forstørrede læsioner ved 60 μm. (B) Lungesektion ved 20 uger efter infektion ved 2 mm forstørrelse. Pilespidser af samme farve viser forskellige tumorer, der er fusioneret sammen. Pile viser forstørrede tumorer på 60 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerer en metode, der kan vurdere lungetumorvækst i Cre-inducible LSL-KRAS G12D musemodel ved ultralyd. Denne metode kan bruges til at vurdere effekten af farmakologiske hæmmere på lungetumor vækst. Det kan også bruges til at sammenligne lungetumor vækst mellem mus med forskellige genetiske baggrunde. Ved hjælp af denne teknik kræver ikke specialiserede beregningsmæssige færdigheder, men det er vigtigt at være systematisk i antallet af rammer, der anvendes til analyse for at give mulighed for en korrekt sammenligning, hvis metoden anvendes til at sammenligne forskellige grupper af mus.
Intratrakal intubation af ~ 2 x 106 TU/mL Ca2Cre-shp53 i LSL-KRAS G12D mus førte til dannelsen af prækursorlæsioner efter 7 ugers infektion. Disse vises som hvide linjer i længderetningen på sonografiske billeder og kaldes B-linjer (figur 3B)12. Det gennemsnitlige antal B-linjer pr. mus var 141,6 ± 41,52 (figur 3E). Vi valgte at visualisere indlede tumorer på 7 uger efter infektion, da dette tidspunkt ville omfatte forskellige typer af prækursorlæsioner; atypisk adenomaminøs hyperplasi, epitelhyperplasi og adenom3. Dannelsen af prækursorlæsioner på lungerne blev verificeret af H&E farvning efter 8 ugers lentiviral infektion (figur 4A). Efter 18 ugers viral intubation, tumorer er store nok til at tillade 2D volumen målinger i ultralyd software (Figur 3C). Analyse af ultralyd billeder blev udført på 18-ugers timepoint for at omfatte kvantificering af veludviklede adenom og adenocarcinom3. Dannelsen af disse typer af tumorer blev bekræftet ved 20 uger efter infektion ved H & E farvning analyse (Figur 4B). 3D volumen målinger er også muligt af ultralyd software, men kræver høj grad af ekspertise. Den titer, der er beskrevet i denne protokol er optimal til dannelsen af lungetumorer, der kan visualiseres korrekt og kvantificeres i 2D.
Andre billeddannelse teknikker kan også bruges til at overvåge lungetumor vækst i mus, såsom CT imaging og BLI13. Men, CT imaging kræver at levere en stråling dosis til tumoren, som kan påvirke tumorvækst ved gentagne analyser13. Desuden kræver det brug af kontrastmidler til nøjagtige tumormålinger13. BLI er en vigtig billeddannelse teknik, der ofte bruges til at kvantificere tumor spredning; dens vigtigste begrænsning er imidlertid dens afhængighed af metaboliske aktiviteter og tilstedeværelsen af ATP og O213. Fordelen ved ultralydsscanning ligger i, at det er en ikke-invasiv, ikke-bestråling, hurtig og billig teknik til at erhverve billeder af lungeparenkym13. Ultralyd er tidligere blevet brugt til at overvåge væksten af ortotopiske menneskelige tumorer xenografted i lunge og bugspytkirtel af mus13,14. Raes et al. har haft succes med at overvåge væksten af en enkelt menneskelig lungetumor implanteret nær den bageste mellemeoverflade i mus via ultralyd13. Forskellen i LSL-KRAS G12D musemodel er at have spontan udvikling af lungetumorer, der kan overvåges fra indledning til progression, og denne udvikling kan sammenlignes mellem mus grupper. Også, der er mange tumorer, der udvikles på lungen af LSL-KRAS G12D musemodel, der i sidste ende vokse, og kan endda fusionere sammen til at danne store tumorer(Figur 4B). Dette opfordrede til behovet for at bruge en metode, der kan overvåge lungetumor indledning og progression i denne musemodel. Vi optimerede 2D lysstyrke (B) mode analyse for at tillade kvantitativ vurdering af lungetumorer udviklet i denne musemodel.
En mulig begrænsning med ultralydsscanning er tilstedeværelsen af falske positiver15. Disse ses, når en meget reflekterende overflade er til stede (membran eller lever), der afbryder bane af strålen og kan skabe et virtuelt objekt efterligne en sand objekt15. Sådanne billeder kunne være falske tumorer, men kan omgås ved korrekt undersøgelse; en stor tumor er normalt dynamisk, mens et virtuelt objekt ville være statisk.
Ultralydsscanning for LSL-KRAS musemodellen er ideel på grund af denne tekniks ikke-invasive karakter. Den analysemetode, der anvendes i vores laboratorium til at overvåge lungetumor progression i LSL-KRAS musemodel er hurtig og brugervenlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. I. Verma for den lentivirale Ca2Cre-shp53 vektor. Arbejdet blev støttet af midler fra canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP 137113) til AEK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra - 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
References
- Eisenstein, M. Personalized medicine: Special treatment. Nature. 513, 8 (2014).
- Karachaliou, N., et al. KRAS mutations in lung cancer. Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).
- Xia, Y., et al. Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model. Nature Cell Biology. 17 (4), 532 (2015).
- Demi, L., et al. Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy. Scientific Reports. 7, 12746 (2017).
- Mohanty, K., et al. Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering. Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Saraogi, A. Lung ultrasound: Present and future. Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).
- Gargani, L., Volpicelli, G. How I do it: lung ultrasound. Cardiovascular Ultrasound. 12, 25 (2014).
- Soldati, G., et al. On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome. Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975 (2016).
- Raes, F., et al. High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology. PLoS One. 11 (4), 15 (2016).
- Lakshman, M., Needles, A. Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging. Nature Methods. 12 (4), 372 (2015).
- Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. Ultrasound for the Pulmonary Consultant. Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9 (2016).
