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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

अल्ट्रासाउंड इमेजिंग द्वारा चूहों में फेफड़ों के ट्यूमर प्रगति का पता लगाना

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60565
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Sir Mortimer B. Davis-Jewish General Hospital, 2Division of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, McGill University, 3Department of Cancer Immunology, Chair of Medical Biotechnology, Poznan University of Medical Sciences, 4Gerald Bronfman Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

यह प्रोटोकॉल चूहों में KRAS फेफड़ों के ट्यूमर को प्रेरित करने के साथ-साथ अल्ट्रासाउंड इमेजिंग द्वारा गठित ट्यूमर की मात्रा को प्रेरित करने के लिए उठाए गए कदमों का वर्णन करता है। छोटे ट्यूमर बी लाइनों के रूप में शुरुआती टाइमपॉइंट में कल्पना कर रहे हैं। बाद के समय बिंदुओं पर, अल्ट्रासाउंड सॉफ्टवेयर में माप उपकरण द्वारा सापेक्ष ट्यूमर वॉल्यूम माप हासिल किए जाते हैं।

Abstract

प्रति वर्ष ~ 1.6 मिलियन पीड़ितों के साथ, फेफड़ों के कैंसर कैंसर के दुनिया भर में बोझ के लिए काफी योगदान देता है। फेफड़ों का कैंसर आंशिक रूप से इस तरह के KRAS oncogene, जो फेफड़ों के कैंसर के मामलों का ~25% का गठन के रूप में oncogenes में आनुवंशिक परिवर्तन से प्रेरित है । चिकित्सकीय रूप से KRAS संचालित फेफड़ों के कैंसर को लक्षित करने में कठिनाई आंशिक रूप से गरीब मॉडल है कि प्रयोगशाला में रोग की प्रगति की नकल कर सकते है होने से उपजा है । हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के माध्यम से क्रे-इंडिकेबल एलएसएल-क्रास जी 12डी माउस मॉडल में प्राथमिक KRAS फेफड़ों के ट्यूमर के सापेक्ष मात्रा की अनुमति देता है। यह विधि फेफड़ों के परेंचिमा की चमक (बी)-मोड अधिग्रहण पर निर्भर करती है। इस मॉडल में शुरू में बनने वाले ट्यूमर को बी-लाइनके रूप में कल्पना की जाती है और अधिग्रहीत छवियों में मौजूद बी-लाइनों की संख्या की गणना करके निर्धारित किया जा सकता है। ये माउस फेफड़े की सतह पर गठित सापेक्ष ट्यूमर संख्या का प्रतिनिधित्व करेंगे। जैसे-जैसे समय के साथ गठित ट्यूमर विकसित होते हैं, उन्हें फेफड़ों के परेंचिमा के भीतर गहरी फांक के रूप में माना जाता है। चूंकि गठित ट्यूमर की परिधि अच्छी तरह से परिभाषित है, इसलिए ट्यूमर की लंबाई और चौड़ाई को मापने और ट्यूमर कैलिपर मापके के लिए उपयोग किए जाने वाले सूत्र में उन्हें लागू करके सापेक्ष ट्यूमर की मात्रा की गणना की जाती है। अल्ट्रासाउंड इमेजिंग एक गैर-आक्रामक, तेज और उपयोगकर्ता के अनुकूल तकनीक है जिसका उपयोग अक्सर चूहों में ट्यूमर क्वांटिफिकेशन के लिए किया जाता है। हालांकि अल्ट्रासाउंड छवियों को प्राप्त करते समय कलाकृतियों दिखाई दे सकते हैं, यह दिखाया गया है कि यह इमेजिंग तकनीक चूहों में ट्यूमर क्वांटिफिकेशन के लिए गणना टोमोग्राफी (सीटी) इमेजिंग जैसी अन्य इमेजिंग तकनीकों की तुलना में अधिक लाभप्रद है और बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (BLI)। शोधकर्ताओं ने फेफड़ों के ट्यूमर दीक्षा और चूहों के विभिन्न समूहों के बीच प्रगति की तुलना करके इस तकनीक का उपयोग कर उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्यों की जांच कर सकते हैं ।

Introduction

दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मौतों के प्रमुख कारण के रूप में, फेफड़ों के कैंसर उपचार के लिए अपवर्तक रहता है, मुख्य रूप से प्रासंगिक पूर्व नैदानिक मॉडल है कि प्रयोगशाला1में रोग संक्षिप्त कर सकते है की कमी के कारण । फेफड़ों के कैंसर के लगभग 25% मामले KRAS oncogene2में म्यूटेशन के कारण हैं । KRAS संचालित फेफड़ों के कैंसर अक्सर गरीब पूर्वानुमान और चिकित्सा के लिए कम प्रतिक्रिया के साथ जुड़ा हुआ है, इस रोग2में आगे के अध्ययन के महत्व पर प्रकाश डाला ।

हमने एक विधि को अनुकूलित किया जो KRAS फेफड़ों के कैंसर-प्रेरित प्रतिरक्षा-सक्षम चूहों में वास्तविक समय में फेफड़ों के ट्यूमर के विकास के सापेक्ष मूल्यांकन की अनुमति देता है। हम Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) चूहों का उपयोग करते हैं जिसमें KRAS G12D oncogene क्रे लेंटिवायरल वैक्टर3,4द्वारा व्यक्त किया जा सकता है । ये वैक्टर कार्बोनिक एंहाइड्रेज 2 द्वारा संचालित होते हैं, जिससे वायरल संक्रमण विशेष रूप से अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं5में हो सकता है। इसके अलावा, फेफड़ों के ट्यूमर की दीक्षा और प्रगति में तेजी लाने के लिए, लेंटिवायरल निर्माण भी एक U6/H1 प्रमोटर से P53 shRNA व्यक्त करता है (लेंटिवायरल निर्माण यहां Ca2Cre-shp53 के रूप में संदर्भित किया जाएगा)6। इस विधि की जैविक प्रासंगिकता चूहों में फेफड़ों के ट्यूमर के विकास के प्राकृतिक पाठ्यक्रम में निहित है क्योंकि चूहों में गैर-ऑर्थोटोपिक ट्यूमर के विद्वेष का विरोध किया गया है। ऑर्थोटोपिक विधि का उपयोग करने वाली एक बाधा माउस का त्याग किए बिना फेफड़ों के ट्यूमर के विकास की निगरानी कर रही है। इस सीमा को दूर करने के लिए, हमने इस माउस मॉडल में दो-आयामी (2डी) मोड में फेफड़ों के ट्यूमर की प्रगति के विश्लेषण की अनुमति देने के लिए अल्ट्रासाउंड इमेजिंग को अनुकूलित किया। 7 सप्ताह के बाद संक्रमण पर ट्यूमर शुरू अल्ट्रासाउंड छवियों में बी लाइनों के रूप में परिलक्षित होते हैं, जो गिना जा सकता है, लेकिन फेफड़ों पर मौजूद ट्यूमर की सही संख्या को प्रतिबिंबित नहीं करेगा । बी-लाइनों को फेफड़ों के परेंचिमा7,8में प्लीरल लाइन से उत्पन्न लेजर जैसी ऊर्ध्वाधर सफेद रेखाओं की विशेषता है। संक्रमण के 18 सप्ताह के बाद बड़े ट्यूमर की कल्पना की जा सकती है। इन ट्यूमर की सापेक्ष मात्रा अल्ट्रासाउंड पर किए गए 2डी माप से निर्धारित की जाती है।

यह विधि एलएसएल-KRAS G12D माउस मॉडल में फेफड़ों के ट्यूमर के विकास पर औषधीय दवाओं के प्रभाव की जांच कर रहे शोधकर्ताओं के लिए इष्टतम है। इसके अलावा, फेफड़ों के ट्यूमर प्रगति विभिन्न आनुवंशिक वंश के साथ चूहों के बीच तुलना की जा सकती है, फेफड़ों के ट्यूमर की मात्रा के विकास पर कुछ जीन/प्रोटीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति के महत्व की जांच करने के लिए ।

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Protocol

पशु अध्ययन मैकगिल विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के अनुसार किया गया था और प्रक्रियाओं को मैकगिल विश्वविद्यालय की पशु कल्याण समिति (पशु उपयोग प्रोटोकॉल # 2009-5754) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. CA2Cre-shp53 Lentiviral Titre की पीढ़ी

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल वही है जो ज़िया एट अल6में वर्णित है, मामूली संशोधनों के साथ।

  1. लेंटिवायरस की तैयारी (15 सेमी x 10 सेमी व्यंजन के लिए)
    1. 1 दिन पर, प्लेट स्वस्थ HEK293T कोशिकाओं (7.5 x 106 कोशिकाओं प्रति 10 सेमी पकवान) Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम के 10 mL के साथ) (DMEM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और 1% कलम/ 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में संस्कृति।
    2. कैल्शियम-फॉस्फेट ट्रांसफेक्शन (15 प्लेटों के लिए मिश्रण) के लिए मिश्रण तैयार करें। पीपीएएक्स2 प्लाज्मिड (एचआईवी-1 झूठ और एचआईवी-1 पोल जीन युक्त), pMD2.G प्लाज्मिड (वीएसवी-जी जीन युक्त) के लेंटिवायरल वेक्टर (Ca2Cre-shp53), 75 μg (5 μg/plate) से युक्त ट्यूब ए तैयार करें। सीएसीएल2 के 0.15 एम की अंतिम एकाग्रता और 3.75 मीटर तक आसुत एच2ओ के साथ ट्यूब भरें। 2x हेप्स-बफर्ड लवकुश (एचबीएस; 50 एमएम एचईपी, पीएच 7.05, 280 मीटर एनसीएल, 10 एमएम केसीएल, 1.5 एम एनए2एचपीओ4·2एच2ओ, और 12 एम डी-डेक्सट्रोस) के 3.75 मिलील वाले ट्यूब बी तैयार करें।
    3. भंवर ट्यूब ए और लगातार भंवर के तहत ट्यूब बी के लिए यह ड्रॉपवाइज जोड़ें ।
      नोट: कुल मात्रा 7.5 mL होगी।
    4. 20−30 न्यूनतम के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    5. कोशिकाओं को चढ़ाना के बाद लगभग 9 घंटे, ट्रांसफेक्शन मिश्रण के 500 माइक्रोन को सेल माध्यम (7.5 mL/15 व्यंजन: 0.5 mL प्रति डिश) में जोड़ें।
    6. मिश्रण करने के लिए प्रत्येक पकवान को धीरे-धीरे भंवर करें, और सभी व्यंजनों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें।
    7. 2 दिन, 12−18 घंटे ट्रांसफेक्शन के बाद, मीडिया को प्रति 10 सेमी डिश प्रति एंटीबायोटिक-मुक्त कम सीरम मीडिया(सामग्री की तालिका)के 10 एमएल के साथ प्रति दबी हुई जगह दें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में व्यंजन वापस रखें।
    8. तीसरे दिन, Ca2Cre-shp53 व्यक्त करने वाले लेंटिवायरस युक्त मीडिया को इकट्ठा करें और 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। ताजा एंटीबायोटिक मुक्त कम सीरम मीडिया के साथ मीडिया की भरपाई ।
      नोट: एकत्र मीडिया को 3 दिनों से अधिक नहीं के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
    9. 4 दिन पर, दूसरी बार, 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से लेंटिवायरस और फ़िल्टर युक्त मीडिया एकत्र करें। 4 डिग्री सेल्सियस (3 दिनों से अधिक समय तक) रखें।
    10. 1.1.8 और 1.1.9 चरणों से वायरस सुपरनेटेंट को मिलाएं। उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मीटर के लिए 1,372 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा अपकेंद्रिती फिल्टरइकाइयों (सामग्री की तालिका)के माध्यम से ध्यान केंद्रित करें। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी एकत्र किए गए मीडिया कॉलम से गुजरन न हो जाएं।
      नोट: प्रत्येक केंद्रीकरण के बाद, केंद्रित फिल्ट्रेट के 100−200 माइक्रोन काटा जा सकता है।
    11. इकट्ठा करें और एक 15 मिलील बर्फ ठंडट्यूब में केंद्रित छानदी हुई मिश्रण। केंद्रित लेंटिवायरस को अच्छी तरह से मिलाएं और फिर एलिकोट (जैसे, 100 माइक्रोन/ट्यूब)। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. लेंटिवायरल टिट्रेशन
    नोट: अमर माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) वायरल टिटर के परिमाणीकरण के लिए इस प्रोटोकॉल में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के एक लोक्सपी-फ्लैंक एलील को व्यक्त करते हैं। हालांकि, एक loxP-GFP allele के साथ किसी भी सेल लाइन इस कदम के लिए उपयुक्त होना चाहिए ।
    1. संस्कृति कोशिकाओं ने डीएमईएम के साथ जीएफपी के एक loxP-flanked एलील, 10% एफबीएस और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 1% पेन/स्ट्रीप के साथ एक loxP-flanked एलील व्यक्त की ।
    2. प्लेट 2 x 105 कोशिकाएं 6-कूकर प्लेट के दो 50 मिमी कुओं में।
      नोट: एक अच्छी तरह से कोशिकाओं को लेंटिवायरल संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, जबकि दूसरे की है कि एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
    3. अगले दिन, डीएमईएम के 2 mL, 10% एफबीएस, और लेंटिवायरल संक्रमण से पहले 1% पेन/स्ट्रीप 2 एच के साथ कोशिकाओं की भरपाई करें।
    4. लेंटिवायरल संक्रमण में सीए2क्री-shp53 लेंटिवायरस (जरूरत पड़ने पर मात्रा भिन्न हो सकती है) के 20 माइक्रोन जोड़ें।
    5. संस्कृति में 3 दिनों के बाद, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा क्रे-प्रेरित जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की आवृत्ति निर्धारित करें, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है। फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धोएं, ट्राइप्सिनाइजेशन द्वारा अलग करें और 112 x ग्रामपर अपन्तिफुगेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    6. कोशिकाओं को पीबीएस से दो बार धोएं। अंत में, पीबीएस के 100 माइक्रोन में कोशिकाओं को निलंबित करें। एक सेल एनालाइजर(सामग्रीकी तालिका) द्वारा GFP सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण करें ।
    7. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके लेंटिवायरस संक्रामक/कार्यात्मक टिटर की गणना करें:
      Equation 1
      जहां एफ GFP-सकारात्मक कोशिकाओं की आवृत्ति है और संक्रमण के बाद जीएफपी-सकारात्मक कोशिकाओं (Fi) की आवृत्ति को घटाकर की गणना संक्रमण से पहले (पृष्ठभूमि) जैसा कि फिगर 1 (एफ = फाई-एफसी) में दिखाया गया है, सीएन प्लेटेड कोशिकाओं की संख्या है (2 x 105),वी इनोकुलम (एमएल) की मात्रा है, और डीएफ वायरस डिल्यूट फैक्टर है।
      नोट: संक्रामक/कार्यात्मक एकाग्रता = ~ 2 x 106 टीयू/mL ।

2. एलएसएल-केआरएसजी12डी चूहों में लेंटिवायरस का इंट्राट्रेचिल इंटुबेशन

नोट: इंट्राट्रेचेल इंट्यूबेशन की विधि का उपयोग वनडिवोर्ट एट अल9द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, C57BL/6 पृष्ठभूमि में चूहों एलएसएल-KRASG12D चूहों का उपयोग 6−8 सप्ताह की उम्र में किया जाता है। एक घर में बने काम प्रक्रिया बोर्ड के रूप में Vandivort एट अल9में वर्णित है । बोर्ड एक सुविधाजनक कार्यक्षेत्र (लगभग 1 मीटर2)में प्रयोगकर्ता के सामने तैनात है।

  1. 1 मिलीआर सिरिंज के प्लंजर को हटाकर और पीबीएस के 60 माइक्रोन को सिरिंज में लोड करके स्पाइरोमीटर तैयार करें।
  2. सिरिंज में 22 ग्राम कैथेटर टिप संलग्न करें और अलग सेट करें।
  3. केटामाइन (50 मिलीग्राम/mL) /xylazine (5 मिलीग्राम/mL) /acepromazine (1 मिलीग्राम/mL) कॉकटेल के माउस शरीर के वजन के एक 1 μL/g के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें । कम श्वसन दर (हर 2 एस में 1 सांस) द्वारा माउस का उचित सेडेशन सुनिश्चित करें।
  4. एस्पिरेट 20 μL CA2Cre-shp53 लेंटिवायरस के एक पाइपेटर में और अलग सेट ।
  5. बोर्ड के धागे में अपने ऊपरी छेदक हुक िंग द्वारा काम प्रक्रिया बोर्ड पर sedated माउस स्थिति ।
    नोट: माउस का डोरसम मंच के खिलाफ सपाट होना चाहिए।
  6. प्रक्रिया के दौरान माउस के संरेखण को सुनिश्चित करने के लिए छाती गुहा के कौडल हिस्से को मंच पर टेप करें।
  7. 80−100% तीव्रता के बीच एक हंसनेक रोशनी समायोजित करें और त्वचा की सतह से प्रकाश 1−2 सेमी रखें।
  8. मंच के पीछे से, बाँझ संदंश का उपयोग करके माउस के मौखिक गुहा से जीभ को बाहर निकालें।
  9. जीभ को सुरक्षित करते समय, माउस के मौखिक गुहा में एक अवसादक डालें फिर जीभ छोड़ें।
  10. श्वासनली को रोशन करने के लिए मुख्य स्टेम ब्रोंची पर हंसनेक की स्थिति।
    नोट: श्वासनक श्वसन की कार्रवाई के माध्यम से दिखाई दे सकता है, जिससे प्रकाश में उतार-चढ़ाव होता है।
  11. जब श्वासनली को स्पष्ट रूप से देखा जाता है, तो स्पाइरोमीटर तैयार (पीबीएस और कैथेटर के साथ सिरिंज) को श्वासनली पथ में डालें।
  12. अवसाद को हटा दें और प्रत्येक सांस के साथ सिरिंज में पीबीएस के उदय और गिरावट का निरीक्षण करें।
    नोट: यह एक संकेतक है कि कैथेटर ठीक से श्वासनली में तैनात है।
  13. पिछली स्थिति के रूप में श्वासनलिया के अंदर कैथेटर को बनाए रखते हुए पीबीएस युक्त सिरिंज निकालें।
  14. कैथेटर के केंद्र में 20 μL CA2Cre-shp53 लेंटिवायरस जमा करें।
  15. कैथेटर को जगह में रखते हुए, फेफड़ों में लेंटिवायरस का उचित वितरण सुनिश्चित करने के लिए एक खाली सिरिंज का उपयोग करकैथेटर में हवा के 300 μL इंजेक्ट करें।
  16. कैथेटर को जगह में रखें और स्पाइरोमीटर को कैथेटर में फिर से डालें।
    नोट: पीबीएस बुलबुले का उदय और पतन यह सुनिश्चित करेगा कि प्रक्रिया सफल हो।
  17. कैथेटर और टेप निकालें। जानवर को गर्म और सूखी जगह पर तब तक रखें जब तक कि उसे पुनर्जीवित न कर दिया जाए।

3. चूहों में फेफड़ों के ट्यूमर की अल्ट्रासाउंड इमेजिंग

नोट: सामग्रीकी तालिका में सूचीबद्ध प्रणाली का उपयोग करके 7 और 18 सप्ताह की लेंटिवायरल इंट्यूबेशन के बाद अल्ट्रासाउंड इमेजिंग की गई थी ; हालांकि, विश्लेषण के लिए किसी भी मॉडल का उपयोग किया जा सकता है।

  1. इमेजिंग से एक दिन पहले, इंट्यूब्ड माउस के छाती क्षेत्र से फर निकालें।
    नोट: माउस को इस चरण के दौरान 3% आइसोफ्लोरीन और 2एल/मिनट ओ2के इंडक्शन चैंबर में रखकर दिया जाना चाहिए ।
  2. इमेजिंग के दिन, चित्रा 2में दिखाए गए कार्यक्षेत्र की स्थापना करें। अल्ट्रासाउंड जेल और तापमान मॉनिटर के लिए हीटिंग पंप चालू करें।
  3. चूहों को पोस्ट-इमेजिंग में रखने के लिए गर्म 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर स्थापित करें।
  4. एकीकृत रेल प्रणाली पर त्रि-आयामी (3डी) मोटर(चित्रा 2एफ)रखें।
  5. सुनिश्चित करें कि 3डी मोटर और ट्रांसड्यूसर बढ़ते सिस्टम सुरक्षित रूप से मौजूद हैं।
  6. एक पसंदीदा ट्रांसड्यूसर (आवृत्ति: 40 मेगाहर्ट्ज कनेक्ट करें; चित्रा 2ई और सामग्री की तालिका)ट्यूमर माप के लिए 3 डी मोटर के लिए लंबवत ।
  7. अल्ट्रासाउंड सॉफ्टवेयर पर एक नया अध्ययन शुरू करें।
    1. अध्ययन ब्राउज़रका चयन करें, फिर स्क्रीन के नीचे नया चुनें।
    2. नए अध्ययनका चयन करें, एक नई खिड़की दिखाई देगी जो अध्ययन के बारे में अधिक जानकारी के अलावा अध्ययन नाम के अलावा अध्ययन नाम को जोड़ने में सक्षम बनाती है, यानी अध्ययन की तारीख, शोधकर्ता का नाम आदि।
    3. सीरीज का नामयानी एनिमल आईडी, स्ट्रेन, वजन, जन्म तिथि आदि में जानकारी भरें।
    4. कियाका चयन करें, कार्यक्रम बी मोड के लिए बदल जाएगा।
  8. पशु मंच के ऊपर एक सुविधाजनक स्थिति में एक हीटिंग लैंप रखो।
  9. माउस को इंडक्शन चैंबर (3.5% आइसोफ्लोरीन) में रखें।
    नोट: उचित एनेस्थेटाइजेशन माउस की बेहोशी से पुष्टि की है, और प्रति 2 सेकंड लगभग 1 सांस की धीमी श्वसन दर।
  10. जब माउस को सेडेट किया जाता है, तो पशु मंच की ओर निर्देशित होने वाली एनेस्थेटिक मशीन का कनेक्शन बदलें, आइसोफ्लोरीन को 2.5% तक कम करें।
  11. माउस को डेक्यूबिटस वेंट्रल में पशु मंच पर रखें, इसकी मौखिक गुहा के साथ एनेस्थेटिक्स ट्यूब की ओर निर्देशित किया गया।
  12. माउस की आंखों पर स्नेहक लगाएं।
  13. माउस को डेक्यूबिटस पृष्ठीय में रखें और अपने हाथों और पैरों को जानवरों के मंच पर मजबूती से टेप करें।
  14. माउस छाती पर अल्ट्रासाउंड जेल की एक छोटी परत लगाएं।
  15. माउस छाती की सतह को छूने के लिए ऊंचाई नियंत्रण घुंडी का उपयोग कर अधिग्रहण जांच कम करें। जांच की स्थिति ऐसी है कि माउस का दिल लगभग केंद्रित है।
  16. ट्रांसवर्स ओरिएंटेशन में दोनों हाथ-पैरों से पूरी छाती की छवियां प्राप्त करने के लिए माइक्रो-नॉब्स का उपयोग करें, ट्रांसवर्स ओरिएंटेशन में आदर्श रूप से प्रति माउस 500 फ्रेम इकट्ठा किए गए (व्यक्तिगत पसंद के आधार पर फ्रेम की संख्या भिन्न हो सकती है)।
  17. एक बार इमेजिंग हो जाने के बाद, चूहे के सीने से जेल निकालें और माउस को गर्म इनक्यूबेटर में रखें।

4. अल्ट्रासाउंड छवियों का 2D विश्लेषण

  1. अल्ट्रासाउंड सॉफ्टवेयर पर अधिग्रहीत फ्रेम खोलने के बाद, ट्यूमर के लिए फ्रेम स्कैन।
  2. छोटे शुरू करने वाले ट्यूमर के लिए, प्राप्त 500 फ्रेम की पूरी लंबाई के लिए समय-समय पर बी-लाइनों की संख्या गिनें।
    इसलिए, बी-लाइनों को कुल 50 छवियों में गिना जाता है, प्रत्येक छवि को 10 फ्रेम से अलग किया जाता है। बी-लाइनों को देशाधिसातिक सफेद सीधी रेखाओं की विशेषता है जो पूरी तरह से स्क्रीन को पार करते हैं।
  3. बड़े ट्यूमर के 2डी माप के लिए, रैखिक उपकरण का चयन करें और मौजूद ट्यूमर की चौड़ाई और लंबाई को मापें।
  4. ट्यूमर की मात्रा की गणना करने के लिए, निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें:

    जहां एल और डब्ल्यू क्रमशः ट्यूमर की लंबाई और चौड़ाई हैं।

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Representative Results

~ 2 x 106 टीयू/एमएल(चित्रा 1)के लेंटिवायरल संक्रामक टिटर प्राप्त करने के बाद, Ca2Cre-shp53 लेंटिवायरस को इंट्राट्रैकी इंजेक्शन दिया गया था जब एलएसएल-KRAS G12D चूहों एक उचित आयु (6−8 सप्ताह)9तक पहुंच गया । अल्ट्रासाउंड इमेजिंग ट्यूमर की दीक्षा पर संक्रमण के 7 सप्ताह के बाद किया गया था(चित्रा 3बी)। इमेजिंग 7 सप्ताह में किया गया था ताकि एलएसएल-केआरएसG12D माउस मॉडल में होने वाले विभिन्न प्रकार के अग्रदूत घावों को शामिल किया जा सके, हाइपरप्लासिया से लेकर एडेनोमा3 तक, जैसा कि संक्रमण के 8 सप्ताह बाद चित्र4ए में दिखाया गया है। 6 सप्ताह से पहले इमेजिंग विश्लेषण3में एडेनोमा बनाने वाले ट्यूमर को शामिल करना सुनिश्चित नहीं करेगी। इन अग्रदूत घावों को अल्ट्रासाउंड में बी-लाइन के रूप में देखा जाता है और आंखों से गिना जा सकता है क्योंकि उन्हें स्क्रीन को लंबवत रूप से सफेद प्रकाश के संकीर्ण बीम के रूप में पहचाना जा सकता है और अल्ट्रासाउंड तरंग(चित्रा 3बी)10के मजबूत प्रतिबिंब का परिणाम है। बी-लाइनें छोटे ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करती हैं जो फेफड़ों की सतह पर हैं; फेफड़े की गहरी संरचनाओं में शुरू किए जा रहे ट्यूमर जैसे श्वासनली के करीब बी-लाइनों के रूप में परिलक्षित नहीं होंगे। प्लीर की सतह पर शुरू किए जा रहे ट्यूमर की संख्या को बी-लाइनों की गिनती करके निर्धारित किया जा सकता है, क्योंकि वे मात्रा मापन के लिए बहुत छोटे हैं। हमने 5 चूहों में पूर्ण फेफड़ों के क्षेत्र में फैले 500 फ्रेम का अधिग्रहण किया। बी लाइनों हर 10 फ्रेम गिना गया; इस प्रकार, उन्हें प्रति माउस कुल 50 छवियों में गिना जाता था जो पूर्ण 500 फ्रेम प्राप्त होते हैं। चित्रा 3डी में स्कैटर प्लॉट 5 चूहों के लिए हर 10 छवियों (100 फ्रेम) में गिने जाने वाले बी-लाइनों का योग दिखाता है। इसके बाद प्रति माउस बी-लाइनों की संख्या को पूरे फेफड़ों के क्षेत्र में मौजूद बी-लाइनों को शामिल करने के लिए अभिव्यक्त किया जाता है । पांच चूहों में ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करने वाली बी-लाइनों की औसत मात्रा 141.6 ± 41.52(चित्रा 3ई)थी। चित्रा 3ए तुलना के लिए गैर-संक्रमित माउस फेफड़ों की अधिग्रहीत अल्ट्रासाउंड छवि दिखाता है।

जैक्सन एट अल के अनुसार3,16 सप्ताह के बाद intubation adenoma के रूप में के रूप में अच्छी तरह से adenocarcinoma, जो KRAS फेफड़ों के कैंसर में रुचि के ट्यूमर प्रकार हैं शामिल हैं । हमारे मॉडल में अल्ट्रासाउंड के माध्यम से मात्रा माप का विश्लेषण करते समय ट्यूमर के इन प्रकार के शामिल किए जाने को सुनिश्चित करने के लिए, हमने संक्रमण के बाद 18 सप्ताह में चूहों के फेफड़ों को चित्रित किया। अल्ट्रासाउंड के माध्यम से बड़े ट्यूमर की मात्रा को निर्धारित करने के लिए, हमने अल्ट्रासाउंड सॉफ्टवेयर पर 2D विश्लेषण का उपयोग किया। बड़े ट्यूमर चित्रा 3सीकी छवि में दिखाए गए प्लीरसतह को बाधित करने वाले गहरे फांक के रूप में दिखाई देते हैं। जब एक ट्यूमर देखा जाता है, हम अल्ट्रासाउंड सॉफ्टवेयर के माप उपकरण का उपयोग कर, ट्यूमर की लंबाई (एल) और चौड़ाई (डब्ल्यू) को मापने । एक बार प्राप्त होने के बाद, एल और डब्ल्यू को ट्यूमर की मात्रा (प्रोटोकॉल चरण 4.4) की गणना के लिए उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक सूत्र में लागू किया जाता है। हमने 10 चूहों के ट्यूमर की मात्रा का विश्लेषण किया, जैसा कि चित्रा 3एफमें दिखाया गया है, जहां प्रत्येक माउस में बनने वाले ट्यूमर की संख्या 5 से 26 ट्यूमर तक थी। माउस प्रति गठित सभी ट्यूमर की मात्रा तो माउस प्रति ट्यूमर की मात्रा का प्रतिनिधित्व करने के लिए अभिव्यक्त कर रहे हैं । इस विश्लेषण के लिए, हम मानते हैं कि चूहों के फेफड़ों में बनने वाले ट्यूमर आकार में मिर्गी के होते हैं, इस प्रकार ट्यूमर की चौड़ाई इमेजिंग विमान के लंबवत माना जाता है। जब ट्यूमर का रैखिक आकार 0.3 मिमी (या तो लंबाई या चौड़ाई) तक पहुंचता है तो सापेक्ष मात्रा मात्रा निर्धारितीकरण किया जा सकता है। 10 चूहों के फेफड़ों के परेंचिमा का विश्लेषण करने के बाद, प्राप्त औसत ट्यूमर की मात्रा 31.8 ± 6.61 मिमी3 (चित्रा 3जी)थी। फेफड़ों के वर्गों पर हेमैटोक्सिलिन और इओसिन (एच एंड ई) धुंधला विश्लेषण ने संक्रमण के बाद 20 सप्ताह(चित्रा 4बी)में बड़े ट्यूमर के गठन की पुष्टि की और एडेनोमा और एडेनोकार्सिनोमा के गठन की पुष्टि की। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ट्यूमर विकास की प्रगति के रूप में, विभिन्न ट्यूमर बड़े लोगों के रूप में एक साथ विलय हो सकता है, जैसा कि चित्रा 4बीमें दिखाया गया है। हालांकि अल्ट्रासाउंड सॉफ्टवेयर ट्यूमर के 3 डी विश्लेषण की अनुमति देता है, विश्लेषण के इस प्रकार के हमारे मॉडल में मुश्किल साबित हुआ, मुख्य रूप से प्राथमिक ट्यूमर का गठन है कि फेफड़ों फिसलने (श्वसन के साथ प्ल्यर लाइन के आंदोलन) के साथ ही हृदय धड़कताहै 11के साथ संगत है के उच्च गतिशील आंदोलन के कारण । हमने तर्क दिया कि 2डी विश्लेषण सापेक्ष ट्यूमर मात्रा माप न होने में स्थिरता प्रदान करेगा, खासकर जब चूहों के विभिन्न समूहों के बीच फेफड़ों के ट्यूमर की प्रगति की तुलना की जाएगी।

Figure 1
चित्रा 1: जीएफपी लोक्सपी-एलील के साथ एमईएफ का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री छवियां जीएफपी-सकारात्मक एमईएफ की आवृत्ति दिखाती हैं जो गैर-संक्रमित (एफसी)(ए)और संक्रमित (फाई) Ca2Cre-shp53 लेंटिवायरस(बी)के साथ हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अल्ट्रासाउंड इमेजिंग की एकीकृत रेल प्रणाली का कार्यक्षेत्र। (A)एक्स-एक्सिस माइक्रो-नॉब। (ख)वाई-एक्सिस माइक्रो-नॉब । (ग)पशु मंच। (D)स्कैन हेड-प्रोब की ऊंचाई नियंत्रण घुंडी । (ई)ट्रांसड्यूसर। (एफ)3डी मोटर। (जी)हीटिंग लैंप। (एच)एनेस्थेटिक्स ट्यूब। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फेफड़ों के ट्यूमर प्रेरण से पहले और बाद में माउस फेफड़ों की प्रतिनिधि अल्ट्रासाउंड छवियां। (क)एक गैर संक्रमित माउस फेफड़ों के खंड की छवि। लाल तीर फेफड़ों की पसलियों (आर) और प्लीर सरफेस (पीएस) की ओर इशारा करते हैं। (ख)लेंटिवायरस के इंट्राट्रेचेल इंटुबेशन द्वारा ट्यूमर इंडक्शन के 7 सप्ताह बाद माउस फेफड़े की छवि। तीर फेफड़ों की सतह पर छोटे ट्यूमर को दर्शाती बी-लाइनों का संकेत देते हैं। (C)ट्यूमर प्रेरण के 18 सप्ताह बाद माउस फेफड़ों की धारा की छवि। नीली रेखाएं दिखाए गए ट्यूमर की लंबाई (एल: मिमी) और चौड़ाई (डब्ल्यू: मिमी) के माप ों का संकेत देती हैं। (D)500 फ्रेम में फैले 10 चित्रों में बी-लाइन क्वांटिफिकेशन दिखाते हुए स्कैटर प्लॉट (प्रत्येक छवि 10 फ्रेम से अलग है)। (ई)इंडक्शन के बाद 7 सप्ताह में फेफड़ों में सापेक्ष ट्यूमर संख्या का परिमाणीकरण। (एफ)स्कैटर प्लॉट जिसमें संक्रमण के बाद 18 सप्ताह में 10 चूहों के फेफड़ों में बने विभिन्न ट्यूमर की सापेक्ष मात्रा दिखाई गई है। (जी)चूहों में फेफड़ों के ट्यूमर की मात्रा का परिमाणीकरण (एन = 10)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एलएसएल-KRAS G12D फेफड़ों के वर्गों के प्रतिनिधि एच एंड ई धुंधला। (A)500 माइक्रोन आवर्धन पर संक्रमण के बाद 8 सप्ताह में फेफड़ों का सेक्शन। इस टाइमपॉइंट पर बनने वाले अग्रदूत घावों पर तीर बिंदु, जो अल्ट्रासाउंड में बी-लाइनके रूप में परिलक्षित होते हैं। काले तीर 60 माइक्रोन पर बढ़ाया घावों पर बिंदु।(बी)फेफड़े अनुभाग 2मिमी आवर्धन पर संक्रमण के बाद 20 सप्ताह में। एक ही रंग के एरोहेड अलग-अलग ट्यूमर दिखाते हैं जो एक साथ विलय हो गए हैं। तीर 60 माइक्रोन पर बढ़ाया ट्यूमर दिखाते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

हम एक विधि प्रदर्शित करते हैं जो अल्ट्रासाउंड द्वारा क्रे-इंड्यूबल एलएसएल-क्रास जी12डी माउस मॉडल में फेफड़ों के ट्यूमर के विकास का आकलन कर सकती है। इस विधि का उपयोग फेफड़ों के ट्यूमर के विकास पर औषधीय अवरोधकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। यह भी विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चूहों के बीच फेफड़ों के ट्यूमर के विकास की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करने के लिए विशेष कम्प्यूटेशनल कौशल की आवश्यकता नहीं होती है, हालांकि, विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्रेम की संख्या में व्यवस्थित होना महत्वपूर्ण है ताकि चूहों के विभिन्न समूहों की तुलना के लिए विधि का उपयोग उचित तुलना करने की अनुमति दी जा सके।

एलएसएल-केआरएस जी12डी चूहों में ~ 2 x 106 टीयू/एमएल Ca2Cre-shp53 के इंट्राट्राचेल इंटुबेशन ने 7 हफ्तों के संक्रमण के बाद अग्रदूत घावों के गठन का नेतृत्व किया । ये सोनोग्राफिक छवियों पर देशीयकृत सफेद रेखाओं के रूप में दिखाई देते हैं और इन्हें बी-लाइन(चित्र 3बी)12कहा जाता है। प्रति माउस बी-लाइनों की औसत संख्या 141.6 ± 41.52(चित्रा 3ई)थी। हमने संक्रमण के बाद 7 सप्ताह में ट्यूमर शुरू करने की कल्पना करने का फैसला किया क्योंकि इस टाइमपॉइंट में विभिन्न प्रकार के अग्रदूत घाव शामिल होंगे; एठेठ एडेनोमैटस हाइपरप्लासिया, एपिथेलियल हाइपरप्लासिया और एडेनोमा3. फेफड़ों पर अग्रदूत घावों के गठन को 8 सप्ताह के लेंटिवायरल संक्रमण(चित्र4ए)के बाद एच एंड ई धुंधला द्वारा सत्यापित किया गया था। वायरल इंटुबशन के 18 हफ्तों के बाद, ट्यूमर अल्ट्रासाउंड सॉफ्टवेयर(चित्रा 3सी)में 2डी वॉल्यूम मापकी अनुमति देने के लिए काफी बड़े हैं। अच्छी तरह से विकसित एडेनोमा और एडेनोकार्सिनोमा3के परिमाणीकरण को शामिल करने के लिए अल्ट्रासाउंड छवियों का विश्लेषण 18 सप्ताह के समय बिंदु पर किया गया था। इस प्रकार के ट्यूमर के गठन की पुष्टि एच एंड ई धुंधला विश्लेषण(चित्रा 4बी)द्वारा संक्रमण के बाद 20 सप्ताह में की गई थी। अल्ट्रासाउंड सॉफ्टवेयर द्वारा 3डी वॉल्यूम माप भी संभव हैं लेकिन उच्च स्तर की विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित टिट्रे फेफड़ों के ट्यूमर के गठन के लिए इष्टतम है जिसे 2डी में ठीक से कल्पना और मात्रानिर्धारित किया जा सकता है।

अन्य इमेजिंग तकनीकों का उपयोग चूहों में फेफड़ों के ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए भी किया जा सकता है, जैसे सीटी इमेजिंग और BLI13। हालांकि, सीटी इमेजिंग ट्यूमर के लिए एक विकिरण खुराक देने की आवश्यकता है, जो दोहराया परख13पर ट्यूमर के विकास को प्रभावित कर सकता है । इसके अलावा, यह सटीक ट्यूमर माप13के लिए विपरीत एजेंटों के उपयोग की आवश्यकता है । BLI एक महत्वपूर्ण इमेजिंग तकनीक है जिसका उपयोग अक्सर ट्यूमर प्रसार को मात्रा देने के लिए किया जाता है; हालांकि, इसकी मुख्य सीमा मेटाबोलिक गतिविधियों पर अपनी निर्भरता और एटीपी और ओ213की उपस्थिति है . अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का लाभ यह फेफड़ों परेंचिमा13की छवियों को प्राप्त करने के लिए एक गैर-आक्रामक, गैर-विकिरण, त्वरित और सस्ती तकनीक होने के नाते निहित है। अल्ट्रासाउंड का उपयोग पहले13,14चूहों के फेफड़ों और अग्न्याशय में किए गए ऑर्थोटोपिक ह्यूमन ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए किया गया है । रईस एट अल अल्ट्रासाउंड13के माध्यम से चूहों में पीछे डायाफ्रामिक सतह के पास प्रत्यारोपित एक मानव फेफड़ों के ट्यूमर के विकास की देशीयरूपसे निगरानी में सफल रहा है । एलएसएल-KRAS G12D माउस मॉडल में अंतर फेफड़ों के ट्यूमर का सहज विकास हो रहा है जिसे दीक्षा से प्रगति तक निगरानी की जा सकती है और इस विकास की तुलना चूहों समूहों के बीच की जा सकती है। इसके अलावा, एलएसएल-क्रास G12D माउस मॉडल के फेफड़ों पर कई ट्यूमर विकसित किए जा रहे हैं, जो अंततः बढ़ते हैं, और बड़े ट्यूमर बनाने के लिए एक साथ विलय भी कर सकते हैं(चित्रा 4बी)। यह एक विधि है कि फेफड़ों के ट्यूमर दीक्षा और इस माउस मॉडल में प्रगति की निगरानी कर सकते है का उपयोग करने की जरूरत का आग्रह किया । हमने इस माउस मॉडल में विकसित फेफड़ों के ट्यूमर के मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए 2डी ब्राइटनेस (बी) मोड विश्लेषण को अनुकूलित किया।

अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के साथ एक संभावित सीमा झूठी सकारात्मक15की उपस्थिति है । ये तब देखे जाते हैं जब एक अत्यधिक चिंतनशील सतह मौजूद होती है (डायाफ्राम या यकृत) जो बीम के प्रक्षेपवक्र में बाधा डालती है और एक वास्तविक वस्तु15की नकल करने वाली आभासी वस्तु बना सकती है। ऐसी छवियां झूठी ट्यूमर हो सकती हैं लेकिन उचित परीक्षा पर नजरअंदाज की जा सकती हैं; एक बड़ा ट्यूमर आमतौर पर गतिशील होता है जबकि एक आभासी वस्तु स्थिर होगी।

एलएसएल-केआरएस माउस मॉडल के लिए अल्ट्रासाउंड इमेजिंग इस तकनीक की गैर-आक्रामक प्रकृति के कारण आदर्श है। एलएसएल-KRAS माउस मॉडल में फेफड़ों के ट्यूमर की प्रगति की निगरानी के लिए हमारी प्रयोगशाला में उपयोग किए जाने वाले विश्लेषण की विधि तेज और उपयोगकर्ता के अनुकूल है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम लेंटिवायरल Ca2Cre-shp53 वेक्टर के लिए डॉ आई वर्मा को धन्यवाद देते हैं । इस काम को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (सीएचआर एमओपी 137113) से एईके को धन द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm Acrodisc Syringe Filters Pall Corporation PN 4614
100-mm Cell Cultre Plate CELLSTAR 664 160
6-well Cell Culture Plate CELLSTAR 657 160
Amicon Ultra - 15 Centrifugal Filter Units Merck Millipore Ltd. UFC910024
BD LSR-Fortessa BD Biosciences 649225B 3024
CA2Cre-shp53 lentiviral vector From Dr. I Verma Laboratory
DMEM Multicell 319-005-CL
FBS Multicell 80450
LSL-KRASG12D mouse JAX Mice 8179
MX550S; Centre Transmit: 40 MHz FUJIFILM VisualSonics 51070
OptiMEM gibco 11058-021
Pen/strep Multicell 450-201-EL
pMD2.G Addgene 12259
PsPAX2 Addgene 12260
VEVO-3100 FUJIFILM VisualSonics 51072-50

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १५६ फेफड़ों के कैंसर LSL-KRAS G12D माउस मॉडल अल्ट्रासाउंड इमेजिंग 2डी मात्रा मात्रा मात्रा ट्यूमर गठन बी मोड
अल्ट्रासाउंड इमेजिंग द्वारा चूहों में फेफड़ों के ट्यूमर प्रगति का पता लगाना
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Ghaddar, N., Wang, S., Michaud, V.,… More

Ghaddar, N., Wang, S., Michaud, V., Kazimierczak, U., Ah-son, N., Koromilas, A. E. Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging. J. Vis. Exp. (156), e60565, doi:10.3791/60565 (2020).

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