Summary
Detta protokoll beskriver de åtgärder som vidtagits för att inducera KRAS lungtumörer hos möss samt kvantifiering av bildade tumörer genom ultraljudsavbildning. Små tumörer visualiseras i tidiga timepoints som B-linjer. Vid senare tidpunkter uppnås relativa tumörvolymmätningar genom mätverktyget i ultraljudsprogrammet.
Abstract
Med ~ 1,6 miljoner offer per år, bidrar lungcancer oerhört till den globala bördan av cancer. Lungcancer drivs delvis av genetiska förändringar i onkogener som KRAS oncogene, som utgör ~ 25% av lungcancer fall. Svårigheten att terapeutiskt rikta KRAS-driven lungcancer beror delvis på att ha dåliga modeller som kan efterlikna utvecklingen av sjukdomen i labbet. Vi beskriver en metod som tillåter relativ kvantifiering av primära KRAS lungtumörer i en Cre-inducerad LSL-KRAS G12D mus modell via ultraljud imaging. Denna metod bygger på ljusstyrka (B)-mode förvärv av lungparenkymen. Tumörer som ursprungligen bildas i denna modell visualiseras som B-linjer och kan kvantifieras genom att räkna antalet B-linjer som finns i de förvärvade bilderna. Dessa skulle representera det relativa tumörnumret som bildas på ytan av muslungan. Som de bildade tumörer utvecklas med tiden, de uppfattas som djupa klyftor inom lungparenkymen. Eftersom omkretsen av den bildade tumören är väl definierad, beräkna den relativa tumörvolymen uppnås genom att mäta längden och bredden på tumören och tillämpa dem i formeln som används för tumör bromsok mätningar. Ultraljud imaging är en icke-invasiv, snabb och användarvänlig teknik som ofta används för tumör kvantifieringar hos möss. Även artefakter kan visas när du får ultraljud bilder, har det visat sig att denna bildteknik är mer fördelaktigt för tumör kvantifieringar hos möss jämfört med andra bildtekniker såsom datortomografi (CT) bildbehandling och bioluminescensavbildning (BLI). Forskare kan undersöka nya terapeutiska mål med hjälp av denna teknik genom att jämföra lungtumör initiering och progression mellan olika grupper av möss.
Introduction
Som den främsta orsaken till cancerrelaterade dödsfall över hela världen, lungcancer är fortfarande eldfasta till behandlingar, främst på grund av brist på relevanta prekliniska modeller som kan sammanfatta sjukdomen i labbet1. Omkring 25% av lungcancer fall beror på mutationer i KRAS oncogene2. KRAS-driven lungcancer är ofta förknippad med dålig prognos och låg reaktion på terapi, belyser vikten av ytterligare studier i denna sjukdom2.
Vi optimerade en metod som möjliggör relativ utvärdering av lungtumörtillväxt i realtid i KRAS lungcancer-inducerad immun-kompetentmöss. Vi använder Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) möss där KRAS G12D oncogene kan uttryckas av Cre lentivirala vektorer3,4. Dessa vektorer drivs av kolsyraanhydras 2, vilket gör att virusinfektion en exakt i alveolar epitelceller5. Dessutom, för att påskynda inledande och progression av lungtumörer, den lentivirala konstruktionen uttrycker också P53 shRNA från en U6/H1 promotor (den lentivirala konstruktionen häri kommer att kallas Ca2Cre-shp53)6. Den biologiska relevansen av denna metod ligger i den naturliga kursen av lungtumörutveckling hos möss i motsats till xenografts av icke-ortopediska tumörer hos möss. Ett hinder med hjälp av ortopediska metoden är att övervaka lungtumör tillväxt utan att offra musen. För att övervinna denna begränsning optimerade vi ultraljudsavbildning för att möjliggöra analys av lungtumörprogression i tvådimensionellt (2D) läge i denna musmodell. Initiera tumörer vid 7 veckor efter infektion återspeglas som B-linjer i ultraljud bilder, som kan räknas, men kommer inte att återspegla det exakta antalet tumörer som finns på lungan. B-linjer kännetecknas av laser-liknande vertikala vita linjer som härrör från pleura linjen i lungparenkymen7,8. Stora tumörer kan visualiseras efter 18 veckors infektion. Den relativa volymen av dessa tumörer kvantifieras av 2D-mätningar gjorda på ultraljud.
Denna metod är optimal för forskare som undersöker effekten av farmakologiska läkemedel på lungtumörtillväxt i LSL-KRAS G12D-musmodellen. Dessutom kan lungtumörprogression jämföras mellan möss med olika genetiska härstamningar, för att undersöka vikten av närvaron eller frånvaron av vissa gener/proteiner på utvecklingen av lungtumörvolym.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstudier utfördes i enlighet med Kommittén för institutionsdjursvård och användning (IACUC) vid McGill University och förfaranden godkändes av Kommittén för djurskydd vid McGill University (djuranvändningsprotokoll # 2009-5754).
1. Generation av CA2Cre-shp53 Lentiviral Titre
OBS: Följande protokoll är detsamma som det som beskrivs i Xia et al.6, med mindre ändringar.
- Beredning av lentivirus (för 15 cm x 10 cm rätter)
- På dag 1, platta friska HEK293T celler (7,5 x 106 celler per 10 cm maträtt) med 10 ml Dulbecco modifierade Eagle medium) (DMEM), 10% fetala nötkreatur serum (FBS), och 1% penna / strep. Kultur i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Förbered blandningen för kalciumfosfattransfection (blandning för 15 plattor). Preparera rör A som innehåller 225 μg (15 μg/platta) av den lentivirala vektorn (Ca2Cre-shp53), 75 μg (5 μg/platta) av PsPAX2 plasmid (innehållande HIV-1 gag och HIV-1 pol gener), 75 μg (5 μg/platta) av pMD2.G plasmid (som innehåller VSV-G gen) för förpackning, en slutlig koncentration på 0,15 M cacl2 och fyll röret med destillerat H2O upp till 3,75 ml. Förbered rör B som innehåller 3,75 ml 2x HEPES-buffrad koks (HBS; 50 mM HEPES, pH 7,05, 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4·2H2O och 12 mM D-dextros).
- Vortex rör A och tillsätt det dropwise till röret B under kontinuerlig virvlande.
DEN TOTALA volymen blir 7,5 ml. - Inkubera vid rumstemperatur i mörkret i 20−30 min.
- Ca 9 h efter plätering av cellerna, tillsätt 500 μl av transfection blandningen dropwise i cellmediet (7,5 ml/15 rätter: 0,5 ml per maträtt).
- Snurra försiktigt varje maträtt för att blanda, och inkubera alla rätter vid 37 °C, 5% CO2.
- Dag 2, 12−18 h efter transfection, ersätt media med 10 ml antibiotikafria reducerade serummedier (Table of Materials) per 10 cm maträtt. Placera rätter tillbaka i 37 °C, 5% CO 2-inkubator.
- Dag 3, samla in media som innehåller lentivirus som uttrycker Ca2Cre-shp53 och filtrera genom 0,45 μm filter. Fyll på media med färska antibiotikafria reducerade serummedia.
OBS: Det insamlade mediet kan förvaras vid 4 °C i högst 3 dagar. - Dag 4, samla in, för andra gången, samlar mediet som innehåller lentivirus och filtrerar genom ett 0,45 μm filter. Förvaras vid 4 °C (i högst 3 dagar).
- Kombinera viruset supernatants från steg 1.1.8 och 1.1.9. Koncentrera dem genom centrifugalfilterenheter(Materialbord)genom centrifugering vid 1 372 x g i 30 min vid 4 °C. Upprepa processen tills alla insamlade medier har passerat kolumnerna.
OBS: Efter varje centrifugering kan 100−200 μl koncentrerad filtrate skördas. - Samla in och blanda koncentrerade filtrat i ett iskallt rör på 15 ml. Blanda de koncentrerade lentivirusen väl och sedan aliquot (t.ex. 100 μL/ rör). Förvaras vid -80 °C.
- Lentiviral titrering
OBS: Immortalized mus embryonalfibroblaster (MEFs) uttrycker en loxP-flankerad allel av grönt fluorescerande protein (GFP) används i detta protokoll för kvantifiering av viral titer. Alla cellinje med en loxP-GFP-allel bör dock vara lämplig för detta steg.- Kulturceller som uttrycker en loxP-flankerad allel av GFP med DMEM, 10% FBS och 1% penna /strep vid 37 °C, 5% CO2.
- Platta 2 x 105 celler i två 50 mm brunnar av en 6-brunnsplatta.
OBS: Cellerna i en brunn kommer att användas för linsinfektion medan den andra kommer att användas som en negativ kontroll. - Nästa dag fyller du på cellerna med 2 ml DMEM, 10% FBS och 1% penna/strep 2 h före lentiviral infektion.
- Tillsätt 20 μL av CA2Cre-shp53 lentivirus (volymen kan variera vid behov) i den lentivirala infektionen väl.
- Efter 3 dagar i kultur, bestämma frekvensen av Cre-inducerad GFP-positiva celler genom flöde cytometri, som visas i figur 1. Tvätta celler med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), lossna genom trypsinisering och samla celler genom centrifugering vid 112 x g.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS. Slutligen, avbryta cellerna i 100 μL pbs. Bestäm procentandelen GFP-positiva celler av en cellanalysator (Materialtabell).
- Beräkna lentivirus infektion/ funktionell titer med hjälp av följande formel:
Där F är frekvensen av GFP-positiva celler och beräknas genom att subtrahera frekvensen av GFP-positiva celler efter infektion (Fi) från frekvensen av GFP-positiva celler (bakgrund) före infektion (Fc) som visas i figur 1 (F = Fi-Fc), är Cn antalet pläterade celler (2 x 105),V är volymen av inokulär (mL) och DF är virusutspädningsfaktorn.
OBS: Den infektiösa/ funktionella koncentrationen = ~2 x 106 TU/ml.
2. Intratracheal Intubation av lentivirus i LSL-KRASG12D Möss
OBS: Metoden för intratracheal intubation användes enligt beskrivningen i det publicerade protokollet av Vandivort et al.9. I detta protokoll används möss LSL-KRASG12D-möss i C57BL/6-bakgrund vid 6−8 års ålder. En hemmagjord arbetsprocedurbräda används enligt beskrivningen i Vandivort et al.9. Styrelsen är placerad framför experimentören i en bekväm arbetsyta (ca 1 m2).
- Förbered en spirometer genom att ta bort kolven på en 1 ml spruta och lasta 60 μl PBS i sprutan.
- Fäst en 22 G kateterspets i sprutan och ställ åt sidan.
- Bedövningsmedel mössen genom intraperitoneal injektion av en 1 μL/g mus kroppsvikt av ketamin (50 mg/mL)/xylazine (5 mg/mL)/acepromazine (1 mg/mL) cocktail. Säkerställa korrekt sedering av musen med låg andningsfrekvens (1 andetag varannan).
- Aspirera 20 μL CA2Cre-shp53 lentivirus i en pipettor och ställ åt sidan.
- Placera den sövda musen på arbetsproceduren ombord genom att haka in dess övre framtänder i brädets tråd.
OBS: Musens dorsum bör vara platt mot plattformen. - Tejpa caudaldelen av brösthålan till plattformen för att säkerställa att musen är justerad under proceduren.
- Justera en krushalsilluminator mellan 80−100% intensitet och placera ljuset 1−2 cm från hudytan.
- Bakom plattformen, dra tungan ur munhålan i musen med sterila pincett.
- Samtidigt som tungan säkras, sätt in en tryckdämpare i musens munhåla och släpp sedan tungan.
- Placera gåshalsen på huvudstammen bronk att belysa luftstrupe.
OBS: Luftstrupen kan synas genom andning, vilket orsakar fluktuationer i ljuset. - När luftstrupen är tydligt synlig, sätt in spirometerberedd (spruta med PBS och kateter) i trakealbanan.
- Ta bort tryckpressor n och observera uppgång och fall av PBS i sprutan med varje andetag.
OBS: Detta är en indikator på att katetern är ordentligt placerad i luftstrupen. - Ta bort sprutan som innehåller PBS samtidigt som katetern bibehålls i luftstrupen som föregående position.
- Sätt in 20 μL CA2Cre-shp53 lentivirus i mitten av katetern.
- Injicera 300 μL luft i katetern med en tom spruta för att säkerställa korrekt fördelning av lentivirus i lungorna.
- Håll katetern på plats och sätt in spirometern i katetern igen.
OBS: Uppgång och fall av PBS bubblan kommer att se till att förfarandet lyckas. - Ta bort katetern och tejpen. Placera djuret på en varm och torr plats tills det återupplivas.
3. Ultraljud Imaging av lungtumörer hos möss
OBS: Ultraljud imaging utfördes efter 7 och 18 veckor av lentiviral intubation med hjälp av det system som anges i Table of Materials; Alla modeller kan dock användas för analysen.
- En dag före bildbehandling, ta bort päls från bröstet området i den intubated musen.
OBS: Musen ska sövas under detta steg genom att placera dem i en induktionskammare på 3% isofluran och 2L/minut O2. - På dagen för bildbehandling ställer du in arbetsytan enligt figur 2. Slå på värmepumpen för ultraljudgel och temperaturmonitorn.
- Ställ in en varm 33 °C-inkubator för att placera mössen i efterbild.
- Placera den tredimensionella (3D) motorn(figur 2F)på det integrerade järnvägssystemet.
- Se till att 3D-motorn och givarens monteringssystem är ordentligt på plats.
- Anslut en önskad givare (frekvens: 40 MHz; Figur 2E och Materialbord) för tumörmätningar vinkelrätt mot 3D-motorn.
- Starta en ny studie om ultraljudsprogrammet.
- Välj Studiewebbläsareoch välj sedan Nytt längst ned på skärmen.
- Välj ny studie, ett nytt fönster kommer att visas som möjliggör tillägg av ett studienamn utöver ytterligare information om studien, dvs datum för studien, namn forskare, etc.
- Fyll i informationen i serienamn, dvs.
- Välj Klar,programmet ändras för B-läge.
- Sätt en värmelampa i ett bekvämt läge ovanför djurplattformen.
- Placera musen i induktionskammaren (3,5 % isofluran).
OBS: Korrekt anestesi bekräftas av medvetslöshet av musen, och långsammare andningsfrekvens på cirka 1 andetag per 2 sekunder. - När musen är sövd, ändra anslutningen av bedövningsmaskinen som ska riktas mot djurplattformen, minska isofluran till 2,5%.
- Placera musen på djurplattformen i decubitus ventral, med munhålan riktad mot bedövningsröret.
- Applicera smörjmedel på musens ögon.
- Placera musen i decubitus dorsala och tejpa sina händer och fötter stadigt på djurplattformen.
- Applicera ett litet lager ultraljudgel på musbröstet.
- Sänk förvärvssonden med höjdkontrollratten för att vidröra muskistans yta. Placera sonden så att musens hjärta är ungefär centrerat.
- Använd mikroknopparna för att hämta bilder av hela bröstet, från båda extremiteterna, i tvärgående orientering som helst samlar 500 bildrutor per mus (antalet bildrutor kan variera beroende på personligt val).
- När bildbehandling är klar, ta bort gelen från musens bröst och placera musen i den varma inkubatorn.
4. 2D-analys av ultraljudsbilder
- Efter att ha öppnat förvärvade ramar på ultraljudsmjukvaran, skanna ramarna för tumörer.
- För små initieratumörer, räkna antalet B-linjer regelbundet var 10 bildrutor för hela längden på de 500 ramar som förvärvats.
Därför räknas B-linjer i totalt 50 bilder, varje bild avgränsas med 10 bildrutor. B-linjer kännetecknas av längsgående vita raka linjer helt korsar skärmen. - För 2D-mätningar av stora tumörer, välj det linjära verktyget och mät bredden och längden på tumören närvarande.
- För att beräkna volymen av tumörer, använd följande formel:
där L och W är tumörens längd och bredd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter att ha fått en lentiviral smittsam titer på ~2 x 106 TU/ml (figur 1), injicerades Ca2Cre-shp53 lentivirus intratracheally när LSL-KRAS G12D möss nådde en lämplig ålder (6−8 veckor)9. Ultraljudsbild utfördes efter 7 veckors infektion vid initiering av tumörer (figur 3B). Imaging gjordes vid 7 veckor för att inkludera de olika typer av prekursor skador som förekommer i LSL-KRASG12D mus modell, allt från hyperplasi till adenom3 som visas i figur 4A efter 8 veckors infektion. Imaging tidigare än 6 veckor kommer inte att säkerställa införandet av adenombildande tumörer i analysen3. Dessa prekursor skador visualiseras som B-linjer i ultraljud och kan räknas av ögat eftersom de kan identifieras som smala strålar av vitt ljus vertikalt korsar skärmen och är resultatet av en stark återspegling av ultraljud våg(Figur 3B)10. B-linjer representerar små tumörer som finns på lungornas yta; tumörer som initieras i djupare strukturer i lungan såsom nära luftstrupen kommer inte att återspeglas som B-linjer. Antalet tumörer som initieras på pleuraytan kan kvantifieras genom att räkna B-linjerna, eftersom de är för små för volymmätningar. Vi förvärvade 500 ramar som spänner över hela lungområdet i 5 möss. B-linjer räknades var 10 bildrutor; Således räknades de i totalt 50 bilder per mus som spänner över hela 500 bilder som förvärvats. Spridningsdiagrammet i figur 3D visar summan av B-linjer som räknas i varje 10 bilder (100 bildrutor) för 5 möss. Antalet B-linjer per mus summeras sedan för att inkludera B-linjer som finns i hela lungområdet. Medelmängden B-linjer som representerar tumörer hos de fem mössen var 141,6 ± 41,52 (figur 3E). Figur 3A visar en ultraljudsbild som förvärvats av en icke-infekterad muslunga, som jämförelse.
Enligt Jackson et al.3, 16 veckor post-intubation innehåller adenom samt adenocarcinom, som är tumörtyper av intresse för KRAS lungcancer. För att säkerställa införandet av dessa typer av tumörer vid analys av volymmätningar via ultraljud i vår modell, avbildade vi lungorna av möss vid 18 veckor efter infektion. För att kvantifiera volymen av de stora tumörerna via ultraljud använde vi 2D-analys på ultraljudsprogrammet. Stora tumörer visas som djupa klyftor avbryta pleuraytan som visas i bilden av figur 3C. När en tumör upptäcks mäter vi tumörens längd (L) och bredd (W) med hjälp av ultraljudsprogrammets mätverktyg. När erhållna, L och W tillämpas i den konventionella formel som används för beräkning av tumörvolym (protokoll steg 4.4). Vi analyserade tumörvolymen på 10 möss, vilket visas i figur 3F, där antalet tumörer som bildas i varje mus varierade från 5 till 26 tumörer. Volymerna av alla tumörer som bildas per mus summeras sedan för att representera tumörvolymen per mus. För denna analys antar vi att tumörer bildas i lungorna av möss är epileptiska i form, vilket bredden på tumören anses vara vinkelrätt mot bildplanet. Relativ volymkvantifiering kan göras när linjär storlek tumörer når 0,3 mm (antingen längd eller bredd). Efter att ha analyserat lungparenkymen på 10 möss var den genomsnittliga tumörvolymen 31,8 ± 6,61 mm3 (figur 3G). Hematoxylin och Eosin (H&E) färgninganalys på lungsektioner bekräftade bildandet av stora tumörer vid 20 veckor efter infektion(figur 4B)och bekräftade bildandet av adenom och adenokarcinom. Det bör noteras att som tumör tillväxt fortskrider, olika tumörer kan gå samman för att bilda stora, som visas i figur 4B. Även om ultraljud programvara tillåter 3D-analys av tumörer, denna typ av analys visade sig vara svårt i vår modell, främst på grund av den höga dynamiska rörelsen av de primära tumörer bildas som är förenligt med lungglidande (förflyttning av pleuralinjen med andning) samt hjärt beats11. Vi resonerade att 2D-analys skulle ge konsekvens i relativa tumör volymmätningar, särskilt när man jämför lungtumör progression mellan olika grupper av möss.
Figur 1: Flödecytometri analys av MEFs med en GFP LoxP-allele. Representativa flöde cytometri bilder som visar frekvensen av GFP-positiva MEFs som inte är infekterade (Fc) (A) och infekterade (Fi) med Ca2Cre-shp53 lentivirus (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Arbetsyta för integrerat järnvägssystem för ultraljudsavbildning. (A)X-axlig mikroknopp. (B)Y-axeln mikro-knopp. (C)Djurplattform. (D)Höjdkontrollratten för skanningshuvudsond. (E)Givare. (F)3D-motor. (G)Värmelampa. (H)Bedövningsrör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa ultraljudsbilder av muslungor före och efter lungtumörinduktion. (A)Bild av en icke-infekterad muslungsektion. Röda pilar pekar på revben (R) och lungans pleurayta (PS). (B)Bild av en muslunga 7 veckor efter tumörinduktion genom intratracheal intubation av lentivirus. Pilar indikerar B-linjer som reflekterar små tumörer på lungytan. (C)Bild av en mus lungsektion 18 veckor efter tumörinduktion. Blå linjer indikerar mätningar av längden (L: mm) och bredd (W: mm) av tumören visas. (D)Punktdiagram som visar B-line kvantifiering i 10 bilder som spänner över 500 bildrutor (varje bild avgränsas med 10 bildrutor). (E)Kvantifiering av relativa tumörnummer i lungorna vid 7 veckor efter induktion. (F)Scatter-plot som visar den relativa volymen av de olika tumörer som bildas i lungorna på 10 möss vid 18 veckor efter infektion. (G)Kvantifiering av lungtumörvolym hos möss (n = 10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Representativ H&E-färgning av LSL-KRAS G12D lungsektioner. (A)Lungsektion en 8 veckor efter infektion vid 500 μm förstoring. Pilar pekar på prekursorskador bildas vid denna tidpunkt, som återspeglas som B-linjer i ultraljud. Svarta pilar pekar vid förstorade lesioner vid 60 μm. (B)Lungsektion vid 20 veckor efter infektion vid 2 mm förstoring. Pilspetsar av samma färg visar olika tumörer som har gått samman. Pilar visar förstorade tumörer på 60 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi visar en metod som kan bedöma lungtumörtillväxt i Cre-induceradLSL-KRAS G12D musmodell med ultraljud. Denna metod kan användas för att utvärdera effekten av farmakologiska hämmare på lungtumörtillväxt. Det kan också användas för att jämföra lungtumörtillväxt mellan möss av olika genetiska bakgrunder. Med hjälp av denna teknik kräver inte specialiserade beräkningsfärdigheter, men det är viktigt att vara systematisk i antalet ramar som används för analys för att möjliggöra en korrekt jämförelse om metoden används för att jämföra olika grupper av möss.
Den intratracheal intubation av ~ 2 x 106 TU/ml Ca2Cre-shp53 i LSL-KRAS G12D möss ledde till bildandet av prekursorskador efter 7 veckors infektion. Dessa visas som längsgående vita linjer på sonografiska bilder och kallas B-linjer(bild 3B)12. Det genomsnittliga antalet B-linjer per mus var 141,6 ± 41,52(figur 3E). Vi valde att visualisera initiera tumörer på 7 veckor efter infektion eftersom denna tidpunkt skulle omfatta olika typer av prekursor skador; atypisk adenomatous hyperplasi, epitelial hyperplasi och adenom3. Bildandet av prekursorskador på lungan kontrollerades av H&E-färgning efter 8 veckors lentiviral infektion(figur 4A). Efter 18 veckors viral intubation är tumörerna tillräckligt stora för att tillåta 2D-volymmätningar i ultraljudsmjukvaran (figur 3C). Analys av ultraljudbilder gjordes vid 18-veckors tidpunkt för att inkludera kvantifiering av väl utvecklad adenom och adenocarcinom3. Bildandet av dessa typer av tumörer bekräftades vid 20 veckor efter infektion av H & E färgning analys(Figur 4B). 3D-volymmätningar är också möjliga av ultraljudsprogramvaran men kräver hög kompetensnivå. Den titre som beskrivs i detta protokoll är optimal för bildandet av lungtumörer som kan visualiseras och kvantifieras korrekt i 2D.
Andra bildtekniker kan också användas för att övervaka lungtumörtillväxt hos möss, såsom CT imaging och BLI13. Emellertid, CT imaging kräver att leverera en stråldos till tumören, vilket kan påverka tumörtillväxt vid upprepade analyser13. Dessutom kräver det användning av kontrastmedel för exakta tumörmätningar13. BLI är en viktig bildteknik som ofta används för att kvantifiera tumörspridning; Dess huvudsakliga begränsning är dock dess beroende av metabolisk verksamhet och förekomsten av ATP och O213. Fördelen med ultraljud imaging ligger i det att vara en icke-invasiv, icke-bestrålande, snabb och billig teknik för att förvärva bilder av lungparenkym13. Ultraljud har tidigare använts för att övervaka tillväxten av ortopediska mänskliga tumörer xenografted i lunga och bukspottkörtel av möss13,14. Raes et al. har varit framgångsrika i longitudinellt övervaka tillväxten av en enda mänsklig lungtumör implanteras nära den bakre diaphragmic ytan hos möss via ultraljud13. Skillnaden i LSL-KRAS G12D musmodell är att ha spontan utveckling av lungtumörer som kan övervakas från inledande till progression och denna utveckling kan jämföras mellan möss grupper. Dessutom finns det många tumörer som utvecklas på lungan i LSL-KRAS G12D mus modell, som så småningom växa, och kan även gå samman för att bilda stora tumörer(Figur 4B). Detta uppmanade behovet av att använda en metod som kan övervaka lungtumör initiering och progression i denna mus modell. Vi optimerade 2D ljusstyrka (B) läge analys för att möjliggöra kvantitativ bedömning av lungtumörer som utvecklats i denna mus modell.
En möjlig begränsning med ultraljud imaging är förekomsten av falska positiva15. Dessa ses när en mycket reflekterande yta finns (membran eller lever) som avbryter banan för balken och kan skapa ett virtuellt objekt härma ett sant objekt15. Sådana bilder kan vara falska tumörer men kan kringgås vid korrekt undersökning; en stor tumör är oftast dynamisk medan ett virtuellt objekt skulle vara statisk.
Ultraljud imaging för LSL-KRAS musmodell är idealisk på grund av den icke-invasiva karaktären av denna teknik. Den analysmetod som används i vårt labb för att övervaka lungtumörprogressionen i LSL-KRAS-musmodellen är snabb och användarvänlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr I. Verma för den lentivirala Ca2Cre-shp53 vektorn. Arbetet stöddes av medel från Canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP 137113) till AEK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra - 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
References
- Eisenstein, M. Personalized medicine: Special treatment. Nature. 513, 8 (2014).
- Karachaliou, N., et al. KRAS mutations in lung cancer. Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).
- Xia, Y., et al. Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model. Nature Cell Biology. 17 (4), 532 (2015).
- Demi, L., et al. Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy. Scientific Reports. 7, 12746 (2017).
- Mohanty, K., et al. Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering. Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Saraogi, A. Lung ultrasound: Present and future. Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).
- Gargani, L., Volpicelli, G. How I do it: lung ultrasound. Cardiovascular Ultrasound. 12, 25 (2014).
- Soldati, G., et al. On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome. Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975 (2016).
- Raes, F., et al. High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology. PLoS One. 11 (4), 15 (2016).
- Lakshman, M., Needles, A. Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging. Nature Methods. 12 (4), 372 (2015).
- Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. Ultrasound for the Pulmonary Consultant. Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9 (2016).
