Summary
В этой статье представлены методы генерации, очистки и количественной оценки Caenorhabditis elegans внеклеточных пузырьков.
Abstract
Секреция небольших мембранных пузырьков во внешнюю среду является фундаментальным физиологическим процессом всех клеток. Эти внеклеточные пузырьки (EVs) функционируют вне клетки для регулирования глобальных физиологических процессов путем передачи белков, нуклеиновых кислот, метаболитов и липидов между тканями. Экв отражает физиологическое состояние их клеток происхождения. EVs причастны к тому, что они играют основополагающую роль практически во всех аспектах здоровья человека. Таким образом, EV белка и генетических грузов все чаще анализируются для биомаркеров здоровья и болезней. Тем не менее, поле EV по-прежнему не имеет уступчивой модели системы беспозвоночных, которая позволяет изучать состав груза EV. C. elegans хорошо подходит для исследования EV, потому что он активно выделяет EVs за пределами своего тела в его внешней среде, что позволяет легкой изоляции. Эта статья предоставляет всю необходимую информацию для генерации, очистки и количественной оценки этих экологически выделяется C. elegans EVs в том числе, как работать количественно с очень большими популяциями возрастных синхронизированных червей, очистка EVs, и цикл цитометрии протокол, который непосредственно измеряет количество нетронутых EVs в очищенной образце. Таким образом, большая библиотека генетических реагентов, доступных для исследования C. elegans, может быть использована для исследования влияния генетических путей и физиологических процессов на состав груза EV.
Introduction
Секреция мембранных внеклеточных пузырьков (ЭВ) облегчает глобальные физиологические процессы, активно транспортируя специфический белок, нуклеиновой кислоты, метаболит и липидные грузы между клетками1. Клетки выделяют EVs, которые охватывают континуум размеров в диапазоне от 2 мкм или больше до 20 нм2. Небольшие ЭВ (ЗЛТ;200 нм) все чаще изучаются из-за их причастности к патологическим процессам, включая нарушения обмена веществ, рак, сердечно-сосудистые заболевания и нейродегенеративные заболевания53,,4. Эти патологии также были показаны, чтобы влиять на белок и генетический состав EVs грузов малых EVs. Таким образом, биомаркеры подписи патологии все чаще обнаруживаются с помощью методов обнаружения груза EV, таких как LC-MS-MS и RNAseq6,,77,8,9.
C. elegans был полезной моделью беспозвоночных для выявления эволюционно сохраненных путей сигнализации EV. Например, C. elegans flippase было впервые показано, чтобы вызвать EV биогенеза в C. elegans эмбрионов, и человека гомолог было показано, влиять на выброс EV в клетках человека10,11. C. elegans EVs, как сообщается, несут сигналы Ежика, необходимые для развития кутикулы. Доставка Ежик и другие морфогены было показано, играют важную роль в развитии EVs, и он сохраняется в зебры, мышей и людей12,13,14,15. C. elegans хорошо подходит для открытия биомаркера EV, потому что он выделяет ЭВ вне его тела, которые функционируют в связи между животными16,,17 (Рисунок 1А). Тем не менее, методология, созданная в рамках предыдущего исследования не могут быть использованы, потому что нематод E. coli источник пищи также выделяет EVs18. В этом методе большая часть выборки состоит из загрязнения кишечной палочкой, что ограничивает мощность протеомных или РНК-асекных подходов к обнаружению грузов C. elegans EV. Методы, описанные здесь, были разработаны, чтобы дать очень чистые C. elegans EVs на уровнях изобилия, характерных для типичных экспериментов клеточной культуры и тем самым облегчить подходы омики для открытия биомаркера EV.
Большие популяции червей необходимы для создания достаточного количества ЭВ для анализа грузов. Поэтому в него включены также методы проведения количественного выращивания больших популяций синхронизированных с развитием C. elegans. Как правило, когда большое количество червей необходимо для экспериментов, они культивируются в жидком носителе. Хотя это эффективно для генерации больших популяций червей, физиология животных значительно отличается от червей, культивируемых в стандартных условиях на нематод ныхлабельных пластинах роста (NGM). Звери, культивируемые в жидкости, растут медленнее, тоньше, проявляют неоднородность развития и подвергаются высокой степени изменчивости партии. Поэтому мы представляем простое, но эффективное средство количественного выращивания больших популяций, синхронизированных с развитием C. elegans с использованием 10 см высокорастущих пластин. Медиа-состав высокорастущих пластин включает в себя больше пептона, чем обычные пластины NGM и посеяны с штаммом кишечной палочки NA22, который растет более надежно, чем OP50.
Достижения в технологии цитометрии потока (FACS) позволили прямой анализ отдельных EVs20,21, что позволяет количественной оценки EVs без присущих ограничений в других методах. Предыдущая работа показала, что белок не является полезным прокси для изобилия EV, потому что различные методы очистки приводят к значительно различным соотношениям EV-к-белка22. Чрезвычайно чистые фракции EV содержат относительно мало белка, что затрудняет количественную оценку образцов с гелями BCA или Coomassie. Западный анализ может определить относительные различия отдельных белков, но не может определить, сколько ЭВ в выборке. Надежная количества EV с помощью анализа отслеживания наночастиц затрудняется его узким диапазоном сигнала к шуму, неспособностью дифференцировать между ЭВ и твердыми агрегатами, а также отсутствием переносимости методов между приборами с различными спецификациями23. Таким образом, эта статья также содержит обобщенный циклометрический поток процедуры для дискриминации и количественной оценки EVs.
Protocol
1. Подготовка
- Добавьте 2 г желатина до 100 мл dH2O и нагрейте в микроволновой печи, пока она не начнет кипеть. Затем перемешать и дайте ему остыть в течение 20 минут.
- Передайте раствор через фильтр 0,22 мкм и разделитесь в стерильных трубках. Лечить пипетки советы с желатином непосредственно перед использованием пипетки и изгнания желатина раствора. Обработанные советы могут быть использованы немедленно или сохранены.
- Вырежьте мембрану из стерильного фильтра крышки.
- Влажный 20 см площади 5 мкм нейлоновой сетки ткани и место вокруг верхней части стерильного фильтра крышки. Закрепите его несколькими толстыми резинками.
ВНИМАНИЕ: Внимательно изучите ткань, чтобы убедиться, что нет складки. Они делают воздушные зазоры, которые препятствуют всасывания.
2. Расчет больших популяций червей(рисунок 1А)
- Вихрь и пипетка 10 злицы червя подвески на крышку пластины выращивания червя или стеклянной горки. Повторите этот процесс 3x. Запишите количество животных в каждой капле.
- Отрегулируйте подвеску червя до двух животных на МЛ.
- Вихрь подвески и пипетки девять капель (10 л) на слайде или крышке пластины. Вручную подсчитывайте количество животных. Запишите количество животных в каждой капле.
- Рассчитайте среднее и стандартное погрешность среднего (S.E.M.) в процентах от каждой популяции червей.
- Рассчитайте общее количество животных в каждой популяции, разделив среднее значение на 10 зл, а затем умножая на общий объем подвески червя в Зл.
Рисунок 1: Обзоры процедур для генерации, количественной оценки и очистки C. elegans EVs. (A) Схема для подсчета больших популяций животных. (B) Схема для генерации червей для сбора EVs. (C) Схема для очистки EVs от C. elegans supernatent. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
3. Культивирование C. elegans для очищения EV
- Создание большой популяции развития синхронизированных C. elegans. Для этого выполните приведенные ниже шаги.
- Добавьте одно животное на 6-сантиметровую нормальную пластину мультимедиа роста. Инкубировать в течение двух поколений, а затем мыть животных на две высокие средние пластины роста.
- Инкубировать, пока черви не исчерпали пищу.
- Фильтр L1 червей с 5 мкм нейлоновой сетки подготовлены в шаге 1.4. Поместите крышку винта на стерильную бутылку, запустите вакуум и залить червей над фильтром. Передайте тот же объем среды над гельгельгельстом на фильтре.
- Количествните червей и вычислите общее число (см. шаг 2). В последнее время голодали черви, выращенные на высокой пластине роста, приводили к покрытию примерно 80 000 личинок L1.
- Личинки Centrifuge L1 при 2000 х г в течение 3 мин. Отрежь до 100 000 животных на мл.
- Поместите 50 000 животных на пластину с высоким ростом. Выращивайте животных при 20 градусах Цельсия до тех пор, пока они не становятся взрослыми (около 72 ч).
- Отбеливать gravid взрослых стандартными средствами и позволяют эмбрионам люк в 10 мл S Базальный раствор с 2,5 мкг /мл холестерина.
- Количественно L1 личинок (см. шаг 2), а затем добавить 50000 червей к каждой пластине высокого роста.
- Выращивайте тарелки при 20 градусах Цельсия до тех пор, пока животные не становятся молодыми взрослыми.
- Подготовьте C. elegans для генерации секретомов.
- Вымойте червей из пластин, добавив 15 мл стерильных M9 с 50 мкг /мл карбеничиллина к каждой пластине высокого роста. Пусть насыщенные пластины сидят в течение 5 мин. Выбить червей, объезжая буфер вокруг пластины. Избегайте sloshing. Налейте буфер из каждой пластины в отдельную коническую трубку 50 мл. Повторите шаг мытья 2x больше в общей сложности 45 мл буфера на пластину.
- Пусть черви поселиться в течение 15 мин. Декант супернатант и добавить 50 мл свежего буфера M9 в трубку. Повторите в общей сложности 4x.
- Плавать червей на вершине 30% сахарозы шаг градиента и восстановить животных в S Basal раствор24.
- Кратко resuspend червей в 15 мл ледяной 100 мм NaCl, добавить 15 мл ледяной 60% сахарозы, и инвертировать для смешивания. Со стеклянной пипеткой мягко слой 5 мл ледяной 100 мм NaCl на верхней части смеси сахарозы.
- Центрифуга при 1500 х г в течение 5 мин. Черви будут сосредоточены на стыке NaCl и сахарозы.
- Аккуратно pipette из животных из интерфейса в новый 50 мл конической трубки. Добавьте раствор S Basal до 50 мл. Разрешить червей поселиться 5 мин.
- Декант супернатант и добавить свежий 50 мл S Basal раствора. Повторите это по крайней мере 3x.
- Количества червей, описанных в шаге 2.
- Приостановите работу червей до плотности одного животного на МЛ стерильным раствором S Basal, содержащим 2,5 мкг/мл холестерина и 50 мкм карбенииллина.
- Чтобы подготовить образец для генерации секретома, добавьте до 400 мл подвески к стерильной 2 l нижней озадачиваемой колбе.
- Поместите фляги на круговой ротатор в инкубатор е 20 градусов при 100 об/мин на 24 ч.
4. Очищение EV
- Сбор урожая и фракционирование
- Удалите 2l колбу червей из инкубатора и гранулы животных в 50 мл конических флаконов (500 х г в течение 2 мин).
- Налейте супернатант через 0,22 мкм вакуумный фильтр, чтобы удалить любые твердые частицы мусора.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, отфильтрованный супернатант, содержащий секретом и пузырьки могут храниться при -80 градусов по Цельсию. - Подсчитайте количество животных, как описано в шаге 2.
- Определите жизнеспособность червей, поместив каплю взвешенных червей на бактериальный газон. Подождите 15 минут, а затем оценка животных, как перемещение, парализована, или мертвых.
- Сосредоточьтесь на фильтре 0,22 мкм на 700 л с помощью регенерированных нитроцеллюлозы 10 кДА. Добавьте 150 S базальный раствор, а затем пипетку над фильтром и вихрем. Повторите 2x.
- Centrifuge концентрированный супернатант на 18000 х г в течение 20 мин при 4 кв и передать супернатант в новую трубку. Этот шаг удаляет любые потенциальные обломки или более крупные частицы, которые могли бы накапливаться во время обработки.
- Добавляйте коктейль-ингибитор протеазы и ЭДТА в инструкции производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент концентрированный супернатант, содержащий секретом и пузырьки, может храниться при -80 градусах Цельсия.
- Размер исключения хроматографии
- Налейте 80-200 мкм агарозной мизины (диапазон фракционирования размера пор от 70 000 до 40 000 000 кДа для шаровых белков) в пустой картридж столба гравитационного потока. Раствор Flow S Basal до тех пор, пока кровать с госленкой не будет упакована в окончательный объем 10 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если слишком много миски выливают в картридж колонны, то разогнать верхнюю часть колонны и удалить избыток с помощью пипетки. - Пройдите 40 мл стерильного фильтрованного раствора S Basal через колонну и дайте ему течь под действием силы тяжести.
ПРЕДЕКТО: Убедитесь, что мизаня не нарушается. - Пусть поток буфера до тех пор, пока верхняя часть мисы не будет погружена, а затем крышка нижней части колонны картриджа. Поместите трубку для сбора под колонку.
- Снимите крышку, помещенную на картридж. Добавьте концентрированный секретом, полученный в шаге 2.1 dropwise к верхней части кровати колонки. Пипетка 1 мл раствора S Базаль dropwise. Поместите свежую трубку коллекции под колонку.
- Медленно заполните верхний резервуар колонки с 5 мл S базальный раствор, чтобы не беспокоить погоду. Соберите первые 2 мл eluate затем быстро изменить трубки и собирать следующие 4 мл. Это фракция, которая обогащается для EVs.
- Сосредоточьте элюат до 300 л с регенерированной нитроцеллюлоза 10 kDa молекулярного веса отрезали (MWCO) фильтр и передачи retentate в низкосвязывающей микроцентрифуговой трубки.
- Промойте фильтр мембраны 2x с 100 л S Базаль раствор вихрем на 20 с и пайпетирование буфера через фильтр. Добавьте к первоначальному образцу окончательный объем 500 л.
- Добавьте коктейль-ингибитор протеазы в инструкции производителя.
- Выполняйте эксперименты вниз по течению немедленно (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS и т.д.) или храните при -80 градусов по Цельсию.
- Налейте 80-200 мкм агарозной мизины (диапазон фракционирования размера пор от 70 000 до 40 000 000 кДа для шаровых белков) в пустой картридж столба гравитационного потока. Раствор Flow S Basal до тех пор, пока кровать с госленкой не будет упакована в окончательный объем 10 мл.
5. Поток Цитометрии Количественное
- Подготовка красителя
- Подготовьте запас DI-8-ANEPPS объемом 10 мм с использованием свежего DMSO. Распределите по 10 аликотов и храните при -20 градусов по Цельсию.
- Подготовьте рабочий раствор мощностью 1 мМ, добавив 90 л стерильных фильтрованных PBS в трубку с 10 л красителя.
- Экспериментальная подготовка образца
- Добавьте 840 л раствора S Базаль в микроцентрифуговую трубку. Затем добавьте 60 qL очищенных ЭВ, генерируемых в разделе 4.2 и вихре.
- Aliquot 300 л образца в две новые микроцентрифуги труб. В настоящее время существует экспериментальный набор из трех труб, содержащих по 300 л разбавленных ЭВ каждый. Этикетка трубки #1-3. К пробам #2 и #3 добавить 7 кЛ запаса DI-8-ANEPPS, подготовленный в 5.1.2. Затем добавьте 7 злителк 1% Triton-X 100 в трубку #3. Смешайте каждую трубку путем вихря.
- Соникат образец #3, поместив наконечник звукового в середине образца и пульсируя 10 раз на 20% мощности 30% цикла пошлины.
ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что кончик звукового зонда находится в середине образца, так что генерация пены сведена к минимуму. Пена может скомпрометировать образец, вызывая EVs для агрегирования. - Добавьте 300 зЛ раствора S Basal к двум микроцентрифугным трубам. Добавьте 7 зл и ной рабочий реагент DI-8-ANNEPS, подготовленный в шаге 5.1 ко второй трубке и этикетку "Только для красителя". Этикетка другой трубки "Только буфер".
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте только краситель и буфер только контрольные образцы и экспериментальные образцы с тем же S Basal источника. - Инкубировать образцы вдали от прямого света и при комнатной температуре на 1 ч.
- Проведите эксперименты FACS.
- Установите фильтр возбуждения FACS до 488 нм (синий) и эмиссионный фильтр до 605 нм (оранжевый). Установите скорость потока до 1,5 л на мин.
- Выполнить нанобища FACS калибровочной смеси (необязательно, но рекомендуется).
- Выполнить каждый образец на машине FACS в течение 3 мин (180 с). Обратите внимание на точное время работы в секундах.
- Проанализируйте данные FACS.
- Откройте файлы с помощью программного обеспечения для анализа FACS.
- Переключите Y-оси на 488-Org (Area), нажав на ось,выбрав из выпадающего меню.
- Установите прямоугольные ворота, начиная с верхней части участка, охватывающих от уровня SALS 102 до 104 (зlt;300 нм размерчастиц). Расширяйте ворота вниз, пока они не сопоставят 2,5% от общего количества событий. Назовите ворота "DI-8-ANEPPS".
-
Количественная оценка изобилия образца EV
- Копировать эти ворота и вставить его на два других образца в экспериментальном наборе, а также только буфер только и краситель только управления. Экспорт анализа в электронную таблицу.
- Если образцы FACS не были запущены в течение рекомендуемых 3 мин (180 с), нормализовать все значения событий в образце к событиям на 180 с. Например, если образец был запущен на 250 с, номер события DI-8-ANEPPS масштабируется на 250 s/180 s.
- Удалите фоновые события красителя, вычитая количество событий DI-8-ANEPPS в управлении только красителя из тех, в образце #2.
- Удалите фоновые события изотипа, вычитая количество событий DI-8-ANEPPS в образце #1.
- Удалите нечувствительные к моющим средствам события, вычитая количество событий DI-8-ANEPPS в образце #3. Это значение является число мот-добросовестных EVs.
- Рассчитайте количество ЭВ в 1 злике выборки, разделив значение, рассчитанное в шаге 5.5.5, на объем, анализируемый в QL (4,5 л, проанализированное в шаге 5.3) и умножая на коэффициент разбавления (10x, как описано в шаге 2.5). Умножьте это значение на количество ЗЛ, оставшегося в подготовке EV. Это количество EVs, доступных для анализа ниже по течению.
Рисунок 2: Схема подготовки образца цитометрии потока для количественной оценки изобилия EV. (A) Препарат EV делится на три одинаковых образца. Образец No 1 является Нет красителя отрицательный контроль. DI-8-ANEPPS затем добавляется в образцы #2 и #3. Triton-X 100 затем добавляется в образец #3. Зеленая стрелка указывает на то, что впоследствии sonicated приводится только образец #3. Данные из потока помогают определить абсолютное количество чувствительных к морентюкам EVs в образцах FACS, а затем рассчитать обилие EVs в общей подготовке. Ворота для определения красителя-позитивных событий устанавливается с образцом #1, который не содержит красителя. Красное письмо на данных электронной таблицы должно проиллюстрировать что краситель-положительные случаи от моющего средства-обработанного образца вычитаются от образца с красительом. (B) Уравнения для количественной оценки EVs в FACS проанализировали образец и расчета общего числа EVs в выборке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Representative Results
Схема для процессов, необходимых для генерации и очистки EVs показано на рисунке 1. Под ним отображаются типичные времена, необходимые для выполнения каждого шага. На рисунке 2 показана схема подготовки образцов для анализа FACS с использованием DI-8-ANEPPS(рисунок 2A), а также расчеты, необходимые для оценки общего числа EVs в выборке(рисунок 2B).
Репрезентативные результаты 10 биологических репликаток показаны на рисунке 3A. Вариативность между репликациями не является значительным и типичный S.E.M. размера населения составляет чуть более 10%(рисунок 3B). Фильтрация червей и выращивание на свежих плитах высокого роста будет генерировать большую популяцию gravid взрослых, пригодных для синхронизации отбеливателя. Одна голодная пластина, обработанная таким образом, может привести к экспериментальной популяции 1 х 106 или более синхронизированных потомства, потому что каждый gravid взрослый будет содержать около 10 яиц. Можно поддерживать большие популяции синхронизированных популяций, сохранив яйца и личинки через фильтр 40 мкм для получения ЭВ от пожилых животных. Сохраненные взрослые переносятся на свежие плиты высокого роста при плотности 20 000 животных на тарелку. Этот процесс повторялся каждые 2 дня. На рисунке 3C показаны три биологические репликации популяций червей, перемещаемых через три переноса пластин. Передача животных между пластинприводит к потере около 10% животных(рисунок 3C), в то время как около 20% животных теряются в шаге флотации сахарозы(рисунок 3D).
Рисунок 3: Количественная оценка больших популяций C. elegans для анализа EV. (A) Сравнение числа L1 личинок этапе червей изолированы от одного недавно голодали (Злт;24 ч) высокий рост пластины. Значения каждой из 10 биологических репликаток построены. Суммирование всех точек данных в 10 репликах также представлено как скрипичный сюжет и бар с S.E.M. Это показывает, что одна пластина недавно голодали червей даст 80000 L1 личинок этапе червей. (B) S.E.M. 15 различных измерений популяции пластин в панели A построены как отдельные точки. Как правило, S.E.M. немного превышает 10%. (C) Три биологические репликации популяций червей были оценены после каждого из двух переносов между пластинами каждые 4 ч. Такое перемещение животных между плитами не привело к значительному уменьшению численности популяции. Это указывает на то, что представленная здесь методология перемещения червей не приводит к значительной потере животных. (D) Измерения популяции, сделанные в ходе трех экспериментальных репликаторов EV: Количество животных, которые были оценены для оригинальных личинок L1, которые начали эксперимент, количество молодых взрослых животных, оправившихся от поплавка сахарозы и готовых к 24 ч инкубационный период, количество животных, подсчитанных из подготовки EV после восстановления секретома. Существует небольшое, но не значительное уменьшение численности популяции между первоначальной оценкой популяции на стадии личинки L1 и позже, когда животные являются молодыми взрослыми. Средние измерения популяции L1 были назначены как 100%, а все другие измерения были масштабированы по их отношению к этому значению. Ошибки баров S.E.M. и p значение lt; 0,05, N.S. - не значительные в параметрических парных t-тест. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Соотношение белка к животным является полезной метрикой для характеристики препарата EV. Эта метрика может обеспечить быстрое средство для определения согласованности между препаратами EV. В среднем, 1000 диких молодых взрослых животных будет выделять 1 мкг белков больше, чем 10 кДа в их среду(рисунок 4A). Когда эта фракция еще больше разделена по размеру исключения хроматографии, общий профиль элуционной белка показывает небольшой пик белка между 2-6 мл и большой пик после 8 мл. EVs содержатся в первых 5 мл колонки eluate(Рисунок 4B). Анализ отслеживания наночастиц, первый 5 мл из обезличения столбца содержит моноразостечение популяции небольших, 150 нм ЭВ(рисунок 4С). Трансмиссия электронной микроскопии размеров исключения фракций показывает обильные EVs в 2-6 мл фракции eluate, но не в более поздних объемах eluate. EVs известны своей чашки, как форма и, следовательно, легко различать твердых частиц, которые появляются как пунктуальные яркие точки при подготовке в условиях отрицательного окрашивания (Рисунок 4D).
Рисунок 4: Очистка C. elegans EVs от общей выделенной биомассы. ( A) Было построено соотношение общего количества белков, превышающего 10 кДа, к количеству червей, инкубированных при подготовке к 10 биологическим репликациям. Большинство препаратов содержало 1 мкг белка на 1000 животных. (B) Профиль выпадения белка из 10 мл колонки мелины загружены с 1 мл концентрированного секретома. Фракции, которые объединяются в дальнейшем анализе, затенены на группы. (C) Анализ наночастиц слежения консолидированной доли элеты йошилира тинумов 2-6 мл. 95% доверительный интервал затенен серым цветом. (D) TEM анализ консолидированной мелины eluted фракций. В исходном материале были как частицы везикулы, так и невезикула. Консолидированная фракция elution 2-6 мл была обогащена для пузырьков с несколькими невезикулными частицами. Консолидированные фракции 7-11 мл содержали несколько частиц, похожих на везикулы, но много невезикльных частиц. Фракции elution 12-15 мл содержали только невезикула частиц. Все микрографы показаны при одном увеличении. Шкала бар 200 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Для непосредственного сравнения характеристик цитометрии потока между C. elegans и человека EVs, мы очищены EVs от обусловленных средств клеточных культур человеческих нейронов с этим методом. Цитометрия потока отделяет частицы на основе рассеяния света. Рассеяние света малого угла (SALS) примерно коррелирует с размером, а длинноугольное рассеяние света (LALS) коррелирует с внутренней мембранной структурой. Большинство общих выборочных событий из обеих клеточных культур и C. elegans EV препараты плотно сосредоточены в кластере сосредоточены вокруг 103 SALS и 104 LALS (Рисунок 5A). Гистограмма C. elegans EV выборочных событий, отсортированных SALS показывает, что все препараты пик на й 103 (Рисунок 5B).
Рисунок 5: C. elegans EVs четко определяются их свойствами рассеяния света. (A) Гистограмма sALS событий в трех биологических репликций C. elegans EVs. 80% от общего количества событий выборки находятся в плотной, четко определенной популяции. Подобно анализу отслеживания наночастиц, он показывает, что распределение размера C. elegans EVs является монодисперсным. Для сравнения показана гистограмма буфера S Basal, используемого для разбавления образцов. (B) Сравнение рефракционных свойств C. elegans и человеческой клеточной культуры EVs очищены с методами, описанными в этом тексте. Оба типа EV постоянно представляют сопоставимые короткие и длинноугольные распределения рассеяния света (SALS и LALS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
DI-8-ANEPPS надежно маркирует C. elegans EVs, постоянно подчеркивая большинство общих событий как в C. elegans, так и в клеточной культуре, полученных образцами. Калибровочные бусы и элементы управления представлены на рисунке 6А. Отдельные участки рассеяния FACS показаны из образца C. elegans, подготовленного из 200 000 животных (#1) и двух, подготовленных из 500 000 животных(рисунок 6B). Были также проанализированы эвы либо 100 мл (#1) или 200 мл (#2,3) клеточной культуры(рисунок 6C). Оба C. elegans и клеточной культуры полученных образцов показали обильные флуоресцентные события, которые исчезли при лечении с 0,05% Triton-X 100 и световой звуков. Это свидетельствует о том, что помеченные события моющего средства половых фосфолипидных структур (пузырьков), а не моющего нечувствительных твердых липопротеинов агрегатов. Обилие EV рассчитывается как разница между количеством событий в воротах DI-8-ANEPPS между фракциями без моющего средства (-) и с моющим средством (к) минус события в управлении только красителя. Для ясности данные, представленные индивидуально на рисунке 6B и рисунке 6C, обобщены в виде графиков на рисунке 6D и рисунке 6E. Обилие очищенных EVs существенно не отличало между C. elegans и культурой клетки выведенных подготовки(рисунок 6F).
Рисунок 6: Примеры данных цитометрии потока, используемых для расчета изобилия EV. ()Чтобы гарантировать, что количество событий может быть непосредственно сопоставлено между образцами, только буфер и буфер и краситель Только элементы управления должны быть запущены в той же скорости потока и времени сбора, как EV образца фракций. В воротах DI-8-ANEPPS очень мало событий. (B) Репрезентативные результаты DI-8-ANEPPS и протокола лечения моющих средств от C. elegans. Показаны три биологических репликаты. Биологическая реплика #1 была подготовлена из 200 000 животных, в то время как #2 и #3 были подготовлены от 500 000 животных. Исчезновение EVs с моющим средством лечения ясно во всех случаях. (C) Представитель результаты DI-8-ANEPPS и моющих средств протокола лечения с использованием человеческой культуры клеток обусловленных средств массовой информации. Биологические репликации #1 и #2 были подготовлены из 200 мл условных носителей, в то время как биологические репликации #3 были подготовлены из 100 мл. (D) Бар график данных, собранных из трех биологических репликций C. elegans EVs. Ошибки баров s.E.M. Парные двуххвостые t-тесты между процедурами. значение p; 0.001. (E) Бар график данных, собранных из трех биологических репликаток клеточной культуры, полученных EVs. Парные двуххвостые т-тесты между процедурами. Значение p slt; 0.001 (F) Количество чувствительных к морентюку чувствительных к красителям событий на QL было рассчитано для всех биологических репликаций C. elegans и клеточной культуры. Значения между двумя источниками выборки EV существенно не отличаются. Парные двуххвостые t-тесты между процедурами р значение 0,685. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1 содержит необработанные экспериментальные значения для полного 4,5 злицы каждого анализируемого типа образца. Общее количество событий, собранных из ev фракций очищены от 500000 животных было 10-20x над фоном число частиц, собранных буфером в одиночку в то время как фракция очищена от 200000 животных, содержащихся около 2x столько событий, как буфер в одиночку. Количество событий в воротах DI-8-ANEPPS также отображается для каждого образца. Эти метрики могут быть импортированы в электронную таблицу для расчета количества красителя-положительных, чувствительных к моющим средствам EVs, как описано выше. Например, количество ЭВ в 1 мл первой биологической репликации C. elegans будет рассчитано следующим образом:
(18 974 - 3 853 - 1,487) x (10/4.5) x 1,000 - 30,297,778.
Таблица 1: Табулированные данные цитометрии потока. Данные, показанные на рисунке 6, представлены в виде электронной таблицы. Для каждого образца отображаются общие события и закрытые события DI-8-ANEPPS. Каждая биологическая репликация расположена в порядке образцов #1-3 в протоколе. Эти показатели показывают, что общее количество событий, собранных из образцов C. elegans, подготовленных из 500 000 животных или 200 мл клеточной культуры условных носителей, было в 10-20 раз по сравнению с фоновым числом частиц, собранных только буфером, в то время как биологическая реплика очищена от 200 000 животных, содержащихся примерно в 2 раза больше общих событий в качестве буфера. Количество событий в воротах DI-8-ANEPPS также отображается для каждого образца. Эти метрики могут быть экспортированы в электронную таблицу для расчета общего числа EVs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).
Discussion
Фундаментальная задача месторождения EV заключается в разделении широкого спектра подтипов EV2. Методы, описанные здесь, используют фильтрацию, дифференциальную центрифугацию и хроматографию, объясняемую размерами, для создания чистой популяции небольших ЭВ, потому что ранее было показано, что они выделяются во внешнюю среду и функционируют в физиологически соответствующих коммуникационных путях16. EVs очищены через размер исключения хроматографии все еще может быть смесь экзосом и небольших микровезиков, потому что эти EV подклассы аналогичного размера. Подклассы Vertebrate EV обычно разделены иммунопрецицией, потому что этот метод изолирует ЭВ через связывание с селективными маркерами мембранного белка. Описанные методы облегчают идентификацию белков мембранных маркеров C. elegans EV. Таким образом, в будущем можно будет еще больше отделить небольшие подклассы EV с помощью аналогичных методов иммунопрецитации. В теории, иммунопрецитиза может изолировать EVs от сытых червей, потому что E. coli EVs не должны взаимодействовать с антителами. Исследователи, заинтересованные в выявлении белковых и генетических грузов более крупных подклассов EV (Nogt;200 nm), могут сделать это, пропустив ступень фильтрации 0,22 мкм, а затем проанализировав гранулы, а не супернатант. Раскрытие белковых и генетических грузовых обилий крупных ЭВ позволит получить более полное понимание физиологических процессов, которые функционируют через сеадизом C. elegans. В дополнение к секретированию в окружающую среду, C. elegans EVs передаются внутренне между тканями. Таким образом, эти методы только изолировать подмножество общего C. elegans EVs. Тем не менее, обнаружение грузов внутренних EVs не представляется возможным, потому что нет метода для разделения EVs от лисизированных червей. Грузовой анализ этого внешне высекреченного подмноза EV обеспечивает средства для выявления потенциальных общих маркеров белка EV, способных маркировать внутренние EVs.
Масштаб ы подготовки EV будет зависеть от требований эксперимента. В общей сложности 500 000 молодых людей обеспечивают достаточное количество ЭВ для параллельного анализа цитометрии потока, LC-MS-MS и RNAseq. Это число может быть уменьшено вверх или вниз в зависимости от экспериментальных потребностей. Самым большим практическим фактором для масштабирования является количество 10 см высоких пластин роста требуется. Высокорастущие пластины, приготовленные с 500 qL из 20x концентрированной ночной культуры NA22 будет поддерживать население 50000 взрослых от L1 личинки этапе до первого дня взрослой жизни. Поэтому для проведения эксперимента с 500 000 взрослых необходимы 13 высоковозрастных пластин: одна пластина для генерации популяции L1s, две пластины для генерации взрослых для отбеливания, и 10 пластин для роста экспериментальных животных. Эти показатели зависят от условий посева и роста бактерий высокорастущих пластин. Поэтому рекомендуется сделать все пластины стандартизированным способом, а затем откалибровать с известным количеством животных.
Черви учитываются на двух этапах в процессе культивирования: 1) до посева червей на тарелках и 2) перед генерацией условных носителей. Плотность культивирования животных, как было показано, влияет на поведение, развитие и стресс ответы15,16,17,18 и, следовательно, может также влиять на ГРУЗы EV. Поэтому для последовательной плотности культивирования необходимо точно оценить популяции червей. Количества червей в девяти каплях дает статистическую достоверность демографических оценок. Важно лечить каждую каплю индивидуально, вихрь между каждой каплей и вставки пипетки на том же расстоянии в подвеску червя. Принятие этих мер предосторожности обеспечит значение S.E.M. в размере 5–10% от общей численности населения. Если S.E.M. для популяции червей выше 20%, то что-то пошло не так.
После 24 ч без бактерий инкубационный период, молодые, дикие типа C. elegans ползать сразу после добавления к бактериальной лужайке. Это свидетельствует о том, что инкубация не оказывает серьезного влияния на их здоровье. Однако этот шаг влияет на физиологию животных и, следовательно, может влиять на состав грузов EV. Поэтому при работе с очень больными генотипами или пожилыми животными необходимо проверить жизнеспособность после инкубационного шага. Если все животные не выживают в инкубации, то увеличьте экспериментальный размер популяции и уменьшите время инкубации. При работе с большими объемами кондиционированных носителей, это более практично использовать перемешивают ячейки концентратор с фильтром из регенерированной нитроцеллюлозы. EVs не связываются с этим фильтром химии так сильно, как другие типы фильтров14.
Соотношение общего белка, извлеченного из условных носителей, к количеству инкубированных животных, чтобы сделать препарат, является полезной метрикой. Если это соотношение намного выше, чем ожидалось, то вполне возможно, что оценки популяции были выключены или что животные умерли и ухудшились в условных носителях. Если это соотношение намного ниже, чем ожидалось, то некоторые белки, возможно, были потеряны на фильтры во время процесса концентрации. Хотя методы FACS будут непосредственно количественно EVs в подготовке, эта метрика полезна, потому что она может выделить образцы аномалий в начале процесса. Еще одним полезным методом проверки качества препарата EV является электронная микроскопия передачи, как показано на рисунке 4D. Хотя протокол для передачи электронной микроскопии официально не включен в эту статью метода из-за длины, он может быть проведен стандартными методами. Рекомендуется проводить этот тип анализа, по крайней мере на начальном этапе, в качестве бесплатного метода для FACS для оценки качества препаратов EV. Для достижения наилучших результатов используйте свежеразряженный формвар-углеродные сетки и запятнайте образцы 2% фосхотунгстовой кислотой вместо ацетата уранила.
DI-8-ANEPPS был выбран потому, что было показано, количественно этикетки EV мембраны, превосходя другие общие красители EV с образцами биопсии человека и липосомы25. Измерения быстрые, принимая только 3 минуты времени сбора для каждого образца. Количественная оценка чувствительных к моющим средствам Овов имеет прямое функциональное значение, поскольку она основывается на фундаментальном физическом различии между ЭВ и твердыми агрегатами липопротеинов. Важно отметить, что этот метод не зависит от количества общего белка или количества не-EV агрегатов и, следовательно, может количественно EVs, полученных с помощью различных методов очистки в беспристрастным образом. ПРОВЕРЕНная FACS метрика EV, которую мы описываем здесь, будет особенно полезна для исследований, демонстрирующие физиологическое воздействие очищенных ЭВ. Это может также принести пользу области EV в целом, чтобы установить методологию FACS в качестве универсальной метрики, с тем чтобы абсолютное изобилие EV может быть непосредственно по сравнению между исследованиями. Vital красители также могут маркировать C. elegans EVs, но они не так ярки, как EVs помечены Di-8-ANEPPS.
Этот подход к очищению капитализируется на активной секреции ЭВ за пределами тел нетронутых, живых червей. Это позволяет C. elegans EVs быть изолированы на сопоставимой чистоты и изобилия, как от клеточной культуры, спецификации, которые являются достаточными для выявления сотен белков и РНК грузов через LC-MS-MS и RNAseq анализа26. Таким образом, большая библиотека реагентов, доступных для исследования C. elegans, может быть использована для исследования влияния генетического и физиологического возмущения на состав груза EV.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.
Acknowledgments
Мы с благодарностью признаем Ника Терзопулоса за червячие пластины и реагенты; Центр генетики Каненорхабдита (CGC) в Управлении научно-исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440) для линии нематод N2; Люсия Войтек, PhD, за помощь в анализе отслеживания наночастиц; Джессика Янг, доктор философии, и Мари Клэр, MD, PhD, для hiPSC полученных нейронных условных клеточных носителей; Wai Pang за помощь в визуализации TEM. Эта работа была поддержана ГРАНТом NIH P30AG013280 для Гранта МК и NIH AG054098 JCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
| 1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05% to lyse EVs |
| 10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
| 2 L bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
| 40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
| 5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
| 6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
| Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
| ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
| DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
| Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
| Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
| HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
| Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
| S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
| Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
| Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |
References
- Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles. Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
- Lakhter, A. J., Sims, E. K. Minireview: Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Diabetes and Related Metabolic Disorders. Molecular Endocrinology. 29, 1535-1548 (2015).
- Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 90, 1549-1557 (2010).
- Lai, C. P. -K., Breakefield, X. O. Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies. Frontiers in Physiology. 3, 228 (2012).
- Duijvesz, D., et al. Proteomic profiling of exosomes leads to the identification of novel biomarkers for prostate cancer. PLoS One. 8, 82589 (2013).
- Zhou, H., et al. Exosomal Fetuin-A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury. Kidney International. 70, 1847-1857 (2006).
- Cheng, L., Sharples, R. A., Scicluna, B. J., Hill, A. F. Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Michael, A., et al. Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers. Oral Diseases. 16, 34-38 (2010).
- Wehman, A. M., Poggioli, C., Schweinsberg, P., Grant, B. D., Nance, J. The P4-ATPase TAT-5 inhibits the budding of extracellular vesicles in C. elegans embryos. Current Biology. 21, 1951-1959 (2011).
- Naik, J., et al. The P4-ATPase ATP9A is a novel determinant of exosome release. PLoS One. 14, 0213069 (2019).
- Liégeois, S., Benedetto, A., Garnier, J. -M., Schwab, Y., Labouesse, M. The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 173, 949-961 (2006).
- Simon, E., Aguirre-Tamaral, A., Aguilar, G., Guerrero, I. Perspectives on Intra- and Intercellular Trafficking of Hedgehog for Tissue Patterning. Journal of Developmental Biology. 4, (2016).
- Qi, J., et al. Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Tumor Growth Through Hedgehog Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 42, 2242-2254 (2017).
- Sigg, M. A., et al. Evolutionary Proteomics Uncovers Ancient Associations of Cilia with Signaling Pathways. Developmental Cell. 43, 744-762 (2017).
- Wang, J., et al. C. elegans ciliated sensory neurons release extracellular vesicles that function in animal communication. Current Biology. 24, 519-525 (2014).
- Beer, K. B., Wehman, A. M. Mechanisms and functions of extracellular vesicle release in vivo-What we can learn from flies and worms. Cell Adhesion and Migration. 11, 135-150 (2017).
- Deatherage, B. L., Cookson, B. T. Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life. Infection and Immunity. 80, 1948-1957 (2012).
- Stiernagle, T.
- Kibria, G., et al. A rapid, automated surface protein profiling of single circulating exosomes in human blood. Scientific Reports. 6, 36502 (2016).
- Rose, J. A., et al. Flow cytometric quantification of peripheral blood cell β-adrenergic receptor density and urinary endothelial cell-derived microparticles in pulmonary arterial hypertension. PLoS One. 11, 0156940 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nature Protocols. 7, 1502-1510 (2012).
- de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).
- Russell, J. C., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet]. bioRxiv. , (2018).
