Summary
Questo articolo presenta metodi per generare, purificare e quantificare le vesciche extracellulari di Caenorhabditis elegans elegans.
Abstract
La secrezione di piccole vesciche legate alla membrana nell'ambiente esterno è un processo fisiologico fondamentale di tutte le cellule. Queste vesciche extracellulari (EV) funzionano al di fuori della cellula per regolare i processi fisiologici globali trasferendo proteine, acidi nucleici, metaboliti e lipidi tra i tessuti. I veicoli elettrici riflettono lo stato fisiologico delle loro cellule di origine. I veicoli elettrici sono implicati per avere ruoli fondamentali in quasi tutti gli aspetti della salute umana. Pertanto, le proteine EV e i carichi genetici vengono sempre più analizzati per ottenere biomarcatori di salute e malattia. Tuttavia, il campo EV manca ancora di un sistema di modelli di invertebrati trattabili che permetta lo studio della composizione del carico EV. C. elegans è adatto per la ricerca EV perché secerne attivamente i veicoli elettrici al di fuori del suo corpo nel suo ambiente esterno, permettendo un facile isolamento. Questo articolo fornisce tutte le informazioni necessarie per generare, purificare e quantificare questi EV C. elegans secreti dall'ambiente, incluso come lavorare quantitativamente con popolazioni molto grandi di worm sincronizzati con età, purificare i VE e un protocollo di citometria di flusso che misura direttamente il numero di EV intatti nel campione purificato. Così, l'ampia biblioteca di reagenti genetici disponibili per la ricerca C. elegans può essere sfruttata per studiare l'impatto dei percorsi genetici e dei processi fisiologici sulla composizione del carico EV.
Introduction
La secrezione di vesciche extracellulari (EV) legate alla membrana facilita i processi fisiologici globali trasportando attivamente proteine specifiche, acido nucleico, metaboliti e carichi lipidici tra le cellule1. Le cellule secernono eV che si estendono su un continuum di dimensioni che vanno da 2 m o superiore a piccolo come 20 nm2. I piccoli Veicoli elettrici (<200 nm) sono sempre più studiati a causa delle loro implicazioni nei processi patologici, tra cui disturbi metabolici, cancro, malattie cardiovascolari e malattie neurodegenerative3,4,5. Queste patologie hanno anche dimostrato di influenzare la proteina e la composizione genetica dei carichi evasi di piccoli veicoli elettrici. Pertanto, le firme dei biomarcatori della patologia sono sempre più scoperte attraverso metodi di scoperta del carico EV come LC-MS-MS e RNAseq6,7,8,9.
C. elegans è stato un utile modello invertebrato per identificare i percorsi di segnalazione EV evolutivamente conservati. Per esempio, un C. elegans flippase è stato indicato per la prima volta per indurre la biogenesi EV in embrioni di C. elegans, e l'omolologo umano ha dimostrato di influenzare il rilascio di EV nelle cellule umane10,11. C. elegans EV sono stati segnalati per trasportare segnali di riccio necessari per lo sviluppo cuticola. La consegna di Riccio e altri morfogeni è stato indicato per svolgere un ruolo di sviluppo importante di EV, ed è conservato in pesci zebra, topi, e gli esseri umani12,13,14,15. C. elegans è adatto per la scoperta di biomarcatori EV perché secerne EV al di fuori del suo corpo che funzionano nella comunicazione animale-animale16,17 (Figura 1A). Tuttavia, la metodologia stabilita attraverso uno studio precedente non può essere utilizzata perché la fonte alimentare E. coli dei nematodi secerne anche eV18. In questo metodo, la maggior parte del campione è costituita da contaminazione da E. coli, che limita la potenza degli approcci proteomici o RNAseq per la scoperta dei carichi C. elegans EV. I metodi qui descritti sono stati sviluppati per produrre EV C. elegans altamente puri a livelli di abbondanza caratteristici dei tipici esperimenti di coltura cellulare e quindi facilitare gli approcci omici per la scoperta di biomarcatori EV.
Sono necessarie grandi popolazioni di vermi per generare un numero sufficiente di veicoli elettrici per l'analisi del carico. Pertanto, sono inclusi anche metodi per condurre la coltivazione quantitativa di grandi popolazioni di C. elegan sincronizzati allo stesso modo. Tipicamente, quando un gran numero di vermi sono necessari per gli esperimenti, sono coltivati in supporti liquidi. Mentre questo è efficace per generare grandi popolazioni di vermi, la fisiologia degli animali è notevolmente diversa dai vermi coltivati in condizioni standard su piastre di agar nematodio (NGM). Gli animali coltivati nel liquido crescono più lentamente, sono più sottili, mostrano eterogeneità dello sviluppo e sono soggetti a un alto grado di variabilità del lotto. Pertanto, presentiamo un mezzo semplice ma efficace per la coltivazione quantitativa di grandi popolazioni di C. elegansincronizzai sincronizzati con sviluppo utilizzando piastre di crescita elevate 10 cm. La composizione mediatica di piastre ad alta crescita include più peptone rispetto alle normali piastre NGM e vengono seminato con il ceppo E. coli NA22 che cresce più robusto di OP50.
I progressi nella tecnologia della citometria di flusso (FACS) hanno permesso l'analisi diretta dei singoli eV20,,21, consentendo la quantificazione dei veicoli elettrici senza le limitazioni intrinseche di altri metodi. Il lavoro precedente ha dimostrato che la proteina non è un proxy utile per l'abbondanza di EV, perché diverse metodologie di purificazione si traducono in rapporti EV-proteina significativamente diversi22. Le frazioni EV estremamente pure contengono proteine relativamente poche, il che rende difficile quantificare i campioni con gel BCA o Coomassie. L'analisi occidentale può identificare differenze relative di singole proteine, ma non può identificare il numero di VE nel campione. La robusta quantificazione del numero EV mediante l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle è ostacolata dalla sua ristretta gamma segnale-rumore, dall'incapacità di distinguere tra eve e aggregati solidi e dalla mancanza di trasferibilità dei metodi tra strumenti con specifiche diverse23. Pertanto, questo articolo contiene anche una procedura citometrica di flusso generalizzabile per la discriminazione e la quantificazione dei veicoli elettrici.
Protocol
1. Preparazione
- Aggiungere 2 g di gelatina a 100 mL di dH2O e riscaldare nel microonde fino a quando non inizia a bollire. Quindi mescolare e lasciare raffreddare per 20 min.
- Passare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 m e dispensare in tubi sterili. Trattare le punte di pipetta con gelatina immediatamente prima dell'uso coniando ed espellendo la soluzione di gelatina. Le punte trattate possono essere utilizzate immediatamente o conservate.
- Tagliare la membrana da un filtro tappo sterile.
- Sorrida un quadrato di 20 cm di tessuto in rete di nylon di 5 m e posizionalo intorno alla parte superiore di un filtro sterile. Fissarlo con diversi elastici spessi.
AVVISO: esaminare attentamente il tessuto per assicurarsi che non vi siano pieghe. Questi fanno lacune d'aria che ostacolano l'aspirazione.
2. Calcolo di grandi popolazioni di vermi (Figura 1A)
- Vortice e pipetta 10 -L della sospensione del verme su un coperchio della piastra di coltivazione del verme o uno scivolo di vetro. Ripetere questo processo 3x. Registrare il numero di animali in ogni goccia.
- Regolare la sospensione del verme a due animali per zL.
- Vorticare le sospensioni e pipette nove gocce (10 l) su uno scivolo o un coperchio piatto. Contare manualmente il numero di animali. Registrare il numero di animali in ogni goccia.
- Calcolare la media e l'errore standard della media (S.E.M.) come percentuale di ogni popolazione di vermi.
- Calcolare il numero totale di animali in ogni popolazione dividendo il valore medio per 10 l e quindi moltiplicando per il volume totale della sospensione del verme in .L.
Figura 1: Panoramiche delle procedure per generare, quantificare e purificare i VE C. elegans. (A) Schematico per il conteggio di grandi popolazioni di animali. (B)Schema per la generazione di vermi per la raccolta dei veicoli elettrici. (C) Schema per la purificazione dei veicoli elettrici da C. elegans supernital. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Coltivare C. elegans per la purificazione edvde
- Generare un'ampia popolazione di C. eleganssincronizzati in modo convoluzione . A tale scopo, attenersi alla seguente procedura.
- Aggiungere un singolo animale su una piastra mediatica di crescita normale di 6 cm. Incubare per due generazioni e poi lavare gli animali su due piastre medie ad alta crescita.
- Incubare fino a quando i vermi hanno esaurito il cibo.
- Filtrare i vermi L1 con una rete di nylon da 5 m preparata al punto 1.4. Posizionare il tappo della vite sulla bottiglia sterile, avviare il vuoto e versare i vermi sul filtro. Passare lo stesso volume del supporto sopra gli aggregati worm sul filtro.
- Quantificare i worm e calcolare il numero totale (vedere il passaggio 2). Recentemente affamati (<24 h) vermi cresciuti su una piastra ad alta crescita risultano in circa 80.000 larve L1.
- Centrifuga L1 larve a 2.000 x g per 3 min. Risospendi a 100.000 animali per mL.
- Posizionare 50.000 animali per piastra ad alta crescita. Coltivare gli animali a 20 gradi centigradi fino a quando non sono adulti gravidiati (circa 72 h).
- Sbiancare gli adulti gravidi con mezzi standard e consentire agli embrioni di schiudersi in 10 mL di soluzione S Basal con 2,5 g/mL di colesterolo.
- Quantificare le larve l1 (vedere il punto 2) e quindi aggiungere 50.000 vermi ad ogni piastra ad alta crescita.
- Coltivare piastre a 20 gradi centigradi fino a quando gli animali sono giovani adulti.
- Preparare C. elegans per la generazione di secretome.
- Lavare i vermi dalle piastre aggiungendo 15 mL di M9 sterile con carbenicillina di 50 g/mL ad ogni piastra ad alta crescita. Lasciare che le piastre sature si siedano per 5 min. Dislodge vermi facendo circolare il buffer intorno alla piastra. Evitare di sciatto. Versare il tampone da ogni piastra in un tubo conico da 50 mL separato. Ripetere il passaggio di lavaggio 2 volte di più per un totale di 45 mL di tampone per piastra.
- Lasciate che i vermi si accontentino di 15 min. Decant il supernatante e aggiungere 50 mL di tampone M9 fresco al tubo. Ripetere l'operazione per un totale di 4x.
- Galleggiare i vermi sulla parte superiore di un 30% di saccarosio step-gradient e recuperare gli animali nella soluzione S Basal24.
- Risospendere brevemente i vermi in 15 mL di ghiaccio-freddo 100 mM NaCl, aggiungere 15 mL di saccarosio freddo al ghiaccio, e invertire per mescolare. Con una pipetta di vetro delicatamente strato 5 mL di ghiaccio freddo 100 mM NaCl sulla parte superiore della miscela di saccarosio.
- Centrifuga a 1.500 x g per 5 min. I vermi saranno concentrati sull'interfaccia tra il NaCl e il saccarosio.
- Pipette delicatamente gli animali dall'interfaccia in un nuovo tubo conico 50 mL. Aggiungere la soluzione S Basal a 50 mL. Consentire ai vermi di stabilirsi 5 min.
- Decant il supernatante e aggiungere fresco 50 mL di soluzione S Basal. Ripetere questo almeno 3x.
- Quantificare il numero di worm come descritto nel passaggio 2.
- Risospendere i vermi ad una densità di un animale per ogni lega con soluzione sterile S Basal contenente 2,5 g/mL di colesterolo e 50 M di carbenicillina.
- Per preparare il campione per la generazione di secretome, aggiungere fino a 400 mL delle sospensioni ad una flacone sterile 2 L con travaglio.
- Posizionare i flaconi sul rotatore circolare in un'incubatrice di 20 gradi centigradi a 100 giri/min per 24 h.
4. Purificazione EV
- Raccolta e frazionamento
- Rimuovere il pallone 2L dei vermi dall'incubatrice e pellet gli animali in fiale coniche da 50 mL (500 x g per 2 min).
- Versare il supernatante attraverso un filtro a vuoto da 0,22 m per rimuovere eventuali detriti di particolato.
NOTA: A questo punto, il supernatante filtrato contenente il secretoma e le vesciche può essere conservato a -80 gradi centigradi. - Contare il numero di animali come descritto al punto 2.
- Determinare la vitalità dei vermi mettendo una goccia di vermi sospesi su un prato batterico. Attendere 15 min e poi segnare gli animali come in movimento, paralizzato, o morti.
- Concentrare il supernatale filtrato 0,22 m a 700 -L utilizzando unità filtranti di nitrocellulosa rigenerata 10 kDa. Aggiungete 150 L S Basal e poi pipette sopra il filtro e il vortice. Ripetere 2x.
- Centrifugare il soldante concentrato a 18.000 x g per 20 min a 4 gradi centigradi e trasferire il supernatante in un nuovo tubo. Questo passaggio rimuove eventuali detriti o particelle più grandi che potrebbero essersi accumulati durante la manipolazione.
- Aggiungere il cocktail dell'inibitore della proteasi : EDTA in base alle istruzioni del produttore.
NOTA: A questo punto il supernatante concentrato contenente il secretoma e le vesciche può essere conservato a -80 gradi centigradi.
- Cromatografia di esclusione delle dimensioni
- Versare la resina di agarose da 80 a 200 m (intervallo di frazionamento delle dimensioni dei pori da 70.000 a 40.000.000 kDa per proteine globulari) in una cartuccia a colonna a flusso di gravità vuota. Soluzione Flow S Basal fino a quando il letto in resina è imballato ad un volume finale di 10 mL.
NOTA: Se viene versata troppa resina nella cartuccia della colonna, disperdere la parte superiore della colonna e rimuovere l'eccesso con una pipetta. - Passare 40 mL di sterile filtrato S Basal soluzione attraverso la colonna e lasciarlo fluire sotto gravità.
AVVISO: Verificare che la resina non sia disturbata. - Lasciare fluire il buffer fino a quando la parte superiore della resina non è sommersa, quindi capare la parte inferiore della cartuccia della colonna. Posizionare un tubo di raccolta sotto la colonna.
- Rimuovere il tappo posizionato sulla cartuccia. Aggiungere il secretoma concentrato ottenuto nel passaggio 2.1 dropwise nella parte superiore del letto colonna. Pipette 1 mL di S Basal soluzione dropwise. Posizionare un tubo di raccolta fresco sotto la colonna.
- Riempire lentamente il serbatoio della colonna superiore con 5 mL S Basal soluzione per non disturbare la resina. Raccogliere i primi 2 mL di eluato poi cambiare rapidamente i tubi e raccogliere i prossimi 4 mL. Questa è la frazione che è arricchita per i veicoli elettrici.
- Concentrare l'eluate a 300 o L con un filtro rigenerato di nitrocellulosa 10 kDa taglio molecolare (MWCO) e il trasferimento si ritenta in un tubo di microcentrifuga a bassa legatura.
- Lavare la membrana del filtro 2x con 100 gradi l di Soluzione S Basal vortice ndoalante per 20 s e convogliando il buffer attraverso il filtro. Aggiungere al campione iniziale per un volume finale di 500 l.
- Aggiungere il cocktail inibitore della proteasi in base alle istruzioni del produttore.
- Eseguire immediatamente gli esperimenti a valle (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS, ecc.) o memorizzare a -80 gradi centigradi.
- Versare la resina di agarose da 80 a 200 m (intervallo di frazionamento delle dimensioni dei pori da 70.000 a 40.000.000 kDa per proteine globulari) in una cartuccia a colonna a flusso di gravità vuota. Soluzione Flow S Basal fino a quando il letto in resina è imballato ad un volume finale di 10 mL.
5. Quantificazione del flusso di citometria dell'abbondanza di EV
- Preparazione della tintura
- Preparare uno stock di 10 m di DI-8-ANEPPS utilizzando DMSO fresco. Distribuire in 10 aliquote lee e conservare a -20 gradi centigradi.
- Preparare una soluzione di lavoro da 1 mM aggiungendo 90 gradi l di PBS sterile filtrato a un tubo con 10 - L di brodo colorante.
- Preparazione sperimentale dei campioni
- Aggiungere 840 l di soluzione S Basal in un tubo di microcentrifuga. Aggiungere quindi 60 l degli EV purificati generati nella sezione 4.2 e nel vortice.
- Aliquota 300 L del campione in due nuovi tubi di microcentrifuga. Ora c'è un set sperimentale di tre tubi che contengono 300 L di EV diluiti ciascuno. Etichettare i tubi #1–3. Per campionare #2 e #3 aggiungere 7 - L del titolo DI-8-ANEPPS preparato in 5.1.2. Quindi aggiungere 7 -L di 1% Triton-X 100 al tubo #3. Mescolare ogni tubo vortice.
- Sonicato campione #3 mettendo la punta del sonicatore al centro del campione e pulsando 10 volte al 20% di potenza 30% ciclo di servizio.
AVVISO: Assicurarsi che la punta della sonda sonicatore sia al centro del campione in modo che la generazione di schiuma sia mantenuta al minimo. La schiuma può compromettere il campione causando l'aggregazione dei veicoli elettrici. - Aggiungere 300 l di Soluzione S Basal a due tubi di microcentrifuga. Aggiungete 7 pagine del reagente funzionante DI-8-ANNEPS preparato al punto 5.1 al secondo tubo e all'etichetta "Dye Only". Etichettare l'altro tubo "Solo buffer".
NOTA: Preparare i campioni di controllo Solo trate e solo buffer e i campioni sperimentali con la stessa origine S Basal. - Incubare i campioni lontano dalla luce diretta e a temperatura ambiente per 1 h.
- Condurre esperimenti FACS.
- Impostare il filtro di eccitazione FACS su 488 nm (blu) e il filtro di emissione su 605 nm (arancione). Impostare la portata su 1,5 l per min.
- Eseguire il mix di calibrazione faCS nanobead (opzionale ma consigliato).
- Eseguire ogni campione su una macchina FACS per 3 min (180 s). Prendere nota dei tempi di esecuzione esatti in secondi.
- Analizzare i dati FACS.
- Aprire i file con il software di analisi FACS.
- Impostare l'asse Y su 488-Org (Area) facendo clic sull'asse, selezionandolo dal menu a discesa.
- Impostare un cancello rettangolare a partire dalla parte superiore del grafico, che va dal livello SALS 102 a 104 (<300 nm particelle di dimensioni). Estendere il cancello verso il basso fino a che non contiene il 2,5% degli eventi totali. Assegnare al gate il nome "DI-8-ANEPPS" per gli eventi.
-
Quantificazione dell'abbondanza di eV campione
- Copiare questo gate e incollarlo negli altri due esempi del set sperimentale, nonché nei controlli Solo buffer e Solo tinri. Esportare l'analisi in un foglio di calcolo.
- Se gli esempi FACS non sono stati eseguiti per i 3 min consigliati (180 s), normalizzare tutti i conteggi degli eventi nel campione in eventi per 180 s. Ad esempio, se un campione è stato eseguito per 250 s, il numero di evento DI-8-ANEPPS viene ridimensionato di 250 s/180 s.
- Rimuovere gli eventi di sfondo del colorante sottraendo il numero di eventi DI-8-ANEPPS nel controllo Dye Only da quelli nel campione #2.
- Rimuovere gli eventi di sfondo isotipo sottraendo il numero di eventi DI-8-ANEPPS nel #1 del campione.
- Rimuovere gli eventi sensibili al detersivo sottraendo il numero di eventi DI-8-ANEPPS nel campione #3. Questo valore è il numero di EV in buona fede.
- Calcolare il numero di EV in 1 l di campione dividendo il valore calcolato al passo 5.5.5 per il volume analizzato in :L (4,5 : L analizzato come descritto nel passaggio 5.3) e moltiplicando per il fattore di diluizione (10x come descritto nel passo 2.5). Moltiplicare questo valore per il numero di L rimanente nella preparazione EV. Questo è il numero di VEICOLi elettrici disponibili per l'analisi a valle.
Figura 2: Schematica della preparazione del campione di citometria di flusso per quantificare l'abbondanza di EV. (A) La preparazione EV è suddivisa in tre campioni identici. Campione 1 è il controllo negativo No Dye. DI-8-ANEPPS viene quindi aggiunto acampioni #2 e #3. Triton-X 100 viene quindi aggiunto al #3 di campionamento. La freccia verde indica che viene successivamente sonicato solo #3 campione. I dati del flusso aiutano a determinare il numero assoluto di EV sensibili al detergente nei campioni FACS e quindi calcolano l'abbondanza di veicoli elettrici nella preparazione totale. Il cancello per determinare gli eventi coloranti è impostato con #1 campione, che non contiene coloranti. La scrittura rossa sui dati del foglio di calcolo è per illustrare che gli eventi positivi al coloranti del campione trattato con detersivo vengono sottratti dal campione con coloranti. (B) Equazioni per la quantificazione dei veicoli elettrici in un campione analizzato FACS e il calcolo del numero totale di eV nel campione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Representative Results
Uno schema per i processi necessari per la generazione e la purificazione dei VE è illustrato nella Figura 1. I tempi tipici necessari per completare ogni passaggio sono mostrati sotto. Nella figura 2 viene illustrato uno schema per la preparazione di campioni per l'analisi FACS utilizzando DI-8-ANEPPS (Figura 2A) nonché i calcoli necessari per stimare il numero totale di veicoli elettrici in un campione (Figura 2B).
I risultati rappresentativi di 10 repliche biologiche sono riportati nella Figura 3A. La variabilità tra le repliche non è significativa e la tipica Dimensione della popolazione è di poco superiore al 10% (Figura 3B). Filtrare i vermi e coltivare sulle piastre fresche ad alta crescita genererà una grande popolazione di adulti gravidi adatti alla sincronizzazione della candeggina. Una singola piastra affamata lavorata in questo modo può produrre una popolazione sperimentale di 1 x 106 o più progenie sincronizzata perché ogni adulto graviato conterrà circa 10 uova. È possibile mantenere grandi popolazioni di popolazioni sincronizzate con lo sviluppo filtrando ovuli e larve attraverso un filtro da 40 m per ottenere evadi da animali più anziani. Gli adulti mantenuti vengono trasferiti in piastre fresche ad alta crescita ad una densità di 20.000 animali per piastra. Questo processo è stato ripetuto ogni 2 giorni. Figura 3C mostra tre repliche biologiche di popolazioni di vermi che vengono spostati attraverso tre trasferimenti di piastra. Il trasferimento di animali tra piastre comporta una perdita di circa il 10% degli animali (Figura 3C) mentre circa il 20% degli animali viene perso nella fase di galleggiamento del saccarosio (Figura 3D).
Figura 3: Quantificazione di grandi popolazioni di C. elegans per l'analisi EV. (A) Un confronto del numero di vermi dello stadio larvale L1 isolati da un'unica piastra ad alta crescita affamata di recente (<24 h). I valori di ciascuna delle 10 repliche biologiche vengono tracciati. La somma di tutti i punti dati nelle 10 repliche è presentata anche come una trama per violino e bar con S.E.M. Questo dimostra che un singolo piatto di vermi affamati di recente produrrà 80.000 dollari di vermi da stadio larvali L1. (B) Il S.E.M. delle 15 diverse misurazioni della popolazione di lamiere nel pannello A tracciato come singoli punti. In generale, la S.E.M. è leggermente superiore al 10%. (C) Tre repliche biologiche delle popolazioni di vermi sono state stimate dopo ciascuno dei due trasferimenti tra le piastre ogni 4 ore. Questo trasferimento di animali tra piastre non ha comportato una significativa diminuzione delle dimensioni della popolazione. Ciò indica che la metodologia qui presentata per i vermi in movimento non comporta una perdita significativa di animali. (D) Misurazioni della popolazione effettuate nel corso di tre repliche sperimentali di EV: il numero di animali stimati per le larve L1 originali che hanno iniziato l'esperimento, il numero di giovani animali adulti recuperati dal galleggiante di saccarosio e pronti per il periodo di incubazione di 24 ore, il numero di animali contati dalla preparazione del eV al recupero del secretoma. C'è una diminuzione piccola ma non significativa delle dimensioni della popolazione tra la stima iniziale della popolazione nella fase larvale L1 e più tardi quando gli animali sono giovani adulti. La misurazione media della popolazione L1 è stata designata come 100% e tutte le altre misurazioni sono state scalate in base alla loro relazione con questo valore. Barre di errore S.E.M. : valore p < 0,05, N.S. non significativo in un test t accoppiato parametrico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il rapporto proteina-animale è una metrica utile per caratterizzare una preparazione EV. Questa metrica può fornire un mezzo rapido per determinare la coerenza tra i preparati ev. In media, 1.000 animali giovani adulti di tipo selvatico secerneranno 1 g di proteine più grandi di 10 kDa nel loro ambiente (Figura 4A). Quando questa frazione è ulteriormente separata dalla cromatografia di esclusione di dimensioni, il profilo di eluizione totale delle proteine mostra un piccolo picco proteico tra 2-6 mL e un grande picco dopo 8 mL. I VE sono contenuti nei primi 5 mL della colonna eluate (Figura 4B). L'analisi del monitoraggio delle nanoparticelle i primi 5 mL dell'eluato della colonna contengono una popolazione monodisperspersa di piccoli eV da 150 dollari (Figura 4C). La microscopia elettronica a trasmissione delle frazioni di esclusione di dimensioni rivela abbondanti EV nella frazione di eluate da 2-6 mL, ma non nei volumi di eluato successivi. Gli EV sono noti per la loro forma simile a una tazza e sono quindi facili da discriminare dalle particelle solide che appaiono come punti luminosi perforati se preparati in condizioni di colorazione negativa (Figura 4D).
Figura 4: Purificazione dei tele evani C. elegans dalla biomassa secerrofa totale. (A) È stato tracciato il rapporto tra le proteine totali superiori a 10 kDa e il numero di vermi incubati nella preparazione di 10 repliche biologiche. La maggior parte dei preparati conteneva 1 g di proteine per 1.000 animali. (B) Profilo di eluizione proteica da una colonna di resina da 10 mL caricata con 1 mL del secretoma concentrato. Le frazioni che vengono consolidate in ulteriori analisi sono ombreggiate in gruppi. (C) Analisi del tracciamento delle nanoparticelle della resina consolidata eluita frazioni 2–6 mL. L'intervallo di confidenza del 95% è ombreggiato in grigio. (D) Analisi TEM della resina consolidata elardata frazioni. Il materiale di partenza aveva sia particelle vesciche che particelle non vesciche. La frazione di eluizione consolidata da 2-6 mL è stata arricchita per le vesciche con poche particelle non vesciche. Le frazioni consolidate da 7-11 mL contenevano poche particelle vesciche, ma molte particelle non vesciche. Le frazioni di eluizione da 12-15 mL contenevano solo particelle non vesciche. Tutte le micrografie sono mostrate con lo stesso ingrandimento. Barra della scala: 200 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per confrontare direttamente le caratteristiche della citometria di flusso tra C. elegans e EV umani, abbiamo purificato gli EV dai mezzi di coltura cellulari dei neuroni umani con questo metodo. La citometria di flusso separa le particelle in base alla dispersione della luce. La dispersione della luce ad angolo piccolo (SALS) è approssimativamente correlata alle dimensioni e la dispersione della luce ad angolo lungo (LALS) è correlata alla struttura della membrana interna. La maggior parte degli eventi campione totali sia dalla coltura cellulare che dai preparati EV di C. elegans sono strettamente focalizzati in un cluster centrato su 103 SALS e 104 LALS (Figura 5A). Un istogramma di eventi campione C. elegans EV ordinati da SALS mostra che tutti i preparativi raggiungono il picco di 103 (Figura 5B).
Figura 5: I C. elegans EV sono chiaramente definiti dalle loro proprietà di dispersione della luce. (A) Istogramma degli eventi SALS in tre repliche biologiche di C. elegans EV. L'80% degli eventi campione totali è contenuto in una popolazione stretta e chiaramente definita. Simile all'analisi del monitoraggio delle nanoparticelle, mostra che la distribuzione delle dimensioni degli EV C. elegans è monodispersione. L'istogramma del buffer S Basal utilizzato per diluire i campioni è mostrato per il confronto. (B) Confronto delle proprietà refrattive di C. elegans e dei veicoli di coltura delle cellule umane purificato con i metodi descritti in questo testo. Entrambi i tipi di EV presentano costantemente distribuzioni di dispersione della luce a breve e ad angolo lungo comparabili (SALS e LALS). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il DI-8-ANEPPS etichetta robustamente C. elegans EV, evidenziando costantemente la maggior parte degli eventi totali sia nel C. elegans e coltura cellulare campioni derivati. Le perline e i controlli di calibrazione sono presentati in Figura 6A. I singoli grafici a dispersione FACS sono mostrati da un campione di C. elegans preparato da 200.000 animali (#1) e due preparati da 500.000 animali (Figura 6B). Sono stati analizzati anche gli eV da 100 mL (#1) o 200 mL (#2,3) dicolturecellulari ( Figura 6C). Sia C. elegans che la coltura cellulare hanno derivato campioni hanno mostrato abbondanti eventi fluorescenti che sono scomparsi quando trattati con 0,05% Triton-X 100 e la sonicazione della luce. Ciò dimostra che gli eventi etichettati sono strutture detergenti per fosfolipidi labili (vesfori) piuttosto che aggregati di lipoproteina solida insensibile al detergente. L'abbondanza di EV è calcolata come la differenza tra il numero di eventi nel cancello DI-8-ANEPPS tra le frazioni senza detergente (-) e con detersivo (-) meno gli eventi nel controllo Solo tantera. Per chiarezza, i dati presentati singolarmente in Figura 6B e Figura 6C è riepilogato come grafici a barre in Figura 6D e Figura 6E. L'abbondanza dei VE purificati non era significativamente diversa tra i C. elegan e i preparati derivati dalla coltura cellulare (Figura 6F).
Figura 6: Esempi di dati di citometria di flusso utilizzati per calcolare l'abbondanza di EV. (A) Per garantire che il numero di eventi possa essere confrontato direttamente tra i campioni, i controlli Solo buffer e Buffer e Solo tadio devono essere eseguiti alla stessa velocità di flusso e allo stesso tempo di raccolta delle frazioni campione EV. Ci sono pochissimi eventi nel cancello DI-8-ANEPPS. (B) Risultati rappresentativi del di-8-ANEPPS e del protocollo di trattamento dei detergenti di C. elegans. Vengono mostrate tre repliche biologiche. La #1 di replica biologica è stata preparata da 200.000 animali, mentre #2 e #3 sono stati preparati da 500.000 animali. La scomparsa dei veicoli elettrici con il trattamento detergente è chiara in tutti i casi. (C) Risultati rappresentativi del di-8-ANEPPS e del protocollo di trattamento del detersivo utilizzando mezzi di comunicazione condizionati dalla coltura cellulare umana. Le repliche biologiche #1 e #2 sono stati preparati da 200 mL di supporti condizionati, mentre la replica biologica #3 è stata preparata da 100 mL. (D)Grafico a barre dei dati raccolti dalle tre repliche biologiche dei VEICOLi C. elegan. Barre di errore - S.E.M. Test t a due code accoppiati tra i trattamenti. p < 0.001. (E) Grafico a barre dei dati raccolti dalle tre repliche biologiche della coltura cellulare derivate dagli EV. Test di t a due code accoppiati tra i trattamenti. Valore p < 0.001 (F) Il numero di eventi sensibili al detersivo con etichettatura colorante per ogni proprietà è stato calcolato per tutte le repliche biologiche di C. elegans e della coltura cellulare. I valori tra le due sorgenti del campione EV non sono significativamente diversi. Test di t a due code accoppiati tra i trattamenti valore p : 0,685. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La tabella 1 contiene i valori sperimentali grezzi per l'intero 4,5 - L di ogni tipo di campione analizzato. Il numero totale di eventi raccolti dalle frazioni EV purificate da 500.000 animali è stato 10-20volte rispetto al numero di base di particelle raccolte solo dal buffer, mentre la frazione purificata da 200.000 animali conteneva circa 2 volte tanti eventi del solo buffer. Per ogni campione viene inoltre visualizzato il numero di eventi all'interno del gate DI-8-ANEPPS. Queste metriche possono essere importate in un foglio di calcolo per calcolare il numero di EV positivi al colorante e sensibili al detersivo come descritto sopra. Ad esempio, il numero di EV in 1 mL della prima replica biologica C. elegans mostrata sarebbe calcolato in questo modo:
(18.974 – 3.853 - 1.487) x (10/4,5) x 1.000 x 30.297.778.
Tabella 1: dati di citometria di flusso tabulati. I dati illustrati nella Figura 6 vengono presentati come un foglio di calcolo. Per ogni esempio vengono visualizzati gli eventi totali e gli eventi con gate di DI-8-ANEPPS. Ogni replica biologica è disposta nell'ordine dei campioni #1–3 nel protocollo. Queste metriche rivelano che il numero totale di eventi raccolti dai campioni di C. elegans preparati da 500.000 animali o 200 mL di supporti condizionati dalla coltura cellulare era 10-20 volte rispetto al numero di fondo delle particelle raccolte dal solo buffer, mentre la replica biologica purificata da 200.000 animali conteneva circa 2 volte il numero totale di eventi pari al buffer. Per ogni campione viene inoltre visualizzato il numero di eventi all'interno del gate DI-8-ANEPPS. Queste metriche possono essere esportate in un foglio di calcolo per calcolare il numero totale di veicoli elettrici. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Discussion
Una sfida fondamentale del settore EV è separare l'ampia varietà di sottotipi EV2. I metodi qui descritti utilizzano la filtrazione, la centrifugazione differenziale e la cromatografia ad esclusione di dimensioni per generare una popolazione pura di piccoli veicoli elettrici, in quanto in precedenza sono stati mostrati essere secreti nell'ambiente esterno e funzionare in percorsi di comunicazione fisiologicamente rilevanti16. I veicoli elettrici purificati attraverso la cromatografia ad esclusione di dimensioni possono ancora essere una miscela di esosomi e piccoli microvescicoli perché queste sottoclassi EV sono di dimensioni simili. Le sottoclassi Di EV vertebrate sono comunemente separate dall'immunoprecipitazioni perché questo metodo isola gli EV mediante il legame ai marcatori selettivi delle proteine della membrana. I metodi descritti facilitano l'identificazione delle proteine del marcatore della membrana C. elegans EV. Pertanto, in futuro potrebbe essere possibile separare ulteriormente piccole sottoclassi EV attraverso metodi di immunoprecipitazioni analoghi. In teoria, l'immunoprecipitazioni potrebbe isolare i veicoli elettrici dai vermi ben nutriti perché gli E. coli EV non dovrebbero interagire con gli anticorpi. I ricercatori interessati a identificare le proteine e i carichi genetici delle sottoclassi EV più grandi (>200 nm) possono farlo saltando la fase di filtrazione di 0,22 m e quindi analizzando il pellet piuttosto che il supernatante. Scoprire le proteine e l'abbondanza genetica di carico dei grandi veicoli elettrici stabilirà una comprensione più completa dei processi fisiologici che funzionano attraverso il secretome C. elegans. Oltre ad essere secreti nell'ambiente, c. elegans EV vengono trasferiti internamente tra i tessuti. Pertanto, questi metodi isolano solo un sottoinsieme dei VE C. elegans totali. Tuttavia, la scoperta del carico dei veicoli elettrici interni non è possibile perché non esiste un metodo per separare i veicoli elettrici dai vermi lisci. L'analisi del carico di questo sottoinsieme EV secreto esternamente fornisce un mezzo per identificare i potenziali marcatori proteici EV generali in grado di etichettare anche i veicoli elettrici interni.
La portata della preparazione del vela dipenderà dalle esigenze dell'esperimento. Un totale di 500.000 giovani adulti fornisce un numero sufficiente di veicoli elettrici per condurre la citometria del flusso, l'LC-MS-MS e l'analisi degli RNAaseq in parallelo. Questo numero può essere scalato verso l'alto o verso il basso a seconda delle esigenze sperimentali. Il più grande fattore pratico per la scalabilità verticale è il numero di piastre di crescita alte 10 cm. Le placche ad alta crescita preparate con 500. Pertanto, per condurre un esperimento con 500.000 adulti, sono necessarie 13 piastre ad alta crescita: una piastra per generare la popolazione di L1, due piastre per generare gli adulti per lo sbiancamento e 10 piastre per la crescita degli animali sperimentali. Queste metriche dipendono dalle condizioni di seeding e crescita batterica delle piastre ad alta crescita. Pertanto, si consiglia di fare tutte le piastre in modo standardizzato e quindi calibrare con quantità note di animali.
I vermi vengono conteggiati in due fasi durante il processo di coltivazione: 1) prima di seminare vermi su piastre e 2) prima di generare il supporto condizionato. È stato dimostrato che la densità di coltivazione animale influisce sul comportamento, lo sviluppo e le risposte allo stress15,16,1717,18 e possono, quindi, influenzare anche i carichi EV. Pertanto, per una densità di coltivazione coerente è necessario stimare con precisione le popolazioni di vermi. Quantificare il numero di vermi in nove gocce dà la fiducia statistica delle stime della popolazione. È essenziale trattare ogni goccia singolarmente, vortice tra ogni goccia e inserendo la pipetta alla stessa distanza nella sospensione del verme. L'assunzione di queste precauzioni garantirà valori S.E.M. del 5-10% della popolazione totale. Se lo S.E.M. per una popolazione di vermi è superiore al 20%, allora qualcosa è andato storto.
Dopo il periodo di incubazione privo di batteri di 24 h, giovani, selvatici di tipo C. elegan strisciano immediatamente dopo l'aggiunta a un prato batterico. Ciò indica che l'incubazione non influisce gravemente sulla loro salute. Tuttavia, questo passo influenza la fisiologia degli animali e quindi può influenzare la composizione dei carichi EV. Pertanto, quando si lavora con genotipi molto malati o animali più anziani, è essenziale verificare la fattibilità dopo la fase di incubazione. Se tutti gli animali non sopravvivono all'incubazione, aumentare le dimensioni della popolazione sperimentale e diminuire il tempo di incubazione. Quando si lavora con grandi volumi di supporti condizionati, è più pratico utilizzare un concentratore a cellule agitate con un filtro in nitrocellulosa rigenerata. Gli eV non si legano a questa chimica del filtro con la stessa intensità di altri tipi di filtro14.
Il rapporto tra la proteina totale recuperata dai supporti condizionati e il numero di animali incubati per preparare la preparazione è una metrica utile. Se questo rapporto è molto più alto del previsto, è possibile che le stime della popolazione fossero fuori o che gli animali siano morti e deteriorati nei mezzi di comunicazione condizionati. Se questo rapporto è molto più basso del previsto, allora alcune proteine potrebbero essere state perse sui filtri durante il processo di concentrazione. Mentre i metodi FACS quantificano direttamente i veicoli elettrici nella preparazione, questa metrica è utile perché può evidenziare anomalie campione nelle prime fasi del processo. Un altro metodo utile per verificare la qualità della preparazione EV è la microscopia elettronica di trasmissione, come illustrato nella Figura 4D. Anche se il protocollo per la microscopia elettronica di trasmissione non è formalmente incluso in questo articolo metodi a causa della lunghezza, può essere condotto con metodi standard. Si raccomanda di condurre questo tipo di analisi, almeno inizialmente, come metodo gratuito per FACS per valutare la qualità dei preparati EV. Per ottenere i migliori risultati utilizzare griglie formvar-carbonio appena scaricate e macchiare i campioni con 2% di acido fosforico al posto di acetato di uranilo.
DI-8-ANEPPS è stato scelto perché ha dimostrato di etichettare quantitativamente le membrane EV, sovraperformando altri coloranti EV generali con campioni di biopsia umana e liposomi25. Le misure sono veloci, prendendo solo 3 minimo di tempo di raccolta per ogni campione. La quantificazione dei VE sensibili al detersivo ha un significato funzionale diretto perché sfrutta una distinzione fisica fondamentale tra ev e aggregati di lipoproteina solida. È importante sottolineare che questo metodo non è influenzato dalla quantità di proteine totali o dal numero di aggregati non EV e pertanto può quantificare gli EV ottenuti attraverso diversi metodi di purificazione in modo imparziale. La metrica EV verificata da FACS che descriviamo qui sarebbe particolarmente utile per gli studi che dimostrano impatti fisiologici dei veicoli elettrici purificati. Potrebbe anche essere vantaggioso il campo EV in generale stabilire una metodologia FACS come metrica universale in modo che l'abbondanza assoluta di EV possa essere confrontata direttamente tra gli studi. I coloranti vitali possono anche etichettare C. elegans EV, ma non sono brillanti come eV etichettati con Di-8-ANEPPS.
Questo approccio di purificazione sfrutta la secrezione attiva dei veicoli elettrici al di fuori dei corpi di vermi viventi intatti. Ciò consente acve C. elegans EV di essere isolati a purezza e abbondanza comparabili a partire dalla coltura cellulare, specifiche che sono sufficienti per identificare centinaia di carichi di proteine e RNA tramite l'analisi LC-MS-MS e RNAseq26. Così, l'ampia libreria di reagenti disponibili per la ricerca c. elegans può essere sfruttata per studiare l'influenza della perturbazione genetica e fisiologica sulla composizione del carico EV.
Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Riconosciamo con gratitudine Nick Terzopoulos per le piastre di vermi e i reagenti; il Caenorhabditis Genetics Center (CGC) presso l'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440) per la linea n2 nematode; Lucia Vojtech, PhD, per assistenza con l'analisi del monitoraggio delle nanoparticelle; Jessica Young, PhD, e Marie Claire, MD, PhD, per supporti cellulari condizionati neuronali derivati da hiPSC; Wai Pang per assistenza con l'imaging TEM. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH P30AG013280 a MK e dalla sovvenzione NIH AG054098 a JCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
| 1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05% to lyse EVs |
| 10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
| 2 L bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
| 40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
| 5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
| 6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
| Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
| ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
| DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
| Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
| Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
| HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
| Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
| S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
| Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
| Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |
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