Summary
מטרת שיטה זו היא להציג שיטה פשוטה ויעילה עבור זלוף, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר לבדיקת פתולוגיה גידול ריאות והערכת גרורות לריאה.
Abstract
היכולת להעריך היסטולוגיה של ריאות היא קריטית לתחומי חקר סרטן ריאות וגרורות סרטן. חשוב באותה מידה לבצע necropsies במהירות וביעילות ממחקרים מבלי להקריב את איכות הרקמות שנרכשו. מטרת פרוטוקול זה היא להציג שיטה להחדיר במהירות, לנפח ולתקן ריאות עכבר לניתוח היסטולוגי במורד הזרם. שיטה זו אינה מתקן את אינפלציית הריאות; לכן, זה לא דורש כל נהלים מיוחדים או ציוד ובמקום זאת פשוט מחדיר קיבוע ישירות דרך קנה הנשימה בעקבות זלוף דרך הלב. זה מאפשר הערכה מספקת של גודל הגידול, היסטולוגיה, וניקוד. זה גם מאפשר איסוף של רקמה קפואה לפני קיבוע רקמת הריאה. שיטה זו מוגבלת בכך שהיא אינה מאפשרת כימות מורפומטרי מאוחר יותר של הריאה; עם זאת, זה יותר ממספיק לניתוח גידול ריאות ממודלים עכבר מהונדסים גנטית (GEMMs), מודלים סינגניים, כמו גם גידול קסנוגרפט ומחקרי גרורות.
Introduction
קיימים מגוון דגמי עכברים של אונקוגנזה ריאה וגרורות סרטן לריאה, החל מ- GEMMs מורכבים ועד דגמים הנגרמים על ידי מסרטן ועד מודלים סינגניים ושנאת זרים, שבהם מוזרקים תאים סרטניים באמצעות אינטרקרדיאק, תוך-עורית, וריד הזנב או שיטות אחרות לביסוס גידולים בריאה. כל המודלים האלה חולקים את הצורך המשותף להערכה היסטולוגית של היסטולוגיה של ריאות ופתולוגיה. לכן, יש צורך בשיטה חזקה אך מהירה לבצע necropsies של עכברים תוך זלוף הריאות כדי להסיר דם עודף, ניפוח ותיקון הריאות כדי לדמיין בבירור את ארכיטקטורת הריאות. מהירות היא מרכיב קריטי של הליך זה כפי שייתכן שיהיה צורך לאסוף את הריאות מעשרות עכברים בנקודת זמן אחת. ניתן לבצע הליך זה בפחות מ- 6 דקות לכל עכבר.
בעוד הליך זה הוא יותר ממספיק להערכת היסטולוגיה הגידול, זה לא מומלץ עבור אלה המעוניינים לבצע מדידות סטריאולוגיה או morphometric של הריאות. מדידות כאלה דורשות אינפלציית ריאות להיות סטנדרטית, כמו גם את החישוב של שטח הפנים המוחלט של הריאה, נפח מוחלט, וגודל מכתשי ומספר1. שיטה זו גם אינה אופטימלית עבור גישות הדמיה מסוימות. לדוגמה, הדמיה של הריאות באמצעות μCT לניתוח מורפומטרי אקס ויוו דורשת שהריאות יישארו מלאות באוויר2. כאשר שימור המרחבים והממדים האוויריים הם הדאגה העיקרית, מומלץ לתקן את הריאות על ידי טכניקות התייבשות זלוף3,4. אחד החששות הגדולים ביותר של מודל זה הוא הפוטנציאל לקרע של קירות מכתשים, להפחית את השימוש בו במחקרים של נפחת; עם זאת, ההליך המומלץ לקיבעון הריאות לחקר אמפיזמה עדיין דומה למדי, שכן מומלץ לתקן את הריאות או על ידי החדרה תוך-טרה-סחית של 10% פורמלין (בדומה לפרוטוקול המתואר כאן) תחת לחץ נוזלים מתמיד או על ידי קיבוע5.
היתרון של ההליך המתואר כאן הוא שזה לא דורש לחץ נוזלים מתמיד, במקום לנפח את הריאות עד שהם התרחבו באופן מלא, ובכך להקטין את הזמן הדרוש להליך. ההליך המתואר כאן דומה מאוד לשיטות המומלצות על ידי חימוש של האגודה לפתולוגיה טוקסיקולוגית, שם הוקמה ועדת משנה להמליץ על השיטות הטובות ביותר של קיבוע ריאות למחקרי רעלים. רוב המדענים בתוך ועדת משנה זו המליצו לתקן את הריאות על ידי החדרה תוך-סטריאלית עם מזרק, אם כי היו המלצות שונות בזמן שהריאה הושארה בקיבעון6. לכן, בעוד מגוון שיטות של אינפלציה ריאות קיבעון קיים, השיטה המתוארת בזאת מוצע להיות השיטה האופטימלית במהירות לנפח ולתקן את הריאות להערכה היסטולוגית גידול במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת אלבמה בברמינגהם.
1. פרוטוקול ניסיוני
- הקרב את העכבר באמצעות שיטת IACUC מאושרת. כאן, השתמשנו נקע צוואר הרחם של עכבר הרדמה עם 5% isoflurane. השתמש בעכבר מתאים למחקר; כאן, אנו משתמשים בעכבר FVB בן 8 שבועות
- באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך אופקי 3.5-5 מ"מ באמצע הבטן התחתונה. לאחר מכן, הכנס מספריים כירורגיים לתוך החור הקטן שנוצר חתך לחתוך אנכית במעלה קו האמצע המרכזי רק מתחת לצוואר של העכבר.
- משוך את העור לאחור עם האצבעות ולבדוק את בלוטות הלימפה בבית השחי.
- באמצעות מספריים כירורגיים, לעשות חתך לרוחב 3.5 מ"מ כדי לפתוח את חלל הבטן, ולאחר מכן לחתוך בכיוון החזית עד לתחתית בית החזה. בדוק את האיברים בחלל הבטן: כבד, טחול, כליות וכו '.
- עם הדירה של מספריים כירורגיים, או באמצעות מלקחיים, להזיז את הכבד כדי לחשוף את הסרעפת. בדוק את הסרעפת לצמיחה הגידול או גרורות. לאחר מכן, בעדינות לצלוך את הסרעפת בצד ימין של המפעיל, ומאפשר לו להתרחב. חותכים בעדינות את הסרעפת מימין לשמאל כדי לחשוף את חלל בית החזה והריאות. תיזהר לא לחתוך את הריאות.
- חותכים דרך הקיצוניות לרוחב של כלוב הצלעות השמאלי (בצד ימין של המפעיל) כדי לבדוק את האונה השמאלית של הריאות.
- בעדינות להזיז את האונות הימניות של הריאה מהדרך לחתוך את הקיצוניות לרוחב של כלוב הצלעות הימני ולהסיר כלוב צלעות.
הערה: הסרת כלוב הצלעות היא אופציונלית, אם כי ההסרה מאפשרת תצוגה ברורה יותר של אינפלציית ריאות מאוחרת יותר.- אם יש צורך ברקמת ריאה טרייה או קפואה, יש להשתמש במלקחיים של המוסטט כדי להדק את הסימפונות של האונה השמאלית ולכרות את הריאה השמאלית באמצעות מספריים כירורגיות לפני הזלוף.
- באמצעות מלקחיים כדי להרים את הרקמה מכסה את קנה הנשימה, לחתוך כל רקמה עודפת. ואז לחתוך בעדינות את הרקמה הדקה רירית קנה הנשימה כדי לחשוף את דרכי הנשימה.
- חותכים דרך עורק הכליה עם מספריים כירורגיים.
- כדי לעיין בריאות, להשתמש מזרק 3 מ"ל עם מחט 22 G להזריק 1x PBS עם 10 U / mL הפרין לתוך החדר הימני של הלב. לאט לחלחל את הריאות בערך 300 μL / s עם PBS / הפרין. הריאות יהפכו לעתים קרובות ללבנות. 2.5 מ"ל של PBS משמשים בדרך כלל בשלב זה.
- לאינפלציית ריאות, השתמש במזרק 3 מ"ל עם מחט 22 גרם, הפעם מוחזק במקביל לקנה הנשימה. הכנס את המחט לתוך קנה הנשימה ולהזריק 10% פורמלין עם קצב זרימה לא יותר ~ 200 μL / s עד הריאות יש מנופח לחלוטין. ברגע שהריאות מנופחות, הפורמלין יחזור לזרום מקנה הנשימה. החזק את המחט במקום עוד כמה שניות ולאחר מכן לסגת.
- (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' לפני משיכת מחט ואינפלציה ריאות, להשתמש בחוט תפר כדי לקשור את קנה הנשימה. כדי להשיג זאת, השתמש 4 סנטימטרים של חוט תפר מחזיק את הנקודה של החוט עם זוג קטן של מלקחיים. מניחים את החוט בצד הגבי של קנה הנשימה ולמשוך דרך לעשות לולאה סביב המחט. לאחר מכן ליצור קשר מעל פני המחט. משוך קשר חזק, להסיר מחט מקנה הנשימה, קשר קרוב.
- השתמש מלקחיים כדי להרים את הלב, להכניס מספריים כירורגיים ישירות מאחורי הריאות, לחתוך רקמת חיבור תוך הרמת הלב כדי לכרות ריאות.
- חותכים את הלב כדי להסיר אותו מהריאות.
- מניחים את הריאות קלטת עם מזהה העכבר או מזהה המחקר. ניתן להשאיר את הריאות בתיקון במשך למעלה משנה במידת הצורך.
- מעבירים את הקלטת המכילה את הריאות ל-70% אתנול וממשיכים לעיבוד היסטולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול לעיל מאפשר זלוף מהיר, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר. הנתונים המוצגים להלן מייצגים את החשיבות של כל שלב. איור 1 מתאר ריאות מוכתמות H&E שהודבקו ל-PBS ולריאות שבהן דילגו על שלב הזלוף או שהריאות לא הצליחו לחלחל כראוי. כפי שמוצג, עודף דם בריאות perfused גרוע יוצר פחות היסטולוגיה אידיאלי יכול לעשות את זה מאתגר כדי להתבונן באופן מלא ארכיטקטורת ריאות. איור 2 ממחיש הן את חשיבות האינפלציה והן את הסכנות של אינפלציית יתר. קשה יותר לזהות אזורים של היפרפלזיה בריאות לא מנופחות בשל דחיסה וקרבה של alveoli; עם זאת, בריאות מנופחות יתר על המידה, רבים מקירות מכתשים נשברו וזה יכול להיות בטעות אמפיזמה אם לא זהיר. איור 3 מתאר היסטולוגיה של גידולים בריאות אשר חלחלו וניפחו באמצעות הטכניקה המתוארת בזאת.
איור 1: צביעת H&E מייצגת של ריאות מפוזרות ולא חד-מותכות. (A)ריאות חדורות PBS. (B)ריאות לא התמלאו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כתמי H&E מייצגים של ריאות מנופחות, לא מנופחות ומנופחות יתר על המידה. הריאותהיו מנופחות ומתוקנות עם 10% פורמלין עד שהריאות התרחבו לחלוטין. (B)הריאות לא היו מנופחות דרך קנה הנשימה ובמקום זאת הונחו ישירות בפורמלין 10%. (ג)הריאות היו מנופחות וקבועות עם 10% פורמלין אבל 10% פורמלין נדחף ברציפות לתוך הריאות בעבר התרחבות מלאה וכתוצאה מכך אינפלציית יתר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: צביעת H&E מייצגת של ריאות עכבר מנופחות ומנופחות. (A)גידולים ריאות נגרמו באמצעות אורתן מסרטן כימי. (B)גרורות ריאות ספונטניות מקו תא קסנוגרפט אנושי אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך המתואר לעיל עבור זלוף, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר הוא אידיאלי עבור הכנה מהירה ויעילה של ריאות העכבר עבור היסטולוגיה גידול ריאות וניתוח פתולוגיה. ההליך אינו דורש כל ציוד מיוחד והוא יכול להתבצע בתוך פחות מ 6 דקות לכל עכבר. ההליך אינו דורש נפח קבוע לאינפלציה או לחץ נוזלים מתמיד. מכיוון שהליך זה אינו מתוקנן, לא מומלץ למי שרוצה לבצע ניתוחים סטריאולוגיים או מורפומטריים של הריאה. נהלים שבהם נדרש סטנדרטיזציה כזו תוארו טוב יותר1,7.
הצעדים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם זלוף ואינפלציה. חשוב לחלחל דרך החדר הימני של הלב, ואילו אם זלוף נעשה דרך החדר השמאלי, הריאות לא לעיין. קל לדעת אם זלוף נעשה כראוי כמו הריאות יהפוך לבן. החדרת קיבוע דרך קנה הנשימה מאפשרת אינפלציה של הריאות, המאפשר ניתוח היסטולוגי קל יותר במורד הזרם של ארכיטקטורת הריאות. חשוב להפסיק את הניהול של קיבוע ברגע הריאות התרחבו באופן מלא, כמו אינפלציית יתר יכול לגרום שבירה קיר מכתשי ואת המראה של נפחת. ברגע שהריאות מנופחות, הפורמלין ייצא מהקנה הנשימה. זה נורמלי ואינו משפיע על ניתוח היסטולוגי במורד הזרם; עם זאת, אם זה חשש קנה הנשימה יכול להיות קשור לפני כריתת הריאות.
בעוד פרוטוקול זה משתמש 10% אגירה פורמלין כדי לתקן את הריאות, שהוא התיקון המומלץ ביותר5,6, ישנם דיווחים על חפצים שהוצגו על ידי זה קיבוע, כלומר התכווצות של רקמת הריאה1,8. אם זה חשש, בצע את ההנחיות של האגודה האמריקנית לבית החזה ואת האגודה האירופית לנשימה להערכת מבנה הריאות1. עוד תיקון פוטנציאלי לא מומלץ בדרך כלל אבל זה עשוי להוכיח שימושי הוא הפתרון של Bouin, אשר עשוי לספק ניגודיות טובה יותר להערכת גושים משטח ריאות9,10. לסיכום, הפרוטוקול המתואר בזאת מספק שיטה חזקה ופשוטה עבור קיבוע ריאות העכבר עבור היסטולוגיה הגידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום תחת מספר הפרס UL1TR003096 (MDE), מלגת הלב, הריאות והמכון הלאומי למחלות ריאה 5T32HL134640 (MLD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography. Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).
- Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. Lung fixation for the preservation of air spaces. Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).
- Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions. Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species. American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).
- Edmonds, M. D., et al. MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).
- Zhao, K., et al. Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways. PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).
