Summary
Het doel van deze methode is om een eenvoudige en efficiënte methode voor de perfusie, inflatie en fixatie van muislongen te presenteren voor het onderzoek van longtumorpathologie en evaluatie van uitzaaiingen naar de long.
Abstract
Het vermogen om long histologie te evalueren is van cruciaal belang voor het gebied van longkankeronderzoek en kankermetastasen. Het is even belangrijk om snel en efficiënt obducties uit studies uit te voeren zonder de kwaliteit van de verkregen weefsels op te offeren. Het doel van dit protocol is om een methode te presenteren om de muizenlongen snel te doordrenken, op te blazen en te fixeren voor downstream histologische analyse. Deze methode standaardiseert de longinflatie niet; het vereist dus geen speciale procedures of apparatuur en brengt in plaats daarvan eenvoudig fixatief rechtstreeks door de luchtpijp na perfusie door het hart. Dit maakt een voldoende schatting van tumorgrootte, histologie en score mogelijk. Dit maakt het ook mogelijk om bevroren weefsel te verzamelen voorafgaand aan longweefselfixatie. Deze methode is beperkt in die zin dat het geen latere morfometrische kwantificering van de long mogelijk maakt; het is echter meer dan voldoende voor longtumoranalyse van genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMMs), syngeneïsche modellen, evenals xenografttumor- en metastasestudies.
Introduction
Er bestaan verschillende muismodellen van longoncogenese en kankermetastase naar de long, variërend van complexe GEMMs tot kankerverwekkende modellen tot syngenetische en xenograftmodellen, waarbij kankercellen worden geïnjecteerd via intracardiac, intrathoracale, de staartader of andere methoden om tumoren in de long vast te stellen. Al deze modellen delen de gemeenschappelijke behoefte aan histologische evaluatie van long histologie en pathologie. Het is dus noodzakelijk om een robuuste maar snelle methode te hebben om obducties van muizen uit te voeren terwijl de longen worden doordrongen om overtollig bloed te verwijderen en de longen op te blazen en te fixeren om de longarchitectuur duidelijk te visualiseren. Snelheid is een cruciaal onderdeel van deze procedure, omdat het nodig kan zijn om de longen van tientallen muizen op één moment te verzamelen. Deze procedure kan in minder dan 6 minuten per muis worden uitgevoerd.
Hoewel deze procedure meer dan voldoende is voor het evalueren van tumor histologie, wordt het niet aanbevolen voor degenen die stereologie of morfometrische metingen van de longen willen uitvoeren. Dergelijke metingen vereisen dat de longinflatie wordt gestandaardiseerd, net als de berekening van het absolute oppervlak van de long, het absolute volume en de alveolaire grootte en nummer1. Deze methode is ook niet optimaal voor sommige beeldvormende benaderingen. Beeldvorming van de longen via μCT voor ex vivo morfometrische analyse vereist bijvoorbeeld dat de longen gevuld blijven met lucht2. Wanneer het behoud van de luchtruimten en de afmetingen de belangrijkste zorg zijn, wordt aanbevolen om de longen te repareren door middel van perfusie-uitdrogingstechnieken3,4. Een van de grootste zorgen van dit model is het potentieel voor rupturen van de alveolaire wanden, waardoor het gebruik ervan in studies naar emfyseem wordt verminderd; de aanbevolen procedure voor fixatie van longen voor de studie van emfyseem is echter nog steeds vrij vergelijkbaar, omdat het wordt aanbevolen om de longen te fixeren door intratracheale instillatie van 10% formaline (vergelijkbaar met het hier beschreven protocol) onder constante vloeistofdruk of door fixatie in situ5.
Het voordeel van de beschreven procedure hier is dat het geen constante vloeistofdruk vereist, in plaats daarvan de longen opblaast totdat ze volledig zijn uitgebreid, waardoor de tijd die nodig is voor de procedure wordt verminderd. De hier beschreven procedure lijkt sterk op de methoden die worden aanbevolen door een bewapeningsarium van de Society of Toxicologic Pathology, waar een subcommissie werd gevormd om de beste methoden voor longfixatie voor toxicologische studies aan te bevelen. De meerderheid van de wetenschappers binnen deze subcommissie adviseerde om de longen te repareren door intratracheale instillatie met een spuit, hoewel er verschillende aanbevelingen waren over de tijd dat de long in het fixatieve6werd achtergelaten. Hoewel er dus verschillende methoden voor longinflatie en fixatie bestaan, wordt de hierin beschreven methode voorgesteld als de optimale methode om de longen snel op te blazen en te fixeren voor histologische evaluatie van downstreamtumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Alabama in Birmingham.
1. Experimenteel protocol
- Offer de muis op met een goedgekeurde IACUC-methode. Hier gebruikten we cervicale dislocatie van een muis verdoofd met 5% isofluraan. Gebruik een geschikte muis voor het onderzoek; hier gebruiken we een 8 weken oude FVB-muis
- Maak met behulp van een chirurgische schaar een horizontale incisie van 3,5-5 mm in het midden van de onderbuik. Steek vervolgens een chirurgische schaar in het kleine gat dat is ontstaan door incisie en snijd verticaal de middelste middellijn omhoog tot net onder de nek van de muis.
- Trek de huid met de vingers naar achteren en inspecteer de oksellymfeklieren.
- Maak met een chirurgische schaar een laterale incisie van 3,5 mm om de buikholte te openen en snijd vervolgens in de voorste richting tot aan de onderkant van de thorax. Inspecteer de organen in de buikholte: lever, milt, nieren, enz.
- Met de platte van de chirurgische schaar, of met behulp van een tang, beweeg de lever om het middenrif bloot te leggen. Inspecteer het middenrif op tumorgroei of uitzaaiingen. Knip vervolgens voorzichtig het diafragma aan de rechterkant van de operator, zodat het kan uitzetten. Snijd het middenrif voorzichtig van rechts naar links om de borstholte en longen bloot te leggen. Pas op dat je de longen niet doorsnijdt.
- Snijd door het laterale uiterste van de linker ribbenkast (rechts van de bediener) om de linkerkwab van de longen te inspecteren.
- Beweeg voorzichtig de rechterlobben van de long uit de weg en snijd het laterale uiterste van de rechter ribbenkast open en verwijder de ribbenkast.
OPMERKING: Verwijdering van de ribbenkast is optioneel, hoewel verwijdering een duidelijker zicht op latere longinflatie mogelijk maakt.- Als vers of bevroren longweefsel nodig is, gebruik dan hemostase-tang om de bronchus van de linkerkwab te klemmen en de linkerlong te reseceren met een chirurgische schaar voorafgaand aan de perfusie.
- Gebruik de tang om het weefsel dat de luchtpijp bedekt op te tillen en snijd eventueel overtollig weefsel weg. Snijd vervolgens voorzichtig het dunne weefsel langs de luchtpijp om de luchtwegen bloot te leggen.
- Snijd door de nierslagader met een chirurgische schaar.
- Om de longen te doordrenken, gebruikt u een spuit van 3 ml met een naald van 22 G om 1x PBS met 10 U/ml heparine in de rechterventrikel van het hart te injecteren. Doordrenkt de longen langzaam met ongeveer 300 μL/s met PBS/heparine. De longen zullen vaak wit worden. In deze stap wordt over het algemeen 2,5 ml PBS gebruikt.
- Gebruik voor longinflatie een spuit van 3 ml met een naald van 22 G, deze keer parallel aan de luchtpijp. Steek de naald in de luchtpijp en injecteer 10% formaline met een stroomsnelheid van niet meer dan ~200 μL/s totdat de longen volledig zijn opgeblazen. Zodra de longen zijn opgeblazen, zal formaline uit de luchtpijp terugstromen. Houd de naald nog een paar seconden op zijn plaats en trek hem vervolgens terug.
- (Optioneel) Gebruik hechtdraad om de luchtpijp af te binden voordat u de naald en longinflatie terugtrekt. Gebruik hiervoor 4 inch hechtdraad die het punt van de draad vasthoudt met een klein paar tangen. Plaats de draad aan de dorsale kant van de luchtpijp en trek door om een lus rond de naald te maken. Maak vervolgens een overhandse knoop rond de naald. Trek de knoop strak, verwijder de naald uit de luchtpijp, sluit de knoop.
- Gebruik een tang om het hart op te tillen, steek een chirurgische schaar direct achter de longen en snijd bindweefsel terwijl u het hart optilt om de longen te reseceren.
- Snijd het hart om het uit de longen te verwijderen.
- Plaats de longen een cassette gelabeld met de muis-ID of studie-ID. Plaats de cassette in 10% gebufferde formaline en fix gedurende 24-48 uur. Longen kunnen indien gewenst meer dan een jaar fixatief worden achtergelaten.
- Breng de cassette met de longen over op 70% ethanol en ga verder met de verwerking voor histologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het bovenstaande protocol zorgt voor snelle perfusie, inflatie en fixatie van muizenlongen. De onderstaande cijfers geven het belang van elke stap weer. Figuur 1 toont H&E-bevlekte longen die zijn doordrenkt met PBS en longen waarin de perfusiestap is overgeslagen of de longen niet correct zijn doordrenkt. Zoals aangetoond, creëert overtollig bloed in de slecht doordrenkte longen minder dan ideale histologie en kan het een uitdaging zijn om de longarchitectuur volledig te observeren. Figuur 2 toont zowel het belang van inflatie als de gevaren van overinflatie aan. Het is moeilijker om gebieden van hyperplasie in niet-opgeblazen longen te identificeren als gevolg van de compressie en de nabijheid van de longblaasjes; in de overgepompte longen zijn echter veel van de alveolaire wanden gebroken en dit kan worden verward met emfyseem als het niet voorzichtig is. Figuur 3 toont tumor histologie in longen die zijn doordrenkt en opgeblazen met behulp van de hierin beschreven techniek.
Figuur 1: Representatieve H&E-kleuring van doordrenkte en niet-geperfuseerde longen. (A) Longen doordrenkt met PBS. (B) Longen niet doordrenkt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Representatieve H&E-kleuring van opgeblazen, niet-opgeblazen en overgepompte longen. (A) De longen werden opgeblazen en gefixeerd met 10% formaline totdat de longen volledig uitzetten. (B) Longen werden niet opgeblazen door de luchtpijp en in plaats daarvan direct in 10% formaline geplaatst. (C) De longen werden opgeblazen en gefixeerd met 10% formaline, maar 10% formaline werd voortdurend in de longen geduwd na volledige expansie, wat resulteerde in overinflatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Representatieve H&E-kleuring van doordrenkte en opgeblazen muizenlongen. (A) Longtumoren werden geïnduceerd met behulp van het chemische kankerverwekkende urethaan. (B) Spontane longmetastasen van een menselijke xenografted cellijn Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierboven beschreven procedure voor de perfusie, inflatie en fixatie van muizenlongen is ideaal voor een snelle en efficiënte voorbereiding van muislongen voor longtumor histologie en pathologie-analyse. De procedure vereist geen speciale apparatuur en kan in minder dan 6 minuten per muis worden uitgevoerd. De procedure vereist geen vast volume voor inflatie of constante vloeistofdruk. Omdat deze procedure niet gestandaardiseerd is, wordt het niet aanbevolen voor diegenen die stereologische of morfometrische analyses van de long willen uitvoeren. Procedures waarin een dergelijke normalisatie vereist is , zijn beter beschreven1,7.
De meest kritieke stappen van dit protocol zijn perfusie en inflatie. Het is belangrijk om door de rechterventrikel van het hart te dringen, terwijl als perfusie via de linkerventrikel wordt gedaan, de longen niet zullen doordringen. Het is gemakkelijk te zien of perfusie correct wordt gedaan, omdat de longen wit worden. Instillatie van fixatief door de luchtpijp maakt inflatie van de longen mogelijk, wat een gemakkelijkere downstream histologische analyse van de longarchitectuur mogelijk maakt. Het is belangrijk om de toediening van fixatief te stoppen zodra de longen volledig zijn uitgebreid, omdat overinflatie alveolaire wandbreuk en het verschijnen van emfyseem kan veroorzaken. Zodra de longen zijn opgeblazen, zal wat formaline uit de luchtpijp terugvloeien. Dit is normaal en heeft geen invloed op downstream histologische analyse; als dit echter een probleem is, kan de luchtpijp worden afgebonden voordat de longen worden geëxtrisch.
Hoewel dit protocol 10% gebufferd formaline gebruikt om de longen te fixeren, wat de meest aanbevolen fixatieve5,6is , zijn er meldingen van artefacten die door dit fixatieve worden geïntroduceerd, namelijk krimp van het longweefsel1,8. Als dit een punt van zorg is, volgt u de richtlijnen van de American Thoracic Society en de European Respiratory Society voor de beoordeling van de longstructuur1. Een ander potentieel fixatief dat niet vaak wordt aanbevolen, maar dat nuttig kan blijken , is de oplossing van Bouin , die een beter contrast kan bieden voor de evaluatie van longoppervlakknobbeltjes9,10. Samengevat biedt het hierin beschreven protocol een robuuste en eenvoudige methode voor de fixatie van muislongen voor tumor histologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd, werd ondersteund door het National Center for Advancing Translational Sciences onder toekenningsnummer UL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung en Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography. Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).
- Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. Lung fixation for the preservation of air spaces. Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).
- Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions. Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species. American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).
- Edmonds, M. D., et al. MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).
- Zhao, K., et al. Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways. PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).
