Summary
Le but de cette méthode est de présenter une méthode simple et efficace pour la perfusion, l’inflation, et la fixation des poumons de souris pour l’examen de la pathologie de tumeur de poumon et l’évaluation des métastases au poumon.
Abstract
La capacité d’évaluer l’histologie pulmonaire est essentielle pour les domaines de la recherche sur le cancer du poumon et de la métastase du cancer. Il est tout aussi important d’effectuer des autopsies rapidement et efficacement à partir d’études sans sacrifier la qualité des tissus obtenus. Le but de ce protocole est de présenter une méthode pour imprèfler, gonfler et fixer rapidement les poumons de souris pour l’analyse histologique en aval. Cette méthode ne normalise pas l’inflation pulmonaire; ainsi, il ne nécessite pas de procédures spéciales ou d’équipement et instille simplement fixatif directement par la trachée suite à la perfusion à travers le cœur. Ceci permet l’estimation suffisante de la taille de tumeur, de l’histologie, et de la notation. Cela permet également la collecte de tissus congelés avant la fixation des tissus pulmonaires. Cette méthode est limitée en ce qu’elle ne permet pas une quantification morphométrique ultérieure du poumon; cependant, il est plus que suffisant pour l’analyse de tumeur de poumon des modèles génétiquement modifiés de souris (GEMMs), des modèles syngeneic, aussi bien que des études de tumeur de xénogreffe et de métastase.
Introduction
Il existe une variété de modèles murin d’oncogenèse pulmonaire et de métastase du cancer au poumon, allant des GEMM complexes aux modèles induits par les carcinogènes en passant par les modèles syngénétiques et xénogreffes, où les cellules cancéreuses sont injectées par intracardiaque, intrathoracique, veine de queue ou d’autres méthodes pour établir des tumeurs dans le poumon. Tous ces modèles partagent le besoin commun d’évaluation histologique de l’histologie et de la pathologie pulmonaires. Ainsi, il est nécessaire d’avoir une méthode robuste mais rapide pour effectuer des autopsies de souris tout en perfusant les poumons pour éliminer l’excès de sang, et en gonflant et en fixant les poumons pour visualiser clairement l’architecture pulmonaire. La vitesse est un élément essentiel de cette procédure car il peut être nécessaire de recueillir les poumons de dizaines de souris à un seul moment. Cette procédure peut être effectuée en moins de 6 minutes par souris.
Tandis que cette procédure est plus que suffisante pour évaluer l’histologie de tumeur, elle n’est pas recommandée pour ceux qui souhaitent exécuter la stéréologie ou les mesures morphométriques des poumons. De telles mesures exigent que l’inflation pulmonaire soit normalisée, tout comme le calcul de la surface absolue du poumon, du volume absolu et de la taille et du nombre alvéolés1. Cette méthode n’est pas non plus optimale pour certaines approches d’imagerie. Par exemple, l’imagerie des poumons par μCT pour l’analyse morphométrique ex vivo exige que les poumons restent remplis d’air2. Lorsque la préservation des espaces et des dimensions de l’air est la principale préoccupation, il est recommandé de fixer les poumons par des techniques de déshydratation par perfusion3,4. L’une des plus grandes préoccupations de ce modèle est le potentiel de rupture des parois alvéollaires, ce qui a pour effet de réduire son utilisation dans les études sur l’emphysème; cependant, la procédure recommandée pour la fixation des poumons pour l’étude de l’emphysème est encore assez semblable, car il est recommandé de fixer les poumons soit par instillation intratracheal de 10% de formaline (semblable au protocole décrit ici) sous pression fluide constante ou par fixation in situ5.
L’avantage de la procédure décrite ici est qu’elle ne nécessite pas de pression constante du fluide, au lieu de gonfler les poumons jusqu’à ce qu’ils aient complètement augmenté, diminuant ainsi le temps nécessaire pour la procédure. La procédure décrite ici ressemble beaucoup aux méthodes recommandées par un armamentarium de la Society of Toxicologic Pathology, où un sous-comité a été formé pour recommander les meilleures méthodes de fixation pulmonaire pour les études toxicologiques. La majorité des scientifiques de ce sous-comité ont recommandé de fixer les poumons par instillation intratrachéale avec une seringue, bien qu’il y ait eu des recommandations variables sur le moment où le poumon a été laissé dans le fixatif6. Ainsi, tandis qu’une série de méthodes d’inflation et de fixation de poumon existent, la méthode décrite ci-après est proposée pour être la méthode optimale pour gonfler et fixer rapidement les poumons pour l’évaluation histologique en aval de tumeur.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de l’Alabama à Birmingham.
1. Protocole expérimental
- Sacrifiez la souris à l’aide d’une méthode IACUC approuvée. Ici, nous avons utilisé la dislocation cervicale d’une souris anesthésiée avec 5% d’isoflurane. Utilisez une souris appropriée pour l’étude; ici, nous utilisons une souris FVB de 8 semaines
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faire une incision horizontale de 3,5 à 5 mm au milieu du bas-ventre. Ensuite, insérez des ciseaux chirurgicaux dans le petit trou créé à partir de l’incision et coupez verticalement la ligne médiane centrale juste en dessous du cou de la souris.
- Tirez la peau en arrière avec les doigts et inspectez les ganglions lymphatiques axillaires.
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faire une incision latérale de 3,5 mm pour ouvrir la cavité abdominale, puis couper dans la direction antérieure jusqu’au fond du thorax. Inspecter les organes de la cavité abdominale : foie, rate, reins, etc.
- Avec l’appartement des ciseaux chirurgicaux, ou en utilisant des forceps, déplacer le foie pour exposer le diaphragme. Inspecter le diaphragme pour la croissance tumorale ou les métastases. Puis, pincez doucement le diaphragme sur le côté droit de l’opérateur, lui permettant de se développer. Couper délicatement le diaphragme de droite à gauche pour exposer la cavité thoracique et les poumons. Veillez à ne pas couper les poumons.
- Couper à travers l’extrémité latérale de la cage thoracique gauche (à droite de l’opérateur) pour inspecter le lobe gauche des poumons.
- Déplacez doucement les lobes droit du poumon hors de la route et coupez l’extrême latéral de la cage thoracique droite et retirez la cage thoracique.
REMARQUE : L’enlèvement de la cage thoracique est facultatif, bien que l’ablation permette une vue plus claire de l’inflation pulmonaire ultérieure.- Si un tissu pulmonaire frais ou congelé est nécessaire, utilisez des forceps d’hémostat pour serrer la bronche du lobe gauche et réséquer le poumon gauche à l’aide de ciseaux chirurgicaux avant la perfusion.
- En utilisant les forceps pour soulever le tissu couvrant la trachée, couper tout excès de tissu. Ensuite, coupez doucement le tissu mince qui tapisse la trachée pour exposer les voies respiratoires.
- Couper à travers l’artère rénale avec des ciseaux chirurgicaux.
- Pour parcourir les poumons, utilisez une seringue de 3 mL avec une aiguille de 22 G pour injecter 1x PBS avec 10 U/mL d’héparine dans le ventricule droit du cœur. Parcourez lentement les poumons à environ 300 μL/s avec PBS/héparine. Les poumons deviennent souvent blancs. 2,5 mL de PBS sont généralement utilisés dans cette étape.
- Pour l’inflation pulmonaire, utilisez une seringue de 3 mL avec une aiguille de 22 G, cette fois maintenue parallèlement à la trachée. Insérez l’aiguille dans la trachée et injectez 10% de formaline avec un débit ne supérieur pas à ~200 μL/s jusqu’à ce que les poumons aient complètement gonflé. Une fois que les poumons sont gonflés, la formaline va revenir hors de la trachée. Maintenez l’aiguille en place pendant quelques secondes de plus, puis retirez-la.
- (Facultatif) Avant de retirer l’inflation des aiguilles et des poumons, utiliser du fil de suture pour attacher la trachée. Pour ce faire, utilisez 4 pouces de fil de suture tenant le point du fil avec une petite paire de forceps. Placez le fil sur le côté dorsal de la trachée et tirez à travers pour faire une boucle autour de l’aiguille. Ensuite, faites un noeud overhand autour de l’aiguille. Tirez le noeud serré, retirez l’aiguille de la trachée, fermez le noeud.
- Utilisez des forceps pour soulever le cœur, insérer des ciseaux chirurgicaux directement derrière les poumons, et couper le tissu conjonctif tout en soulevant le cœur pour réséquer les poumons.
- Couper le cœur pour l’enlever des poumons.
- Placez les poumons une cassette étiquetée avec l’iD de la souris ou l’iD d’étude. Placez la cassette dans 10% de formaline tamponnée et fixez-la pendant 24-48 h. Les poumons peuvent être laissés en fixatif pendant plus d’un an si désiré.
- Transférer la cassette contenant les poumons à 70 % d’éthanol et procéder au traitement de l’histologie.
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Representative Results
Le protocole ci-dessus permet une perfusion rapide, l’inflation et la fixation des poumons de souris. Les chiffres ci-dessous représentent l’importance de chaque étape. La figure 1 représente les poumons tachés de H&E qui ont été perfusés avec pbs et poumons dans lesquels l’étape de perfusion a été sautée ou les poumons n’ont pas perfusé correctement. Comme indiqué, l’excès de sang dans les poumons mal perfusés crée moins d’histologie idéale et peut rendre difficile l’observation complète de l’architecture pulmonaire. La figure 2 démontre à la fois l’importance de l’inflation ainsi que les dangers de la suré inflation. Il est plus difficile d’identifier les zones d’hyperplasie dans les poumons non gonflés en raison de la compression et de la proximité des alvéoles; cependant, dans les poumons surgonflés, beaucoup des murs alvéolés ont été cassés et ceci pourrait être confondu avec l’emphysème sinon prudent. La figure 3 représente l’histologie tumorale dans les poumons qui ont été perfusés et gonflés à l’aide de la technique décrite ci-après.
Figure 1 : Coloration représentative H&E des poumons perfusés et non perfusés. (A) Poumons perfusés de PBS. (B) Poumons non perfusés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Coloration représentative H&E des poumons gonflés, non gonflés et surgonflés. (A) Les poumons ont été gonflés et fixés avec 10% de formaline jusqu’à ce que les poumons complètement élargi. (B) Les poumons n’ont pas été gonflés par la trachée et au lieu directement placés dans 10% de formaline. (C) Les poumons ont été gonflés et fixés avec 10% de formaline, mais 10% de formaline a été continuellement poussé dans les poumons après l’expansion complète résultant en une surinflation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Coloration représentative H&E des poumons de souris perfusés et gonflés. ( A )Destumeurs pulmonaires ont été induites utilisant l’uréthane cancérigène chimique. (B) Métastases pulmonaires spontanées à partir d’une lignée cellulaire xénogreffe humaine S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La procédure décrite ci-dessus pour la perfusion, l’inflation, et la fixation des poumons de souris est idéale pour la préparation rapide et efficace des poumons de souris pour l’histologie de tumeur pulmonaire et l’analyse de pathologie. La procédure ne nécessite aucun équipement spécial et peut être effectuée en moins de 6 minutes par souris. La procédure ne nécessite pas de volume fixe pour l’inflation ni de pression fluide constante. Puisque cette procédure n’est pas normalisée, elle n’est pas recommandée pour ceux qui souhaitent effectuer des analyses stéréologiques ou morphométriques du poumon. Les procédures où une telle normalisation est requise ont été mieuxdécrites 1,7.
Les étapes les plus critiques de ce protocole sont la perfusion et l’inflation. Il est important de parcourir le ventricule droit du cœur, alors que si la perfusion se fait par le ventricule gauche, les poumons ne périront pas. Il est facile de dire si la perfusion est faite correctement que les poumons vont devenir blancs. L’instillation du fixatif par la trachée permet l’inflation des poumons, ce qui permet une analyse histologique plus facile en aval de l’architecture pulmonaire. Il est important d’arrêter l’administration de fixatif dès que les poumons se sont complètement élargis, car la surinflation peut causer la rupture de mur alvéolaire et l’aspect de l’emphysème. Une fois que les poumons sont gonflés, une certaine formaline va revenir hors de la trachée. Ceci est normal et n’a pas d’impact sur l’analyse histologique en aval; toutefois, s’il s’agit d’une préoccupation, la trachée peut être attachée avant d’exciser les poumons.
Alors que ce protocole utilise 10% de formaline tamponnée pour fixer les poumons, qui est le fixatif le plus couramment recommandé5,6, il ya des rapports d’artefacts introduits par ce fixatif, à savoir le rétrécissement du tissupulmonaire 1,8. S’il s’agit d’une préoccupation, suivez les directives de l’American Thoracic Society et de l’European Respiratory Society pour l’évaluation de la structurepulmonaire 1. Un autre fixatif potentiel pas couramment recommandé, mais qui peut s’avérer utile est la solution de Bouin, qui peut fournir un meilleur contraste pour l’évaluation des nodules de surfacepulmonaire 9,10. En résumé, le protocole décrit ci-après fournit une méthode robuste et simple pour la fixation des poumons de souris pour l’histologie de tumeur.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les recherches rapportées dans cette publication ont été soutenues par le National Center for Advancing Translational Sciences sous le numéro ul1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography. Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).
- Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. Lung fixation for the preservation of air spaces. Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).
- Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions. Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species. American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).
- Edmonds, M. D., et al. MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).
- Zhao, K., et al. Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways. PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).
