Summary
Formålet med denne metoden er å presentere en enkel og effektiv metode for perfusjon, inflasjon og fiksering av muse lunger for undersøkelse av lungesvulstpatologi og evaluering av metastaser til lungen.
Abstract
Evnen til å evaluere lunge histologi er avgjørende for feltene lungekreftforskning og kreftmetastase. Det er like viktig å utføre nekropsier raskt og effektivt fra studier uten å ofre kvaliteten på vevet som er anskaffet. Målet med denne protokollen er å presentere en metode for raskt å parfyme, blåse opp og fikse muse lunger for nedstrøms histologisk analyse. Denne metoden standardiserer ikke lungeinflasjon; Dermed krever det ingen spesielle prosedyrer eller utstyr og innpoder i stedet bare fiksering direkte gjennom luftrøret etter perfusjon gjennom hjertet. Dette gir tilstrekkelig estimering av tumorstørrelse, histologi og scoring. Dette gjør det også mulig å samle frossent vev før lungevevsfiksering. Denne metoden er begrenset ved at den ikke tillater senere morfometrisk kvantifisering av lungen; Det er imidlertid mer enn tilstrekkelig for lungesvulstanalyse fra genmodifiserte musemodeller (GEMMs), syngeneiske modeller, samt xenograft tumor- og metastaseringsstudier.
Introduction
En rekke musemodeller av lunge onkogenese og kreftmetastase til lungen eksisterer alt fra komplekse GEMMs til kreftfremkallende modeller til syngeneiske og xenografte modeller, hvor kreftceller injiseres via intrakarakum, intrathoracic, halevenen eller andre metoder for å etablere svulster i lungen. Alle disse modellene deler det felles behovet for histologisk evaluering av lunge histologi og patologi. Dermed er det nødvendig å ha en robust, men rask metode for å utføre nekropsier av mus mens du parfymerer lungene for å fjerne overflødig blod, og oppblåse og fikse lungene for å tydelig visualisere lungearkitektur. Hastighet er en kritisk komponent i denne prosedyren, da det kan være nødvendig å samle lungene fra dusinvis av mus på et enkelt tidspunkt. Denne prosedyren kan utføres på mindre enn 6 minutter per mus.
Selv om denne prosedyren er mer enn tilstrekkelig for evaluering av tumor histologi, anbefales det ikke for de som ønsker å utføre stereologi eller morfometriske målinger av lungene. Slike målinger krever at lungeinflasjonen standardiseres, det samme gjør beregningen av absolutt overflateareal i lungen, absolutt volum og alveolarstørrelse og nummer1. Denne metoden er heller ikke optimal for enkelte avbildningsmetoder. For eksempel krever avbildning av lungene via μCT for ex vivo morfometrisk analyse at lungene forblir fylt med luft2. Når bevaring av luftrom og dimensjoner er den primære bekymringen, anbefales det å fikse lungene ved perfusjonsdehydreringsteknikker3,4. En av de største bekymringene for denne modellen er potensialet for rupturing av alveolarveggene, noe som reduserer bruken i studier av emfysem; Den anbefalte prosedyren for fiksering av lunger for studiet av emfysem er imidlertid fortsatt ganske lik, da det anbefales å fikse lungene enten ved intratrakeal instillasjon av 10% formalin (ligner protokollen beskrevet her) under konstant væsketrykk eller ved in situ fiksering5.
Fordelen med den beskrevne prosedyren her er at den ikke krever konstant væsketrykk, i stedet oppblåser lungene til de er fullstendig utvidet, og dermed reduserer tiden som trengs for prosedyren. Prosedyren her beskrevet ligner på metodene anbefalt av et armamentarium av Society of Toxicologic Pathology, hvor en underkomité ble dannet for å anbefale de beste metodene for lungefiksering for toksikologistudier. Flertallet av forskerne i denne underkomiteen anbefalte å fikse lungene ved intratrakeal instillasjon med en sprøyte, selv om det var varierende anbefalinger om tidspunktet lungen ble igjen i fixative6. Således, mens en rekke metoder for lungeinflasjon og fiksering eksisterer, foreslås metoden beskrevet heri å være den optimale metoden for raskt å blåse opp og fikse lungene for nedstrøms tumor histologisk evaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Alabama i Birmingham.
1. Eksperimentell protokoll
- Ofre musen ved hjelp av en godkjent IACUC-metode. Her brukte vi cervical dislokasjon av en mus bedøvet med 5% isofluran. Bruk en passende mus for studien; her bruker vi en 8 uker gammel FVB-mus
- Bruk kirurgisk saks, lag et 3,5-5 mm horisontalt snitt midt i underlivet. Deretter setter du inn kirurgisk saks i det lille hullet som er opprettet fra snitt og kutter vertikalt opp midtlinjen til like under musens hals.
- Trekk huden tilbake med fingrene og inspiser de aksillære lymfeknuter.
- Bruk kirurgisk saks, lag et 3,5 mm lateralt snitt for å åpne bukhulen, og kutt deretter i fremre retning opp til bunnen av thoraxen. Inspiser organene i bukhulen: lever, milt, nyrer, etc.
- Med leiligheten til den kirurgiske saksen, eller bruk tang, flytt leveren for å eksponere membranen. Inspiser membranen for tumorvekst eller metastaser. Klipp deretter membranen forsiktig på operatørens høyre side, slik at den kan utvide seg. Klipp forsiktig membranen fra høyre til venstre for å eksponere thoraxhulen og lungene. Vær forsiktig så du ikke kutter lungene.
- Skjær opp gjennom den laterale ytterligheten av venstre ribbebur (på operatørens høyre side) for å inspisere venstre lobe av lungene.
- Beveg forsiktig de høyre lobes av lungen ut av veien og kutt opp sidekanten av høyre ribbebur og fjern ribbeburet.
MERK: Fjerning av ribbeinburet er valgfritt, men fjerning gir klarere syn på senere lungeinflasjon.- Hvis friskt eller frossent lungevev er nødvendig, bruk hemostat tang for å klemme bronchus av venstre lobe og resect venstre lunge ved hjelp av kirurgisk saks før perfusjon.
- Bruk tangene til å løfte vevet som dekker luftrøret, kutt bort overflødig vev. Klipp deretter forsiktig det tynne vevet som fôrer luftrøret for å eksponere luftveiene.
- Skjær gjennom nyrearterien med kirurgisk saks.
- For å parfyme lungene, bruk en 3 ml sprøyte med en 22 G nål for å injisere 1x PBS med 10 U/ml heparin i høyre ventrikel i hjertet. Gjennomfør lungene langsomt ved ca. 300 μL/s med PBS/heparin. Lungene blir ofte hvite. 2,5 ml PBS brukes vanligvis i dette trinnet.
- For lungeinflasjon, bruk en 3 ml sprøyte med en 22 G nål, denne gangen holdt parallelt med luftrøret. Sett nålen inn i luftrøret og injiser 10% formalin med strømningshastighet ikke større enn ~ 200 μL / s til lungene er fullstendig oppblåst. Når lungene er oppblåst, vil formalin komme tilbake ut av luftrøret. Hold nålen på plass i noen sekunder til, og trekk den deretter tilbake.
- (Valgfritt) Før du trekker tilbake nål- og lungeinflasjonen, bruk suturtråden til å binde av luftrøret. For å oppnå dette, bruk 4 tommer suturtråd som holder trådpunktet med et lite par tang. Plasser tråden på dorsalsiden av luftrøret og trekk gjennom for å lage en løkke rundt nålen. Deretter lage en overhånd knute rundt nålen. Trekk knuten stramt, fjern nålen fra luftrøret, lukk knuten.
- Bruk tang til å løfte hjertet, sette inn kirurgisk saks rett bak lungene, og kutte bindevev mens du løfter hjertet for å resect lunger.
- Klipp hjertet for å fjerne det fra lungene.
- Plasser lungene en kassett merket med muse-ID eller studie-ID. Plasser kassetten i 10% bufret formalin og fest i 24-48 timer. Lunger kan stå i fixative i over et år om ønskelig.
- Overfør kassetten som inneholder lungene til 70% etanol og fortsett til behandling for histologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovennevnte protokoll gir rask perfusjon, inflasjon og fiksering av muse lunger. Tallene nedenfor representerer viktigheten av hvert trinn. Figur 1 viser H&E-fargede lunger som har blitt parfymert med PBS og lunger der perfusjonstrinnet er hoppet over eller lungene ikke har parfymert seg riktig. Som vist skaper overflødig blod i de dårlig perfused lungene mindre enn ideell histologi og kan gjøre det utfordrende å observere lungearkitekturen fullt ut. Figur 2 viser både betydningen av inflasjonen og farene ved overinflasjon. Det er vanskeligere å identifisere områder av hyperplasi i uoppblåste lunger på grunn av kompresjon og nærhet til alveolene; Men i de overinflaterte lungene har mange av alveolarveggene blitt ødelagt, og dette kan forveksles med emfysem hvis ikke forsiktig. Figur 3 viser tumor histologi i lunger som har blitt perfundert og oppblåst ved hjelp av teknikken som er beskrevet her.
Figur 1: Representativ H&E-farging av perfunderte og ikke-perfunderte lunger. (A)Lunger perfundert med PBS. (B) Lungene er ikke perfundert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativ H&E-farging av oppblåste, uoppblåste og overinflaterte lunger. (A) Lungene ble oppblåst og festet med 10% formalin til lungene ble fullstendig utvidet. (B) Lungene ble ikke oppblåst gjennom luftrøret og i stedet direkte plassert i 10% formalin. (C) Lungene ble oppblåst og festet med 10% formalin, men 10% formalin ble kontinuerlig presset inn i lungene forbi full ekspansjon, noe som resulterte i overinflasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativ H&E-farging av perfunderte og oppblåste muse lunger. (A) Lungetumorer ble indusert ved hjelp av kjemisk kreftfremkallende uretan. (B) Spontane lungemetastaser fra en menneskelig xenografted cellelinje Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prosedyren beskrevet ovenfor for perfusjon, inflasjon og fiksering av muse lunger er ideell for rask og effektiv forberedelse av muse lunger for lungesvulst histologi og patologi analyse. Prosedyren krever ikke noe spesialutstyr og kan utføres på mindre enn 6 minutter per mus. Prosedyren krever ikke et fast volum for inflasjon eller konstant væsketrykk. Fordi denne prosedyren ikke er standardisert, anbefales det ikke for de som ønsker å utføre stereologiske eller morfometriske analyser av lungen. Prosedyrer der slik standardisering er nødvendig, er bedre beskrevet1,7.
De mest kritiske trinnene i denne protokollen er perfusjon og inflasjon. Det er viktig å parfyme gjennom hjertets høyre ventrikel, mens hvis perfusjon gjøres gjennom venstre ventrikel, vil lungene ikke parfyme. Det er lett å si om perfusjon gjøres riktig, da lungene blir hvite. Instillasjon av fixative gjennom luftrøret tillater inflasjon av lungene, noe som gir lettere nedstrøms histologisk analyse av lungearkitektur. Det er viktig å stoppe administrering av fikseringsmiddel så snart lungene er fullstendig utvidet, da overinflasjon kan forårsake alveolar veggbrudd og utseendet av emfysem. Når lungene er oppblåst, vil noen formalin komme tilbake ut av luftrøret. Dette er normalt og påvirker ikke nedstrøms histologisk analyse; Men hvis dette er en bekymring, kan luftrøret bindes av før utskilling av lungene.
Mens denne protokollen bruker 10% bufret formalin for å fikse lungene, som er den mest anbefalte fixative5,6, er det rapporter om artefakter introdusert av denne fixative, nemlig krymping av lungevevet1,8. Hvis dette er en bekymring, følg retningslinjene fra American Thoracic Society og European Respiratory Society for vurdering av lungestruktur1. Et annet potensielt fikseringsmiddel som ikke ofte anbefales, men som kan være nyttig er Bouins løsning, som kan gi bedre kontrast for evaluering av lungeoverflateknutene9,10. Oppsummert gir den heri beskrevne protokollen en robust og enkel metode for fiksering av muse lunger for tumor histologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Center for Advancing Translational Sciences under prisnummer UL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography. Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).
- Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. Lung fixation for the preservation of air spaces. Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).
- Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions. Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species. American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).
- Edmonds, M. D., et al. MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).
- Zhao, K., et al. Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways. PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).
