Summary
O objetivo deste método é apresentar um método simples e eficiente para a perfusão, inflação e fixação de pulmões de camundongos para o exame da patologia do tumor pulmonar e avaliação de metástases no pulmão.
Abstract
A capacidade de avaliar a histologia pulmonar é fundamental para os campos da pesquisa sobre câncer de pulmão e metástase do câncer. É igualmente importante realizar necropsias de forma rápida e eficiente a partir de estudos sem sacrificar a qualidade dos tecidos adquiridos. O objetivo deste protocolo é apresentar um método para perfusear rapidamente, inflar e fixar pulmões de camundongos para análise histológica a jusante. Este método não padroniza a inflação pulmonar; assim, não requer procedimentos ou equipamentos especiais e, em vez disso, simplesmente instila fixação diretamente através da traqueia após a perfusão através do coração. Isso permite uma estimativa suficiente do tamanho do tumor, histologia e pontuação. Isso também permite a coleta de tecido congelado antes da fixação do tecido pulmonar. Este método é limitado na forma de não permitir quantificação morfométrica posterior do pulmão; no entanto, é mais do que suficiente para a análise de tumores pulmonares de modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs), modelos singênicos, bem como estudos de tumor xenoenxerto e metástase.
Introduction
Uma variedade de modelos de camundongos de oncogênese pulmonar e metástase de câncer para o pulmão existem que vão desde GEMMs complexos até modelos induzidos por cancerígenos até modelos sinéticos e xenoenxertos, onde as células cancerígenas são injetadas via intracardiac, intrathoracic, a veia da cauda ou outros métodos para estabelecer tumores dentro do pulmão. Todos esses modelos compartilham a necessidade comum de avaliação histológica da histologia pulmonar e da patologia. Assim, é necessário ter um método robusto, porém rápido, para realizar necropsias de camundongos enquanto perfumia os pulmões para remover o excesso de sangue, e inflar e fixar os pulmões para visualizar claramente a arquitetura pulmonar. A velocidade é um componente crítico deste procedimento, pois pode ser necessário coletar os pulmões de dezenas de ratos em um único ponto de tempo. Este procedimento pode ser realizado em menos de 6 minutos por mouse.
Embora este procedimento seja mais do que suficiente para avaliar a histologia tumoral, não é recomendado para aqueles que desejam realizar medições estereométricas ou morfômicas dos pulmões. Tais medidas exigem que a inflação pulmonar seja padronizada, assim como o cálculo da área de superfície absoluta do pulmão, volume absoluto e tamanho alveolar e número1. Este método também não é ideal para algumas abordagens de imagem. Por exemplo, a imagem dos pulmões via μCT para análise morfométrica ex vivo requer que os pulmões permaneçam preenchidos com ar2. Quando a preservação dos espaços e dimensões do ar são a principal preocupação, recomenda-se fixar os pulmões por técnicas de desidratação por perfusão3,4. Uma das maiores preocupações desse modelo é o potencial de ruptura das paredes alveolares, diminuindo seu uso em estudos de enfisema; no entanto, o procedimento recomendado para fixação de pulmões para o estudo do enfisema ainda é bastante semelhante, pois recomenda-se fixar os pulmões por instilação intratraqueal de 10% de formalina (semelhante ao protocolo descrito aqui) sob pressão constante do fluido ou por fixação in situ5.
A vantagem do procedimento descrito aqui é que ele não requer pressão constante do fluido, em vez de inflar os pulmões até que eles tenham se expandido totalmente, diminuindo assim o tempo necessário para o procedimento. O procedimento aqui descrito se assemelha muito aos métodos recomendados por um armamento da Sociedade de Patologia Toxicológica, onde um subcomitê foi formado para recomendar os melhores métodos de fixação pulmonar para estudos toxicológicos. A maioria dos cientistas deste subcomitê recomendou a fixação dos pulmões por instilação intratraqueal com uma seringa, embora houvesse recomendações variadas sobre o tempo que o pulmão foi deixado na fixação6. Assim, enquanto existe uma variedade de métodos de inflação e fixação pulmonar, o método descrito aqui é proposto para ser o método ideal para inflar rapidamente e fixar os pulmões para avaliação histológica do tumor a jusante.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Alabama em Birmingham.
1. Protocolo experimental
- Sacrifique o mouse usando um método IACUC aprovado. Aqui, usamos luxação cervical de um camundongo anestesiado com 5% de isoflurane. Use um mouse apropriado para o estudo; aqui, usamos um mouse FVB de 8 semanas de idade
- Utilizando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão horizontal de 3,5-5 mm no meio do abdômen inferior. Em seguida, insira uma tesoura cirúrgica no pequeno orifício criado a partir da incisão e corte verticalmente até a linha média central até um pouco abaixo do pescoço do mouse.
- Puxe a pele para trás com os dedos e inspecione os linfonodos axilares.
- Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão lateral de 3,5 mm para abrir a cavidade abdominal e, em seguida, corte na direção anterior até o fundo do tórax. Inspecione os órgãos na cavidade abdominal: fígado, baço, rins, etc.
- Com o plano da tesoura cirúrgica, ou usando fórceps, mova o fígado para expor o diafragma. Inspecione o diafragma para crescimento do tumor ou metástases. Em seguida, corte suavemente o diafragma no lado direito do operador, permitindo que ele se expanda. Corte suavemente o diafragma da direita para a esquerda para expor a cavidade torácica e os pulmões. Tenha cuidado para não cortar os pulmões.
- Corte através do extremo lateral da caixa torácica esquerda (à direita do operador) para inspecionar o lobo esquerdo dos pulmões.
- Mova suavemente os lóbulos direito do pulmão para fora do caminho e corte o extremo lateral da caixa torácica direita e remova a caixa torácica.
NOTA: A remoção da caixa torácica é opcional, embora a remoção permita uma visão mais clara da inflação pulmonar posterior.- Se for necessário tecido pulmonar fresco ou congelado, use fórceps hemostat para fixar os brônquios do lobo esquerdo e ressecular o pulmão esquerdo usando uma tesoura cirúrgica antes da perfusão.
- Usando os fórceps para levantar o tecido que cobre a traqueia, corte qualquer excesso de tecido. Em seguida, corte suavemente o tecido fino que reveste a traqueia para expor as vias aéreas.
- Corte a artéria renal com uma tesoura cirúrgica.
- Para permear os pulmões, use uma seringa de 3 mL com uma agulha de 22 G para injetar 1x PBS com heparina de 10 U/mL no ventrículo direito do coração. Perfundir lentamente os pulmões a aproximadamente 300 μL/s com PBS/heparina. Os pulmões ficam brancos. 2,5 mL de PBS são geralmente usados nesta etapa.
- Para a inflação pulmonar, use uma seringa de 3 mL com uma agulha de 22 G, desta vez mantida paralela à traqueia. Insira a agulha na traqueia e injete 10% de formalina com taxa de fluxo não superior a ~200 μL/s até que os pulmões tenham inflado completamente. Uma vez que os pulmões são inflados, formalina vai recuar para fora da traqueia. Segure a agulha no lugar por mais alguns segundos e depois retire-se.
- (Opcional) Antes de retirar a agulha e a inflação pulmonar, use linha de sutura para amarrar a traqueia. Para isso, use 4 polegadas de rosca de sutura segurando o ponto da rosca com um pequeno par de fórceps. Coloque a rosca no lado dorsal da traqueia e puxe para fazer um loop em torno da agulha. Em seguida, faça um nó de mão em torno da agulha. Puxe o nó apertado, retire a agulha da traqueia, feche o nó.
- Use fórceps para levantar o coração, inserir tesouras cirúrgicas diretamente atrás dos pulmões e cortar tecido conjuntivo enquanto o lifting do coração para ressecção dos pulmões.
- Corte o coração para removê-lo dos pulmões.
- Coloque os pulmões com um rotulado com o ID do mouse ou estude o ID. Coloque o em formalina 10% tamponada e fixe por 24-48 h. Os pulmões podem ser deixados em fixação por mais de um ano, se desejar.
- Transfira o contendo os pulmões para 70% de etanol e prossiga para o processamento para histologia.
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Representative Results
O protocolo acima permite a perfusão rápida, inflação e fixação de pulmões de camundongos. Os números abaixo representam a importância de cada etapa. A Figura 1 retrata os pulmões manchados de H&E que foram perfundidos com PBS e pulmões nos quais o passo de perfusão foi ignorado ou os pulmões não conseguiram perfumar corretamente. Como mostrado, o excesso de sangue nos pulmões mal perfundidos cria histologia menos do que ideal e pode torná-lo desafiador observar totalmente a arquitetura pulmonar. A Figura 2 demonstra tanto a importância da inflação quanto os perigos da inflação excessiva. É mais difícil identificar áreas de hiperplasia em pulmões não inflados devido à compressão e proximidade dos alvéolos; no entanto, nos pulmões superinflados, muitas das paredes alveolares foram quebradas e isso pode ser confundido com enfisema se não cuidadoso. A Figura 3 retrata a histologia tumoral em pulmões que foram perfundidos e inflados usando a técnica aqui descrita.
Figura 1: Mancha de H&E representativa de pulmões perfumados e não perfundidos. (A) Pulmões perfundidos com PBS. (B) Pulmões não perfundidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mancha de H&E representativa de pulmões inflados, não inflados e superinflados. (A) Os pulmões foram inflados e fixados com 10% de formalina até que os pulmões se expandiam totalmente. (B) Os pulmões não foram inflados através da traqueia e, em vez disso, diretamente colocados em 10% de formalina. (C) Os pulmões foram inflados e fixados com 10% de formalina, mas 10% de formalina foi continuamente empurrada para os pulmões após a expansão total resultando em superinflação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Mancha de H&E representativa de pulmões de camundongos perfumados e inflados. (A) Os tumores pulmonares foram induzidos usando o uretano cancerígeno químico. (B) Metástases pulmonares espontâneas de uma linha celular xenógrafa humana Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O procedimento descrito acima para a perfusão, inflação e fixação de pulmões de camundongos é ideal para uma preparação rápida e eficiente dos pulmões do camundongo para histologia de tumores pulmonares e análise patologia. O procedimento não requer nenhum equipamento especial e pode ser realizado em menos de 6 minutos por mouse. O procedimento não requer um volume fixo para inflação nem pressão constante do fluido. Como este procedimento não é padronizado, não é recomendado para aqueles que desejam realizar análises esterológicas ou morfométricas do pulmão. Os procedimentos em que essa padronização é necessária foram melhor descritos1,7.
Os passos mais críticos deste protocolo são a perfusão e a inflação. É importante perfumar o ventrículo direito do coração, enquanto que se a perfusão for feita através do ventrículo esquerdo, os pulmões não perfumam. É fácil dizer se a perfusão é feita corretamente, pois os pulmões ficarão brancos. A instilação da fixação através da traqueia permite a inflação dos pulmões, o que permite uma análise histológica mais fácil a jusante da arquitetura pulmonar. É importante parar a administração de fixação assim que os pulmões se expandirem totalmente, pois a super inflação pode causar quebra da parede alveolar e o aparecimento de enfisema. Uma vez que os pulmões são inflados, alguma formalina vai recuar para fora da traqueia. Isso é normal e não afeta a análise histológica a jusante; no entanto, se esta é uma preocupação a traqueia pode ser amarrada antes de extirer os pulmões.
Enquanto este protocolo usa formalina 10% tamponada para corrigir os pulmões, que é o fixador mais comumente recomendado5,6, há relatos de artefatos introduzidos por este fixador, ou seja, encolhimento do tecido pulmonar1,8. Se isso for uma preocupação, siga as diretrizes da Sociedade Torácica Americana e da Sociedade Respiratória Europeia para a avaliação da estrutura pulmonar1. Outro potencial fixador não comumente recomendado, mas que pode ser útil é a solução de Bouin, que pode fornecer melhor contraste para a avaliação dos nódulos da superfície pulmonar9,10. Em resumo, o protocolo aqui descrito fornece um método robusto e simples para a fixação de pulmões de camundongos para histologia tumoral.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Centro Nacional de Promoção de Ciências Translacionais sob o prêmio número UL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
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