Summary
ठोस ट्यूमर ऊतकों की मात्रात्मक प्रतिरक्षा प्रोफाइल निर्धारित करने और प्रतिरक्षा-ऑन्कोलॉजी बायोमार्कर खोज के लिए नैदानिक साथियों का लाभ उठाने के लिए आरएनए-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग आणविक और सूचना प्रोटोकॉल के माध्यम से वर्णित है।
Abstract
इम्यूनोथेरपी ऑन्कोलॉजी रोगियों के उपचार में वादा दिखाते हैं, लेकिन ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट की जटिल विषमता उपचार प्रतिक्रिया को चुनौतीपूर्ण बनाती है। ट्यूमर ऊतक में और उसके आसपास मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सापेक्ष आबादी को हल करने की क्षमता को प्रतिक्रिया को समझने के लिए चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक दिखाया गया है, लेकिन प्रवाह साइटोमेट्री और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसी पारंपरिक तकनीकों द्वारा सीमित है ( आईएचसी), आवश्यकता वाले ऊतकों की बड़ी मात्रा, सटीक सेल प्रकार के मार्कर की कमी, और कई तकनीकी और साजो-सामान बाधाओं के कारण। एक परख (जैसे, इम्यूनोप्रिज़्म इम्यून प्रोफाइलिंग परख) नैदानिक संग्रहीत ठोस ट्यूमर ऊतक से निकाले गए आरएनए की दोनों छोटी मात्रा को समायोजित करके इन चुनौतियों पर काबू पा लेती है। परख एक रिएजेंट किट और क्लाउड-आधारित सूचना विज्ञान के माध्यम से एक्सेस किया जाता है जो इलुमिना अनुक्रमण प्लेटफार्मों के लिए एक अंत-से-अंत मात्रात्मक, उच्च-थ्रूपुट इम्यूनो-प्रोफाइलिंग समाधान प्रदान करता है। शोधकर्ताफॉर्मिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक या कुल आरएनए के 20-40 एनजी (नमूना गुणवत्ता के आधार पर) के दो वर्गों के साथ शुरू करते हैं, और प्रोटोकॉल आठ प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों और दस प्रतिरक्षा भागने की मात्रा निर्धारित करने वाली प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल रिपोर्ट उत्पन्न करता है जीन, ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट का एक पूरा दृश्य पर कब्जा। परिणामस्वरूप डेटा का उपयोग करने के लिए कोई अतिरिक्त बायोइन्फॉर्मेटिक विश्लेषण की आवश्यकता नहीं है। उचित नमूना साथियों के साथ, प्रोटोकॉल का उपयोग ब्याज की रोगी आबादी के भीतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण बायोमार्कर की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।
Introduction
फॉर्मेलिन-फिक्स्ड और पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) ठोस ट्यूमर मानव ऊतक नमूनों में ट्यूमर-घुसपैठ लिम्फोसाइट्स (टीआईएलएस) और अन्य प्रतिरक्षा से संबंधित अणुओं के परिमाणीकरण ने नैदानिक अनुसंधान1,2,3में मूल्य का प्रदर्शन किया है। प्रवाह साइटोमेट्री और एकल-कोशिका राइबोंक्कलिक एसिड (आरएनए) अनुक्रमण जैसी सामान्य तकनीकें ताजा ऊतक और रक्त4के लिए उपयोगी हैं, लेकिन व्यवहार्य सेल निलंबन बनाने में असमर्थता के कारण एफएफपीई सामग्रियों के विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त हैं। एफएफपीई ऊतक में इन कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किए गए वर्तमान तरीके प्रमुख चुनौतियों से पीड़ित हैं। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) और इसी तरह के अन्य इमेजिंग वर्कफ्लो को सेल-सतह प्रोटीन का पता लगाने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, जिसे प्रजनन योग्य क्वांटिफिकेशन5को सक्षम करने के लिए प्रयोगशालाओं में मानकीकरण करना मुश्किल हो सकता है। एनकाउंटर सिस्टम जैसे प्लेटफॉर्म प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए एकल जीन की अभिव्यक्ति पर भरोसा करते हैं6,संवेदनशीलता और पता लगाने की विशिष्टता को सीमित करते हैं। स्टैंडअलोन सॉफ्टवेयर टूल के साथ-साथ अधिक सामान्य आरएनए अनुक्रमण विधियां उपलब्ध हैं, लेकिन7,8,9,10,11,12का उपयोग करने से पहले महत्वपूर्ण अनुकूलन और सत्यापन की आवश्यकता होती है। FFPE ऊतक के लिए आरएनए अनुक्रमण के साथ लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) के संयोजन में हाल ही में हुई प्रगति ने वादा दिखाया है; हालांकि, मजबूत बायोमार्कर13,14की पहचान करने के उद्देश्य से ट्रांसलेशनल अध्ययनों के लिए एक अधिक उच्च-थ्रूपुट, टर्नकी समाधान की आवश्यकता है। बहुआयामी बायोमार्कर उत्पन्न करने के तरीके, जैसे भविष्य कहनेवाला प्रतिरक्षा मॉडलिंग, जो चिकित्सा उत्तरदाताओं, कैंसर उपप्रकारों, या उच्च भविष्य कहनेवाला सटीकता और सांख्यिकीय महत्व के साथ जीवित रहने के परिणामों सहित रोगी साथियों को परिभाषित करते हैं, सटीक चिकित्सा और इम्यूनोथेरेपी15,16की उम्र में तेजी से महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं।
इस जरूरत को दूर करने के लिए, मानकीकृत आरएनए-अनुक्रमण अभिकर्ताओं और क्लाउड-आधारित सूचनाओं का उपयोग करके ठोस ट्यूमर एफएफपीई ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संवेदनशील और विशिष्ट मात्राकरण को सक्षम करने के लिए एक प्रतिरक्षा प्रोफाइलिंग परख विकसित की गई थी। एफएफपीई ऊतक से अवक्रमित आरएनए को समायोजित करने के अलावा, प्रोटोकॉल कोर सुई बायोप्सी, सुई एस्ट्रिएटिक्स और माइक्रो-या मैक्रो-विच्छेदित ऊतक जैसे ऊतक नमूनों को सीमित करने से प्राप्त आरएनए को समायोजित करने में सक्षम है। प्रत्येक नमूने से आरएनए डेटा प्रतिरक्षा कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति मॉडल के एक डेटाबेस की तुलना में है, प्रतिरक्षा स्वास्थ्य अभिव्यक्ति मॉडल कहा जाता है, नमूना में मौजूद कुल कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए । संक्षेप में, इन मॉडलों को शुद्ध प्रतिरक्षा कोशिका आबादी (विहित कोशिका-सतह मार्कर का उपयोग करके अलग-थलग)17,18से उत्पन्न पूरे-प्रतिलेखन डेटा से अद्वितीय बहुजनक अभिव्यक्ति पैटर्न की पहचान करने के लिए मशीन-लर्निंग विधियों का उपयोग करके बनाया गया था। प्रौद्योगिकी अंतर्निहित बहुआयामी स्वास्थ्य अभिव्यक्ति मॉडल विषम मिश्रण में मौजूद कुल कोशिकाओं के एक प्रतिशत के रूप में प्रत्येक प्रतिरक्षा कोशिका की मात्रा निर्धारित करने के लिए परख सक्षम बनाता है । यह शोधकर्ता को अंतर-और अंतर-नमूना प्रतिरक्षा कोशिका तुलना उत्पन्न करने में सक्षम बनाता है, जिसे नैदानिक मूल्य19,20दिखाया गया है। अन्य अनुप्रयोगों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पूर्व और उपचार के बाद की मात्रा शामिल है, जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में वर्णित है। ट्यूमर और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट की प्रतिरक्षा संरचना की कई विशेषताओं पर परख रिपोर्ट जिसमें आठ प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के पूर्ण प्रतिशत (जीन अभिव्यक्ति मॉडल से प्राप्त): CD4+ टी कोशिकाएं, CD8+ T कोशिकाएं, CD56+ प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाएं, CD19+ बी कोशिकाएं, CD14+ मोनोसाइट्स, ट्रेग्स, M1 मैक्रोफेज, और M2 मैक्रोफेज। इसके अलावा, परख अभिव्यक्ति (प्रति मिलियन, या टीपीएम में) दस प्रतिरक्षा एस्केप जीन की रिपोर्ट करता है: पीडी-1, पीडी-एल 1, सीटीएलए4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1, और ARG1।
रिएजेंट किट का उपयोग उच्च गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों को हाइब्रिड कैप्चर-आधारित पुस्तकालय तैयारकरने विधि के बाद इलुमिना प्लेटफॉर्म पर अनुक्रमण के लिए तैयार करने के लिए किया जाता है, जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है। यदि किसी शोधकर्ता के पास अपनी प्रयोगशाला में इलुमिना अनुक्रमण मंच नहीं है, तो वे अनुक्रमण के लिए अपने नमूने एक कोर प्रयोगशाला में प्रस्तुत कर सकते हैं। एक बार उत्पन्न होने के बाद, अनुक्रमण डेटा स्वचालित विश्लेषण के लिए चश्मे पोर्टल पर अपलोड किया जाता है, और प्रतिरक्षा रिपोर्ट(चित्रा 2ए)के रूप में प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने के लिए एक व्यापक, मात्रात्मक प्रोफ़ाइल उपयोगकर्ता को वापस कर दिया जाता है। उपयोगकर्ता एक बायोमार्कर रिपोर्ट(चित्रा 2बी)उत्पन्न करने के लिए चश्मे पोर्टल में नमूना समूहों को भी परिभाषित कर सकते हैं, जो सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण बायोमार्कर को रेखांकित करते हैं जो दो रोगी साथियों को अलग करते हैं। महत्वपूर्ण बात, अभिकर्मक किट द्वारा उत्पन्न डेटा केवल अनुसंधान उपयोग के लिए है और इसका उपयोग नैदानिक उद्देश्यों के लिए नहीं किया जा सकता है।
चित्रा 1: कार्यप्रवाह का अवलोकन। इस प्रोटोकॉल में आरएनए को सबसे पहले सीडीएनए में बदल दिया जाता है। अनुक्रमण एडाप्टर को लिगाटेड किया जाता है, और एडाप्टर-लिगाटेड सीडीएनए को पीसीआर द्वारा प्री-कैप्चर लाइब्रेरी बनाने के लिए परिलक्षित और बारकोड किया जाता है। बायोटिनी जांच तब विशिष्ट सीडीएनए लक्ष्यों के लिए संकरा हो जाती है, जिन्हें स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों का उपयोग करके कैप्चर किया जाता है। अनबाउंड, नॉन-लक्षित सीडीएनए को धोने से हटा दिया जाता है । एक अंतिम पीसीआर संवर्धन अनुक्रमण के लिए तैयार एक पोस्ट-कैप्चर लाइब्रेरी की पैदावार करता है। * कुल आरएनए मानव नमूनों से होना चाहिए; बरकरार या अपमानित (FFPE) आरएनए हो सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: प्रतिनिधि प्रतिरक्षा रिपोर्ट। कार्यप्रवाह दो रिपोर्टें उत्पन्न करता है, प्रत्येक नमूने के लिए एक व्यक्तिगत प्रतिरक्षा रिपोर्ट(ए)और परिभाषित रोगी साथियों के लिए एक बायोमार्कर रिपोर्ट(बी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
प्रोटोकॉल के लिए लगभग 16 घंटे की तैयारी के समय की आवश्यकता होती है (कुल आरएनए से अनुक्रमण के लिए तैयार पुस्तकालयों तक); हालांकि, प्रोटोकॉल में उल्लेख के अनुसार कई वैकल्पिक रोक बिंदु हैं। परख बहुआयामी जीन अभिव्यक्ति मॉडल के लिए विरासत एकल-विश्लेषण बायोमार्कर से आगे बढ़ने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक्स की समृद्ध, गतिशील प्रकृति का उपयोग करता है, जिससे मानकीकृत के साथ ऊतक नमूनों के व्यापक जैविक लक्षण वर्णन को सक्षम करता है अभिकर्मक ों और उपयोग में आसान सॉफ्टवेयर उपकरण। यह शोधकर्ताओं को मशीन लर्निंग और स्वास्थ्य अभिव्यक्ति मॉडल के डेटाबेस का लाभ उठाकर, अपनी प्रयोगशाला में एक समकालीन प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए और अधिक सटीक, कीमती नैदानिक नमूनों की मात्रात्मक प्रतिरक्षा प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए सशक्त बनाता है, और पता चलता है पूर्ण सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ बहुआयामी आरएनए बायोमार्कर।
Protocol
यहां दिखाए गए प्रतिनिधि परिणामों में उपयोग किए गए मानव ऊतक नमूनों को एक सम्मानित इकाई (ट्राइस्टार टेक्नोलॉजी ग्रुप) से खरीदा गया था और उन्होंने अकादमिक और वाणिज्यिक अनुसंधान की अनुमति देने वाली दाता सहमति के साथ-साथ एक सक्षम नैतिक से अनुमोदन को सूचित किया है समिति.
भाग I: पूर्व कब्जा पुस्तकालय तैयारी
1. आरएनए क्वांटिफिकेशन और योग्यता
- परख के लिए उचित इनपुट निर्धारित करने के लिए फ्लोरोमेट्रिक परख का उपयोग कर आरएनए की मात्रा निर्धारित करें। आरएनए इंटीग्रिटी नंबर (आरआईएन) और टुकड़ों और 200 न्यूक्लियोटाइड्स (डीवी200)मूल्यों का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके इनपुट आरएनए की गुणवत्ता का आकलन करें।
- अक्षुण्ण (RIN > 7) या आंशिक रूप से अपमानित आरएनए नमूने (RIN = 2 से 7) के लिए उच्च गुणवत्ता/बरकरार आरएनए के लिए पुस्तकालय तैयार करने के कदम का पालन करें, कदम २.१ के साथ शुरू । आरएनए की गुणवत्ता थर्मल साइकिल प्रोग्राम #1(पूरक तालिका 2)में सही विखंडन समय का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
- अत्यधिक अवक्रमित नमूनों (जैसे, आरआईन = 1 से 2 या एफएफपीई) के लिए, डीवी200 मूल्य निर्धारित करें। इन नमूनों को विखंडन की आवश्यकता नहीं है और चरण 2.2 से शुरू होने वाले अवक्रमित आरएनए के निर्देशों का पालन करेंगे।
- आरएनए के 20 एनजी (उच्च गुणवत्ता/आरेकआरएनए के साथ RIN > 2) या आरएनए के 40 एनजी (डीवी200 > 20%) न्यूस्लीज-मुक्त पानी में 5 μL करने के लिए। डीवी200 और एलटी के साथ नमूनों को प्रोसेस करने की सिफारिश नहीं की जाती है। किट के साथ प्रदान किए गए नियंत्रण आरएनए नमूनों के लिए, न्यूलीज-मुक्त पानी के 4 माइक्रोन में उपयुक्त आरएनए के 1 माइक्रोन को पतला करें। नियंत्रण नमूने एक ही प्रसंस्करण का पालन करेंगे जैसा कि लेबल के रूप में उच्च गुणवत्ता (अक्षुण्ण) या अवक्रमित (एफएफपीई) आरएनए सामग्री के लिए वर्णित है। किट में शामिल सभी अभिकर्मकों के लिए पूरक तालिका 1 देखें।
2. आरएनए विखंडन और भड़काना
- रिन एंड जीटी एंड 2 के साथ उच्च गुणवत्ता/अक्षुण्ण आरएनए के लिए चरण 2.1.1 का पालन करें।
- उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए के लिए, तालिका 1के अनुसार एक न्यूकलीज-मुक्त पीसीआर ट्यूब में बर्फ पर विखंडन और भड़काना प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें।
- कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं। फिर, संक्षेप में एक माइक्रोसेंट्रोफ्यूज में नमूनों को स्पिन करें
नोट: प्रोटोकॉल में सभी अपकेंद्रित्र स्पिन के लिए, कम से कम 3 एस के लिए 1,000 x ग्राम की गति की सिफारिश की जाती है। - नमूनों को थर्मल साइकिलर में रखें और कार्यक्रम #1(पूरक तालिका 2)का उपयोग करें।
- तुरंत बर्फ के लिए ट्यूबों हस्तांतरण और उच्च गुणवत्ता आरएनए (चरण 3.1) के लिए पहले स्ट्रैंड cDNA संश्लेषण के लिए आगे बढ़ना। उच्च गुणवत्ता और एफएफपीई आरएनए दोनों की समवर्ती तैयारी के लिए, विखंडन ऊष्मायन के दौरान एफएफपीई आरएनए (चरण 2.2) की तैयारी शुरू करें।
- कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं। फिर, संक्षेप में एक माइक्रोसेंट्रोफ्यूज में नमूनों को स्पिन करें
- उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए के लिए, तालिका 1के अनुसार एक न्यूकलीज-मुक्त पीसीआर ट्यूब में बर्फ पर विखंडन और भड़काना प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें।
| विखंडन और भड़काना मिश्रण | वॉल्यूम (μL) |
| बरकरार या आंशिक रूप से अपमानित आरएनए (20 एनजी) | 5 |
| पहला स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया बफर | 4 |
| रैंडम प्राइमर्स | 1 |
| कुल मात्रा | 10 |
तालिका 1: उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए के लिए विखंडन और भड़काने की प्रतिक्रिया। उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए के लिए विखंडन और भड़काना प्रतिक्रिया के घटकों को इकट्ठा किया जाना चाहिए और दिखाए गए संस्करणों के अनुसार बर्फ पर मिलाया जाना चाहिए। पहले स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया बफर और रैंडम प्राइमर का एक मास्टर मिश्रण बनाया जा सकता है और आरएनए नमूनों में जोड़ा जा सकता है।
- डीवी 200 और जीटी20% के साथ अवक्रमित/एफएफपीई आरएनए के लिए चरण 2.2.1 का पालन करें।
- अत्यधिक अपमानित (एफएफपीई) आरएनए के लिए जिसे विखंडन की आवश्यकता नहीं होती है, टेबल 2में वर्णित प्राइमिंग प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें। बरकरार आरएनए के लिए, चरण 2.1 का पालन करना याद रखें।
- कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं। फिर, संक्षेप में एक माइक्रोसेंट्रोज में नमूनों को स्पिन करें।
- नमूनों को थर्मल साइकिलर में रखें और कार्यक्रम #2(पूरक तालिका 2)का उपयोग करें।
- ट्यूबों को बर्फ में स्थानांतरित करें और अत्यधिक अवक्रमित (एफएफपीई) आरएनए (चरण 3.2) के लिए पहले स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण के लिए आगे बढ़ें।
- अत्यधिक अपमानित (एफएफपीई) आरएनए के लिए जिसे विखंडन की आवश्यकता नहीं होती है, टेबल 2में वर्णित प्राइमिंग प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें। बरकरार आरएनए के लिए, चरण 2.1 का पालन करना याद रखें।
| भड़काने की प्रतिक्रिया | वॉल्यूम (μL) |
| एफएफपीई आरएनए (40 एनजी) | 5 |
| रैंडम प्राइमर्स | 1 |
| कुल मात्रा | 6 |
तालिका 2: अत्यधिक अपमानित आरएनए के लिए यादृच्छिक भड़काना प्रतिक्रिया। अत्यधिक अपमानित आरएनए के लिए भड़काने प्रतिक्रिया के घटकों को एक न्यूलीज-मुक्त पीसीआर ट्यूब में बर्फ पर इकट्ठा किया जाना चाहिए।
3. पहला स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण
- रिन एंड जीटी एंड 2 के साथ उच्च गुणवत्ता/अक्षुण्ण आरएनए के लिए चरण 3.1.1 का पालन करें।
- बरकरार आरएनए (उच्च गुणवत्ता) के लिए, तालिका 3के अनुसार एक नग्न-मुक्त पीसीआर ट्यूब में बर्फ पर पहली स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें।
- बर्फ पर प्रतिक्रियाओं को ध्यान में रखते हुए, कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। संक्षेप में एक माइक्रोसेंटरिफ्यूज में नमूनों को स्पिन करें, और सीधे पहले स्ट्रैंड संश्लेषण ऊष्मायन (चरण 4) पर आगे बढ़ें।
- बरकरार आरएनए (उच्च गुणवत्ता) के लिए, तालिका 3के अनुसार एक नग्न-मुक्त पीसीआर ट्यूब में बर्फ पर पहली स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें।
| पहला स्ट्रैंड संश्लेषण | वॉल्यूम (μL) |
| खंडित और प्रिमेड आरएनए (चरण 2.1.3) | 10 |
| पहला स्ट्रैंड संश्लेषण विशिष्टता अभिकर्ता | 8 |
| पहला स्ट्रैंड संश्लेषण एंजाइम मिक्स | 2 |
| कुल मात्रा | 20 |
तालिका 3: उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए के लिए पहला स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया। उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए के लिए विखंडन और भड़काने की प्रतिक्रिया के घटकों को इकट्ठा किया जाना चाहिए और दिए गए वॉल्यूम के अनुसार बर्फ पर मिलाया जाना चाहिए। पहले स्ट्रैंड संश्लेषण विशिष्टता अभिकर्ता और पहले स्ट्रैंड संश्लेषण एंजाइम मिश्रण का एक मास्टर मिश्रण बनाया जा सकता है और खंडित और प्राइमेड आरएनए नमूनों में जोड़ा जा सकता है।
- डीवी 200 और जीटी20% के साथ अवक्रमित/एफएफपीई आरएनए के लिए चरण 3.2.1 का पालन करें।
- अत्यधिक अवक्रमित आरएनए (एफएफपीई) के लिए, टेबल 4के अनुसार एक न्यूकलीज-मुक्त पीसीआर ट्यूब में बर्फ पर पहली स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें।
- बर्फ पर प्रतिक्रियाओं को ध्यान में रखते हुए, कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। संक्षेप में एक माइक्रोसेंटरिफ्यूज में नमूनों को स्पिन करें, और सीधे पहले स्ट्रैंड संश्लेषण ऊष्मायन (चरण 4) पर आगे बढ़ें।
- अत्यधिक अवक्रमित आरएनए (एफएफपीई) के लिए, टेबल 4के अनुसार एक न्यूकलीज-मुक्त पीसीआर ट्यूब में बर्फ पर पहली स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें।
| पहला स्ट्रैंड संश्लेषण | वॉल्यूम (μL) |
| प्रिमेड आरएनए (स्टेप 2.2.3) | 6 |
| पहला स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया बफर | 4 |
| पहला स्ट्रैंड विशिष्टता अभिकर्ता | 8 |
| पहला स्ट्रैंड संश्लेषण एंजाइम मिक्स | 2 |
| कुल मात्रा | 20 |
तालिका 4: अत्यधिक अवक्रमित आरएनए के लिए पहली स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया। अत्यधिक अवक्रमित आरएनए के लिए विखंडन और भड़काना प्रतिक्रिया के घटकों को इकट्ठा किया जाना चाहिए और दिखाए गए संस्करणों के अनुसार बर्फ पर मिलाया जाना चाहिए। पहले स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया बफर, पहले स्ट्रैंड संश्लेषण विशिष्टता रिएजेंट का एक मास्टर मिश्रण, और पहले स्ट्रैंड संश्लेषण एंजाइम मिश्रण बनाया जा सकता है और प्राइम्ड आरएनए नमूनों में जोड़ा जा सकता है।
4. पहले स्ट्रैंड संश्लेषण ऊष्मायन
- बर्फ पर ट्यूब रखते हुए, कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। संक्षेप में एक माइक्रोसेंटिफ्यूज में नमूनों को नीचे स्पिन करें। कार्यक्रम #3(पूरक तालिका 2)के बाद एक पूर्व गरम थर्मल साइकिलर में नमूनों को इनक्यूबेट करना।
5. दूसरा स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण
- चरण 4.1 से पहला स्ट्रैंड रिएक्शन उत्पाद सहित तालिका 5में सूचीबद्ध घटकों को कोडांतरण करके बर्फ पर दूसरा स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया तैयार करें।
| दूसरा स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया | वॉल्यूम (μL) |
| पहला स्ट्रैंड संश्लेषण उत्पाद (चरण 4.1) | 20 |
| दूसरा स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया बफर | 8 |
| दूसरा स्ट्रैंड संश्लेषण एंजाइम मिक्स | 4 |
| न्यूक्लीज-मुक्त पानी | 48 |
| कुल मात्रा | 80 |
तालिका 5: दूसरा स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया। दूसरे स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया के घटकों को इकट्ठा किया जाना चाहिए और दिखाए गए वॉल्यूम के अनुसार बर्फ पर मिलाया जाना चाहिए। दूसरा स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया बफर, दूसरा स्ट्रैंड संश्लेषण एंजाइम मिक्स, और न्यूकलीज-मुक्त पानी का एक मास्टर मिश्रण बनाया जा सकता है और पहले स्ट्रैंड संश्लेषण उत्पाद में जोड़ा जा सकता है।
- बर्फ पर ट्यूब रखते हुए, कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। कार्यक्रम #4(पूरक तालिका 2)के बाद एक थर्मल साइकिलर में इनक्यूबेट।
6. SPRI (ठोस चरण रिवर्सेबल स्थिरीकरण) मोतियों का उपयोग कर सीडीएनए सफाई
- एसपीआई मोतियों को उपयोग से पहले कम से कम 30 न्यूनतम कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति दें, और फिर लगभग 30 एस के लिए भंवर SPRI मोती को फिर से निलंबित करने के लिए।
- दूसरे स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया (~ 80 माइक्रोन) में पुनर्निलंबित मोतियों के 144 माइक्रोन जोड़ें। कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं और कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करें।
- संक्षेप में ट्यूबों को माइक्रोसेंटिफ्यूज में स्पिन करें और ट्यूबों को एक चुंबकीय रैक पर रखें ताकि अलौकिक से मोतियों को अलग किया जा सके। समाधान स्पष्ट होने के बाद, ध्यान से हटा दें और अधिष्णकतियों को त्याग दें। सावधान रहें कि मोतियों को परेशान न करें, जिनमें डीएनए हो।
- चुंबकीय रैक पर रहते हुए ट्यूबों के लिए हौसले से तैयार 80% इथेनॉल के 180 μL जोड़ें। 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट, और फिर ध्यान से हटाने और supernatant त्यागें ।
- कुल 2 वाशिंग चरणों के लिए एक बार चरण 6.4 दोहराएं।
- अवशिष्ट इथेनॉल को पूरी तरह से हटा दें। चुंबकीय रैक पर ट्यूब छोड़ दें और हवा ढक्कन खुले के साथ लगभग 3 मिन के लिए मोती सूखी, या दिख सूखी जब तक । मोतियों को सूखा न करें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप डीएनए की वसूली कम हो सकती है।
- चुंबक से ट्यूब निकालें और मोतियों के लिए 53 μL 0.1x TE बफर (अभिकर्मक किट में शामिल, पूरक तालिका 1देखें) जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। कमरे के तापमान पर 2 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
- ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें, जिससे मोतियों को अलौकिक से पूरी तरह से अलग किया जा सके। न्यूलीज-फ्री पीसीआर ट्यूब को साफ करने के लिए सुपरनेटेंट के 50 माइक्रोन ट्रांसफर करें। सावधान रहें कि मोतियों को परेशान न करें। यह प्रोटोकॉल में एक वैकल्पिक रोक बिंदु है, सीडीएनए नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
7. सीडीएनए लाइब्रेरी की अंतिम मरम्मत
- चरण 6.8 से दूसरे स्ट्रैंड संश्लेषण उत्पाद के लिए तालिका 6 में सूचीबद्ध घटकों को कोडांतरण करके बर्फ पर अंतिम मरम्मत प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें।
| अंत मरम्मत प्रतिक्रिया | वॉल्यूम (μL) |
| दूसरा स्ट्रैंड संश्लेषण उत्पाद (चरण 6.8) | 50 |
| अंत मरम्मत प्रतिक्रिया बफर | 7 |
| एंड रिपेयर एंजाइम मिक्स | 3 |
| कुल मात्रा | 60 |
तालिका 6: अंत मरम्मत प्रतिक्रिया। अंतिम मरम्मत प्रतिक्रिया के घटकों को इकट्ठा किया जाना चाहिए और दिखाए गए वॉल्यूम के अनुसार बर्फ पर मिलाया जाना चाहिए। एंड रिपेयर रिएक्शन बफर और एंड रिपेयर एंजाइम मिक्स का मास्टर मिक्स बनाया जा सकता है और दूसरे स्ट्रैंड संश्लेषण उत्पाद में जोड़ा जा सकता है।
- 50 μL के लिए एक पिपेट सेट करें और फिर पूरी मात्रा को अच्छी तरह से मिलाने के लिए कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। संक्षेप में ट्यूबों के किनारों से सभी तरल इकट्ठा करने के लिए अपकेंद्रित्र। इसे अच्छी तरह से मिलाना जरूरी है । बुलबुले की एक छोटी राशि की उपस्थिति प्रदर्शन में हस्तक्षेप नहीं करेगी।
- कार्यक्रम #5(पूरक तालिका 2)के बाद एक थर्मल साइकिलर में नमूनों को इनक्यूबेट करना।
8. एडाप्टर लिगेशन
- लिगेशन रिएक्शन स्थापित करने से पहले, टेबल 7में दिखाए गए बर्फ-ठंडे एडाप्टर कमजोर पड़ने वाले बफर में एडाप्टर को पतला करें, नमूनों की आवश्यक संख्या से गुणा करें, साथ ही 10% अतिरिक्त। बर्फ पर पतला एडाप्टर रखें।
| लिगेशन कमजोर पड़ने | वॉल्यूम (μL) |
| एडेप्टर | 0.5 |
| एडाप्टर कमजोर पड़ने बफर | 2 |
| कुल मात्रा | 2.5 |
तालिका 7: एडाप्टर कमजोर पड़ने। एडाप्टर को दिखाए गए वॉल्यूम के अनुसार एडाप्टर कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ बर्फ पर पतला किया जाना चाहिए।
- चरण 7.3 से अंतिम तैयारी प्रतिक्रिया उत्पाद के लिए सूचीबद्ध आदेश में टेबल 8में वर्णित घटकों को जोड़कर बर्फ पर लिगेशन प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें। ध्यान रहे कि लिगेशन मास्टर मिक्स एंड लिगेशन एन्हांसमेंट को समय से पहले मिलाया जा सकता है। यह मिश्रण कम से कम 8 घंटे कम से कम 4 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थिर है। एडाप्टर लिगेशन स्टेप में इस्तेमाल करने से पहले लिगेशन मास्टर मिक्स, लिगेशन एन्हांसर और एडाप्टर को प्रीमिक्स न करें।
| लिगेशन रिएक्शन | वॉल्यूम (μL) |
| अंत Prepped डीएनए (चरण 7.3) | 60 |
| पतला एडाप्टर (चरण 8.1) | 2.5 |
| लिगामेंट एन्हांसमेंट | 1 |
| लिगेशन मास्टर मिक्स | 30 |
| कुल मात्रा | 93.5 |
तालिका 8: लिगेशन रिएक्शन। एडाप्टर लिगेशन प्रतिक्रिया के घटकों को दिखाए गए क्रम में दिखाए गए संस्करणों के अनुसार बर्फ पर इकट्ठा किया जाना चाहिए। लिगेशन एन्हांसर और लिगेशन मास्टर मिक्स का मास्टर मिक्स बनाया जा सकता है और पतला एडाप्टर के साथ एंड प्रीपेड डीएनए में जोड़ा जा सकता है। एंड प्रीप्ड डीएनए के साथ मिश्रण करने से पहले पतला एडाप्टर और लिगेशन मास्टर मिक्स या लिगेशन एन्हांसर न मिलाएं।
- 80 μL के लिए एक पिपेट सेट करें और फिर पूरी मात्रा को अच्छी तरह से मिलाने के लिए कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। ट्यूबों के किनारों से सभी तरल एकत्र करने के लिए एक त्वरित स्पिन करें। लिगेशन मास्टर मिक्स बहुत चिपचिपा है। लिगेशन रिएक्शन का पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखें, क्योंकि अधूरे मिश्रण के परिणामस्वरूप लिगेशन दक्षता कम हो जाएगी। बुलबुले की एक छोटी राशि की उपस्थिति प्रदर्शन में हस्तक्षेप नहीं करेगी।
- इनक्यूबेट निम्नलिखित कार्यक्रम #6(पूरक तालिका 2),और फिर थर्मल साइकिल रकसे से लिगेशन मिश्रण को हटा दें और एडाप्टर प्रोसेसिंग एंजाइम के 3 माइक्रोन जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप कुल मात्रा 96.5 माइक्रोन हो।
- अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट, और फिर लिगेशन प्रतिक्रिया के शुद्धिकरण के लिए तुरंत आगे बढ़ने से पहले कार्यक्रम #7(पूरक तालिका 2)के बाद इनक्यूबेट करें।
9. एसपीआई आईएडीएस का उपयोग करके लिगेशन रिएक्शन का शुद्धिकरण
- एसपीआईआई मोतियों को उपयोग से पहले कम से कम 30 न्यूनतम कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति दें, और फिर लगभग 30 एस के लिए भंवर SPRI मोती को फिर से निलंबित करने के लिए।
- रिस्प्टेड एसपीआई मोतियों के 87 माइक्रोन जोड़ें और कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
- संक्षेप में ट्यूबों को माइक्रोसेंटिफ्यूज में स्पिन करें और ट्यूबों को एक चुंबकीय रैक पर रखें ताकि अलौकिक से मोतियों को अलग किया जा सके। समाधान स्पष्ट होने के बाद (~ 5 मिनट), ध्यान से हटा दें और अधिनेत को त्यागें। मोतियों को न त्यागें।
- चुंबकीय रैक पर रहते हुए ट्यूबों के लिए हौसले से तैयार 80% इथेनॉल के 180 μL जोड़ें। 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट, और फिर ध्यान से हटाने और supernatant त्यागें । कुल 2 वाशिंग चरणों के लिए एक बार चरण 9.4 दोहराएं।
- अवशिष्ट इथेनॉल को पूरी तरह से हटा दें। चुंबकीय रैक पर ट्यूब छोड़ दें और हवा ढक्कन खुले के साथ लगभग 3 मिन के लिए मोती सूखी, या दिख सूखी जब तक । मोतियों को सूखा न करें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप डीएनए की वसूली कम हो सकती है।
- चुंबक से ट्यूब निकालें और मोतियों में 0.1x TE बफर के 17 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। कमरे के तापमान पर 2 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट, और फिर ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें, जिससे मोती को सुपरनेटेंट से पूरी तरह से अलग होने की अनुमति मिल जाती है।
- न्यूलीज-फ्री पीसीआर ट्यूब को साफ करने के लिए सुपरनेटेंट के 15 माइक्रोन ट्रांसफर करें। सावधान रहें कि मोतियों को परेशान न करें। यह प्रोटोकॉल में एक वैकल्पिक रोक बिंदु है, एडाप्टर-लिगाटेड डीएनए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
10. अनुकूलक लिगाटेड डीएनए की पीसीआर संवर्धन
- पीसीआर प्रतिक्रिया को टेबल 9में वर्णित स्थापित करें । प्री-कैप्चर पीसीआर मास्टर मिक्स और यूनिवर्सल प्राइमर युक्त मास्टर मिक्स को एडाप्टर लिगाटेड डीएनए में बनाया और जोड़ा जा सकता है। मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए, प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए अद्वितीय इंडेक्स प्राइमर का उपयोग करें और प्रत्येक नमूने को व्यक्तिगत रूप से जोड़ें।
| पीसीआर संवर्धन | वॉल्यूम (μL) |
| एडाप्टर लिगाटेड डीएनए (चरण 10.1) | 15 |
| प्री-कैप्चर पीसीआर मास्टर मिक्स | 25 |
| यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमर | 5 |
| इंडेक्स (X) प्राइमर | 5 |
| कुल मात्रा | 50 |
तालिका 9: एडाप्टर लिगाटेड डीएनए का पीसीआर संवर्धन। एडाप्टर लिगाटेड डीएनए प्रतिक्रिया के पीसीआर संवर्धन के घटकों को इकट्ठा किया जाना चाहिए और दिखाए गए वॉल्यूम के अनुसार बर्फ पर मिलाया जाना चाहिए। प्री-कैप्चर पीसीआर मास्टर मिक्स और यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमर का मास्टर मिक्स बनाया जा सकता है और एडाप्टर लिगाटेड डीएनए में जोड़ा जा सकता है। मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए, प्रत्येक नमूने को एक अद्वितीय इंडेक्स प्राइमर दिया जाना चाहिए।
- धीरे-धीरे 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। संक्षेप में एक माइक्रोसेंटिफ्यूज में ट्यूबों को स्पिन करें और थर्मल साइकिलर में रखें और प्रोग्राम #8(पूरक तालिका 2)का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन करें।
11. एसपीआई मोतियों का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रिया का शुद्धिकरण
- एसपीआईआई मोतियों को उपयोग से पहले कम से कम 30 न्यूनतम कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति दें, और फिर लगभग 30 एस के लिए भंवर SPRI मोती को फिर से निलंबित करने के लिए।
- प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया (~ 50 माइक्रोन) में पुनर्निलंबित मोतियों के 45 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेटिंग से पहले, कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
- संक्षेप में ट्यूबों को माइक्रोसेंटिफ्यूज में स्पिन करें और ट्यूबों को एक चुंबकीय रैक पर रखें ताकि अलौकिक से मोतियों को अलग किया जा सके। समाधान स्पष्ट होने के बाद (~ 5 मिनट), ध्यान से हटा दें और अधिनेत को त्यागें। डीएनए वाले मोतियों को परेशान न करें, इसका ध्यान रखें।
- चुंबकीय रैक में रहते हुए ट्यूबों में ताजा तैयार 80% इथेनॉल के 180 μL जोड़ें। 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट, और फिर ध्यान से हटाने और supernatant त्यागें । कुल 2 वाशिंग चरणों के लिए एक बार चरण 11.4 दोहराएं।
- अवशिष्ट इथेनॉल को पूरी तरह से हटा दें। चुंबकीय रैक पर ट्यूब छोड़ दें और हवा ढक्कन खुले के साथ लगभग 3 मिन के लिए मोती सूखी, या दिख सूखी जब तक । मोतियों को सूखा न करें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप डीएनए की वसूली कम हो सकती है।
- चुंबक से ट्यूब निकालें और मोती के लिए 23 μL 0.1x TE बफर जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। कमरे के तापमान पर 2 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
- ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें, जिससे मोतियों को अलौकिक से पूरी तरह से अलग किया जा सके। न्यूलीज-फ्री पीसीआर ट्यूब को साफ करने के लिए सुपरनेटेंट के 20 माइक्रोन ट्रांसफर करें। सावधान रहें कि मोतियों को परेशान न करें। यह प्रोटोकॉल में एक वैकल्पिक रोक बिंदु है, प्री-कैप्चर लाइब्रेरी -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत की जा सकती है।
12. प्री-कैप्चर लाइब्रेरी को मान्य और निर्धारित करना
- फ्लोरोमीटर और उच्च संवेदनशीलता परख किट का उपयोग करके प्री-कैप्चर लाइब्रेरी की एकाग्रता को मापें। 200 एनजी की एक न्यूनतम उपज भाग द्वितीय के लिए आगे बढ़ने के लिए आवश्यक है: संकरण और कैप्चर।
- डिजिटल इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम पर लाइब्रेरी का 1 माइक्रोन चलाएं। यदि आवश्यक हो, तो निर्माता की प्रोटोकॉल सिफारिशों के अनुसार, उच्च संवेदनशीलता चिप को ओवरलोड करने से बचने के लिए नमूना पतला करें।
- जांच लें कि इलेक्ट्रोहीरोग्राम लगभग 250-400 बीपी के साथ एक संकीर्ण वितरण दिखाता है (प्रतिनिधि परिणाम देखें, चित्रा 3 और चित्रा 4)।
- यदि बायोएनालाइजर निशान में 128 बीपी पीक (एडाप्टर-डिमर) दिखाई देता है, और सिग्नल की तीव्रता 250-400 बीपी लाइब्रेरी सिग्नल (प्रतिनिधि परिणाम देखें, चित्रा 5)की तीव्रता है, और फिर नमूना मात्रा (चरण 11.7 से) 0.1x TE बफर के साथ 50 माइक्रोन तक लाएं और एसपीआईई बीड शुद्धि (चरण 11) दोहराएं। यह प्रोटोकॉल में एक वैकल्पिक रोक बिंदु है, पूर्व-कैप्चर पुस्तकालयों को भाग II पर जाने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है: इम्यूनोप्रििज्म संकरण और कैप्चर।
भाग II: संकरण और कैप्चर
13. ब्लॉकिंग ओलिगोस, खाट-1 डीएनए, प्री-कैप्चर लाइब्रेरी डीएनए और ड्राई को मिलाएं
- चरण 11 में तैयार बारकोडेड लाइब्रेरी को मिलाएं और चरण 12 में क्वांटिफाइड करें, खाट-1 डीएनए के साथ और एक न्यूकलीज-फ्री पीसीआर ट्यूब या 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में ओलिगोस को अवरुद्ध करें, जैसा कि टेबल 10में दिखाया गया है।
| अभिकर्मक | मात्रा/मात्रा |
| स्टेप 10.10 से बारकोड लाइब्रेरी | 200 एनजी |
| खाट-1 डीएनए | 2 μg |
| ओलिगोस को अवरुद्ध करना | 2 माइक्रोन |
तालिका 10: संकरण तैयारी और सूखना। संकरण की तैयारी में पुस्तकालयों को सुखाने के लिए संयुक्त किए जाने वाले घटकों को दिखाई गई मात्राओं के अनुसार इकट्ठा किया जाना चाहिए।
- वैक्यूम एकाग्रता सेट का उपयोग करट्यूब की सामग्री को 30-45 डिग्री सेल्सियस तक सुखा लें। यह प्रोटोकॉल में एक वैकल्पिक रोक बिंदु है। सूखने के बाद, ट्यूबों को कमरे के तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस) पर या -20 डिग्री सेल्सियस पर अधिक समय तक संग्रहित किया जा सकता है।
14. पुस्तकालय के साथ डीएनए कैप्चर जांच को संकरण करें
- गल 2x बीड वॉश बफर और हाइब्रिडाइजेशन बफर, हाइब्रिडाइजेशन बफर एन्हांसर, इम्यूनोप्रिज़्म प्रोब पैनल, 10x वॉश बफर 1, 10x वॉश बफर 2, 10x वॉश बफर 3, और कमरे के तापमान पर 10x कड़े वॉश बफर। उपयोग से पहले, लवण के क्रिस्टलीकरण के लिए संकरण बफर का निरीक्षण करें। यदि क्रिस्टल मौजूद हैं, तो ट्यूब को 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें, रुक-रुककर हिलाएं, जब तक कि बफर पूरी तरह से घुलना न जाए।
- कमरे के तापमान पर, एक ट्यूब में संकरण मास्टर मिक्स बनाएं। नमूनों की संख्या से मात्रा गुणा करें और तालिका 11के बाद 10% अतिरिक्त जोड़ें।
| हाइब्रिडाइजेशन मास्टर मिक्स | वॉल्यूम (μL) |
| संकरण बफर | 8.5 |
| संकरण बफर एन्हांसर | 2.7 |
| इम्यूनोप्रिमिज्म प्रोब पैनल | 5 |
| न्यूक्लीज-मुक्त पानी | 0.8 |
| कुल मात्रा | 17 |
तालिका 11: संकरण मास्टर मिक्स। संकरण मास्टर मिक्स के घटकों को दिखाया गया मात्रा के अनुसार कमरे के तापमान पर इकट्ठा और मिश्रित किया जाना चाहिए।
- भंवर या पिपेट ऊपर और नीचे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । फिर, सूखे डीएनए युक्त प्रत्येक ट्यूब में संकरण मास्टर मिक्स के 17 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूबों को सील करें और कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करें।
- नमूनों भंवर, यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे पूरी तरह से मिश्रित कर रहे हैं, और एक माइक्रोसेंटरिफ्यूज में संक्षेप में नमूनों नीचे स्पिन । यदि लागू हो, तो प्रत्येक नमूने को 1.5 मिलीएल माइक्रोट्यूब से न्यूकलीज-मुक्त पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- नमूनों को थर्मल साइकिलर में रखें और प्रोग्राम #9(पूरक तालिका 2)चलाएं।
- ऊष्मायन के दौरान, वॉश बफर (चरण 15) और स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों (चरण 16) को तैयार करें, जिससे बफ़र्स को प्रीहीट करने और स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को समतुल्य करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति मिल सके।
15. वॉश बफर तैयार करें
नोट: धोबों 2x (बीड वॉश बफर) या 10x (अन्य सभी धोने बफ़र्स) केंद्रित समाधान के रूप में आपूर्ति कर रहे हैं।
- संकरण ऊष्मायन के दौरान, तालिका 12के बाद, 1x वर्किंग समाधान बनाने के लिए 2x बीड वॉश बफर और 10x वॉश बफर को पतला करें, नमूनों की आवश्यक संख्या से गुणा करें और 10% अतिरिक्त जोड़ दें। यदि 10x वॉश बफर 1 बादल छाए हुए हैं, तो कणों को फिर से निलंबित करने के लिए बोतल को 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान या हीटिंग ब्लॉक में गर्म करें। फ्रोजन 1x वॉश बफर को विगलन के बाद मिलाया जाना चाहिए।
| बफ़र्स धोएं | केंद्रित बफर (μL) | न्यूक्लीज-मुक्त पानी (μL) | कुल (μL) |
| बीड वॉश बफर | 150 | 150 | 300 |
| वॉश बफर 1 | 25 | 225 | 250 |
| वॉश बफर 2 | 15 | 135 | 150 |
| वॉश बफर 3 | 15 | 135 | 150 |
| कड़े धोने बफर | 30 | 270 | 300 |
तालिका 12: बफर कमजोर पड़ने धोएं। एकाग्रता धोने बफ़र्स को दिखाए गए वॉल्यूम के अनुसार कमरे के तापमान पर न्यूकलीज-मुक्त पानी से पतला किया जाना चाहिए।
- अलीकोट 1x वॉश बफर को न्यूकलीज-फ्री पीसीआर ट्यूबों में उद्धृत करें और तालिका 13में इंगित उपयुक्त तापमान पर रखें। पाइपिंग के लिए पर्याप्त ओवरएज शामिल करना सुनिश्चित करें। गर्म बफ़र्स के लिए, 70 डिग्री सेल्सियस तक ढक्कन सेट के साथ 65 डिग्री सेल्सियस तक सेट थर्मल साइकिलर का उपयोग करें।
| बफ़र्स धोएं | होल्डिंग तापमान | वॉल्यूम/ट्यूब (μL) | ट्यूबों की संख्या/नमूना |
| बीड वॉश बफर | आर टी (15-25 डिग्री सेल्सियस) | 100 | 3 |
| वॉश बफर 1 | 65 डिग्री सेल्सियस | 100 | 1 |
| वॉश बफर 1 | आर टी (15-25 डिग्री सेल्सियस) | 150 | 1 |
| वॉश बफर 2 | आर टी (15-25 डिग्री सेल्सियस) | 150 | 1 |
| वॉश बफर 3 | आर टी (15-25 डिग्री सेल्सियस) | 150 | 1 |
| कड़े धोने बफर | 65 डिग्री सेल्सियस | 150 | 2 |
तालिका 13: पतला वॉश बफ़र्स। पतला धोने बफ़र्स की मात्रा और प्रति नमूना दिखाए गए ट्यूबों की संख्या के अनुसार अलग ट्यूबों में बहाया जाना चाहिए । उपयोग से पहले इंगित तापमान पर धोने बफ़र्स आयोजित किया जाना चाहिए।
- टेबल 14में दिखाए गए कमरे के तापमान पर मनका पुनर्संक मिश्रण तैयार करें, नमूनों की आवश्यक संख्या से गुणा करें और 10% अतिरिक्त जोड़ें।
| बीड रिसलस्पेंशन मिक्स | वॉल्यूम (μL) |
| संकरण बफर | 8.5 |
| संकरण बफर एन्हांसर | 2.7 |
| न्यूक्लीज-मुक्त पानी | 5.8 |
| कुल मात्रा | 17 |
तालिका 14: बीड पुनर्संकता मिश्रण। मनका पुनर्संक मिश्रण के घटकों को इकट्ठा किया जाना चाहिए और दिखाए गए वॉल्यूम के अनुसार कमरे के तापमान पर मिलाया जाना चाहिए।
16. स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को तैयार करें
- उपयोग से पहले कम से कम 30 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को अलग करें। मोतियों को 15 एस के लिए भंवर करके अच्छी तरह से मिलाएं और प्रति कैप्चर 50 माइक्रोन को न्यूकलीज-फ्री पीसीआर ट्यूब में बदलें।
- प्रत्येक ट्यूब में 1x बीड वॉश बफर (चरण 15.1 में तैयार) के 100 माइक्रोन जोड़ें। धीरे-धीरे मिश्रण करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। ट्यूब को चुंबकीय रैक पर रखें, जिससे मोतियों को अलौकिक से पूरी तरह से अलग किया जा सके।
- स्पष्ट अधिष्णकको निकालें और त्यागें। सावधान रहें कि मोतियों को परेशान न करें।
- निम्नलिखित धोने का प्रदर्शन करें।
- चुंबकीय रैक से निकालें। मोतियों वाले प्रत्येक ट्यूब में 1x मनका वॉश बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें, और फिर मिश्रण करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
- ट्यूब को चुंबकीय रैक में रखें, जिससे मोतियों को अलौकिक से पूरी तरह से अलग किया जा सके।
- ध्यान से निकालें और स्पष्ट अलौकिक त्यागें।
- कुल दो वॉश के लिए एक बार चरण 16.4 दोहराएं।
- चुंबकीय रैक से निकालें। प्रत्येक ट्यूब में चरण 15.3 से बीड रिसलस्पेंशन मिक्स के 17 माइक्रोन जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। सुनिश्चित करें कि मोती ट्यूबों के किनारों पर अटके नहीं हैं। यदि आवश्यक हो, तो नीचे मोतियों को इकट्ठा करने के लिए ट्यूबों को संक्षेप में स्पिन करें।
17. स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के लिए हाइब्रिड लक्ष्य को बांधें
- 4 घंटे के संकरण ऊष्मायन पूरा होने के बाद, थर्मल साइकिल से नमूनों को हटा दें और थर्मल साइकिलर को गर्म ढक्कन सेट के साथ 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए सेट करें 70 डिग्री सेल्सियस तक।
- मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, नमूनों को पूरी तरह से समरूप मोतियों के 17 माइक्रोन स्थानांतरित करें। 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।
- कार्यक्रम #10(पूरक तालिका 2)के बाद ट्यूबों को थर्मल साइकिलर में रखकर डीएनए को मोतियों में बांध दें। ऊष्मायन के दौरान, संक्षेप में पट्टी ट्यूबों को हर 10-12 टिन और धीरे से भंवर को 3 एस के लिए हटा दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मोती निलंबन में बने रहें। वैकल्पिक रूप से, कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। स्ट्रेपविडिन मोड्स (चरण 18) को धोने के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
18. असीम डीएनए को हटाने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को धोएं
- स्टेप 15.2 से 1x वॉश बफर का उपयोग करें और वॉश के दौरान थर्मल साइकिलर में गर्म बफ़र्स स्टोर करें।
- चरण 17.3 से ट्यूबों में 100 माइक्रोन प्रीहीटेड 1x वॉश बफर 1 जोड़ें। 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं। ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें, जिससे मोतियों को अलौकिक से पूरी तरह से अलग किया जा सके।
- पिपेट और अधिनातक को त्यागदें, जिसमें अनबाउंड डीएनए होता है। चुंबकीय रैक से निकालें।
- निम्नलिखित 65 डिग्री सेल्सियस धोने का प्रदर्शन करें।
- प्रीहीटेड 1x कड़े वॉश बफर के 150 माइक्रोन जोड़ें।
- कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं। पाइपिंग के दौरान बुलबुले से बचें। सुनिश्चित करें कि मोती पूरी तरह से सभी ट्यूबों में फिर से निलंबित कर रहे हैं।
- थर्मल साइकिल में 5 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
- ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें, जिससे मोतियों को अलौकिक से पूरी तरह से अलग किया जा सके। पिपेट और अधिनातक को त्यागदें, जिसमें अनबाउंड डीएनए होता है। चुंबकीय रैक से निकालें।
- दो कड़े वॉश के कुल के लिए चरण 18.4 दोहराएं।
- पहले कमरे के तापमान धोने का प्रदर्शन करें।
- कमरे के तापमान 1x वॉश बफर 1 के 150 माइक्रोन जोड़ें।
- मोतियों को पूरी तरह से फिर से निलंबित करने के लिए 10 से 20 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
- ट्यूबों सील और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट, धीरे 30 एस के लिए भंवर और 30 सेकंड के लिए आराम के बीच बारी । सुनिश्चित करें कि सभी कुओं में मोती पूरे ऊष्मायन में सभी ट्यूबों में पूरी तरह से निलंबित रहते हैं।
- संक्षेप में ट्यूबों को अपकेंद्रित करें।
- ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें, जिससे मोतियों को अलौकिक से पूरी तरह से अलग किया जा सके। पिपेट करें और अधिनेत को त्याग दें।
- ट्यूबों को सील करें और संक्षेप में अपकेंद्री करें। चुंबकीय रैक पर लौटें और किसी भी अवशिष्ट धोने बफर को हटाने के लिए 10 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करें।
- दूसरे कमरे के तापमान धोने का प्रदर्शन करें।
- कमरे के तापमान 1x वॉश बफर 2 के 150 माइक्रोन जोड़ें।
- मोतियों को पूरी तरह से फिर से निलंबित करने के लिए 10 से 20 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
- ट्यूबों सील और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट, धीरे 30 एस के लिए भंवर और 30 सेकंड के लिए आराम के बीच बारी । सुनिश्चित करें कि सभी कुओं में मोती पूरे ऊष्मायन में सभी ट्यूबों में पूरी तरह से निलंबित रहते हैं।
- संक्षेप में ट्यूबों को अपकेंद्रित करें।
- न्यूलीज-फ्री पीसीआर ट्यूबको साफ करने के लिए वॉश बफर 2 में मोतियों की पूरी मात्रा को स्थानांतरित करें। महत्वपूर्ण: मोतियों को ताजा ट्यूबों में स्थानांतरित करना ऑफ-टारगेट संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
- ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें, जिससे मोतियों को अलौकिक से पूरी तरह से अलग किया जा सके। पिपेट करें और अधिनेत को त्याग दें।
- ट्यूबों को सील करें और संक्षेप में अपकेंद्री करें। चुंबकीय रैक पर लौटें और किसी भी अवशिष्ट धोने बफर को हटाने के लिए 10 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करें।
- तीसरे कमरे के तापमान धोने का प्रदर्शन करें।
- कमरे के तापमान 1x वॉश बफर 3 के 150 माइक्रोन जोड़ें।
- मोतियों को पूरी तरह से फिर से निलंबित करने के लिए 10 से 20 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
- ट्यूबों सील और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट, धीरे 30 एस के लिए भंवर और 30 सेकंड के लिए आराम के बीच बारी । सुनिश्चित करें कि सभी कुओं में मोती पूरे ऊष्मायन में सभी ट्यूबों में पूरी तरह से निलंबित रहते हैं।
- संक्षेप में ट्यूबों को अपकेंद्रित करें।
- ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें, जिससे मोतियों को अलौकिक से पूरी तरह से अलग किया जा सके। पिपेट करें और अधिनेत को त्याग दें।
- ट्यूबों को सील करें और संक्षेप में अपकेंद्री करें। चुंबकीय रैक पर लौटें और किसी भी अवशिष्ट धोने बफर को हटाने के लिए 10 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करें।
- चुंबकीय रैक से निकालें और मोती के लिए nuclease मुक्त पानी के 20 μL जोड़ें ।
- ट्यूबों के किनारे पर अटके किसी भी मोतियों को सुनिश्चित करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट को फिर से निलंबित कर दिया गया है।
- महत्वपूर्ण: मोतियों को त्यागें नहीं। चरण 19 में कब्जा कर लिया डीएनए के साथ resuspended मोतियों के पूरे 20 μL का प्रयोग करें ।
19. अंतिम प्रदर्शन, बाद में पीसीआर संवर्धन
- निम्नलिखित तालिका के अनुसार पोस्ट-कैप्चर पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करें, तालिका 15के अनुसार नमूनों की आवश्यक संख्या से गुणा करें और 10% अतिरिक्त जोड़ें।
| पोस्ट-कैप्चर पीसीआर मास्टर मिक्स कंपोनेंट | वॉल्यूम (μL) |
| पोस्ट-कैप्चर पीसीआर मास्टरमिक्स | 25 |
| पोस्ट-कैप्चर पीसीआर प्राइमर मिक्स | 1.25 |
| न्यूक्लीज-मुक्त पानी | 3.75 |
| कुल मात्रा | 30 |
टेबल 15: चौकी कैप्चर पीसीआर मास्टर मिक्स। पोस्ट-कैप्चर पीसीआर मास्टर मिक्स के घटकों को दिखाए गए वॉल्यूम के अनुसार बर्फ पर इकट्ठा और मिश्रित किया जाना चाहिए।
- 50 माइक्रोन की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा के लिए प्रत्येक नमूने में पोस्ट-कैप्चर पीसीआर मास्टर मिक्स के 30 माइक्रोन जोड़ें। 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।
- पीसीआर ट्यूबों को थर्मल साइकिलर में रखें और प्रोग्राम #11(पूरक तालिका 2)के बाद इनक्यूबेट करें।
20. पीसीआर के टुकड़ों को पकड़ने के बाद शुद्ध करें
- एसपीआईआई मोतियों को उपयोग से पहले कम से कम 30 न्यूनतम कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति दें, और फिर लगभग 30 एस के लिए भंवर SPRI मोती को फिर से निलंबित करने के लिए।
- प्रत्येक पीसीआर-समृद्ध कैप्चर (50 माइक्रोन) में पुनर्निलंबित मोतियों के 75 माइक्रोन जोड़ें। कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं। स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों से एसपीआरआई मनका शुद्धिकरण में हस्तक्षेप नहीं होगा। कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
- संक्षेप में ट्यूबों को माइक्रोसेंटिफ्यूज में स्पिन करें और ट्यूबों को एक चुंबकीय रैक पर रखें ताकि अलौकिक से मोतियों को अलग किया जा सके। समाधान स्पष्ट होने के बाद, ध्यान से हटा दें और अधिष्णकतियों को त्याग दें। सावधान रहें कि मोतियों को परेशान न करें, जिनमें डीएनए हो।
- चुंबकीय रैक में रहते हुए ट्यूब में ताजा तैयार 80% इथेनॉल के 180 μL जोड़ें। 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट, और फिर ध्यान से हटाने और supernatant त्यागें ।
- कुल 2 वाशिंग चरणों के लिए एक बार चरण 20.4 दोहराएं।
- अवशिष्ट इथेनॉल को पूरी तरह से हटा दें। चुंबकीय रैक पर ट्यूब छोड़ दें और ढक्कन खुले के साथ हवा सूखी 3 मिन, या दिख सूखी जब तक । मोतियों को ज्यादा सुखाएं नहीं। इसके परिणामस्वरूप डीएनए की वसूली कम हो सकती है।
- चुंबक से ट्यूब निकालें। 0.1x TE बफर के 22 माइक्रोन जोड़कर मोतियों से डीएनए को एल्यूट करें। कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं। कमरे के तापमान पर 2 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट। ट्यूब को चुंबकीय रैक पर तब तक रखें जब तक कि समाधान स्पष्ट न हो जाए।
- सुपरनेटेंट के 20 माइक्रोन निकालें और एक साफ nuclease मुक्त पीसीआर ट्यूब के लिए स्थानांतरित करने के लिए सावधान किया जा रहा है मोती परेशान नहीं है । यह प्रोटोकॉल में एक वैकल्पिक रोक बिंदु है, पुस्तकालयों -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
21. लाइब्रेरी को मान्य और मात्रात्मक
- फ्लोरोमीटर और उच्च संवेदनशीलता परख किट का उपयोग करके कैप्चर किए गए पुस्तकालय की एकाग्रता को मापें।
- डिजिटल इलेक्ट्रोफोरेसिस हाई सेंसिटिविटी डीएनए चिप का उपयोग करके कैप्चर किए गए पुस्तकालय की औसत खंड लंबाई को मापें और सिस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक पुस्तकालय के लिए औसत टुकड़ा आकार की गणना करें। औसत टुकड़ा आकार लगभग 250-400 बीपी होना चाहिए (प्रतिनिधि परिणाम, चित्र6 और चित्रा 7देखें) । यह प्रोटोकॉल में एक वैकल्पिक रोक बिंदु है, पूर्ण पुस्तकालयों -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
22. एक अनुक्रमण मंच पर अनुक्रमण
- अनुक्रमण के लिए, पुस्तकालयों को 2 एनएम में पतला करें और अनुक्रमक को लोड करने और संचालित करने के लिए निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करें। १५,०००,००० एकल अंत की एक ंयूनतम गहराई के लिए अनुक्रम पुस्तकालयों लंबाई में कम से ५० बीपी के पढ़ता है ।
23. इम्यून प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण और चश्मे पोर्टल के साथ बायोमार्कर की खोज, एक क्लाउड-आधारित सूचना उपकरण
- https://prism.cofactorgenomics.com/ पर जाकर चश्मे का हिसाब बनाएं
- एक बार लॉग इन करने के बाद, अपमल्टीप्लेक्स्ड FASTQ अनुक्रमण फ़ाइलों को अपलोड करने, या चश्मे खाते के साथ बेसस्पेस पर संग्रहीत फ़ाइलों को अपलोड करने के लिए चश्मे के किसी भी पृष्ठ से शीर्ष टूलबार में नई परियोजना सबमिट करें।
- परियोजना का नाम, और समूह या पलटन द्वारा नमूने सहित नए परियोजना के रूप को पूरा करें। बायोमार्कर डिस्कवरी रिपोर्ट उत्पन्न करने के लिए नमूनों का समूह, और इसी समूह के नाम आवश्यक हैं। ध्यान दें कि बायोमार्कर डिस्कवरी रिपोर्ट जेनरेट करने के लिए प्रति ग्रुप कम से कम 3 नमूनों की आवश्यकता होती है। फॉर्म सबमिट करने के लिए लॉन्च एप्लीकेशन बटन पर क्लिक करें; सफल होने पर एक पुष्टिपृष्ठ दिखाई देगा।
- लॉग इन करते समय, क्लिक करें शीर्ष टूलबार या चश्मे के किसी भी पृष्ठ में परिणाम देखें। चश्मे एक उपयोगकर्ता को प्रस्तुत परियोजनाओं की स्थिति देखने और प्रति परियोजना नमूना और बायोमार्कर रिपोर्ट देखने में सक्षम बनाता है। प्रिज्म पर उपयोगकर्ता द्वारा बनाए गए प्रोजेक्ट्स की एक टेबल होगी। तालिका में स्थिति, नाम और जमा करने की तिथि के लिए तीन कॉलम हैं।
नोट: प्रत्येक परियोजना की स्थिति हो सकती है:
• "रनिंग", जहां परियोजना विश्लेषण वर्तमान में चल रहा है, या,
• "सफलता", जहां परियोजना विश्लेषण पूरा हो गया है और रिपोर्ट उपलब्ध हैं। - यदि किसी परियोजना ने विश्लेषण समाप्त कर दिया है ("सफलता" स्थिति द्वारा इंगित किया गया है, तो व्यक्तिगत नमूना रिपोर्ट और बायोमार्कर डिस्कवरी रिपोर्ट देखें। ध्यान दें कि बायोमार्कर डिस्कवरी रिपोर्ट तभी उपलब्ध होगी जब परियोजना में प्रति समूह तीन नमूनों की आवश्यक न्यूनतम शामिल हो ।
- इन रिपोर्टों तक पहुंचने के लिए, परियोजनाओं की मेज पर लौटें और परियोजना के नाम पर क्लिक करें। इस परियोजना पृष्ठ पर, परियोजना में प्रत्येक नमूने के लिए एक पंक्ति के साथ एक टेबल होगा। प्रत्येक नमूने की व्यक्तिगत रिपोर्ट तक पहुंचने के लिए रिपोर्ट कॉलम के तहत प्रत्येक पंक्ति में लिंक पर क्लिक करें। तालिका के तुरंत नीचे, बायोमार्कर डिस्कवरी रिपोर्ट के लिंक पर क्लिक करें। यदि कोई लिंक इस पृष्ठ में नहीं है, तो आपकी परियोजना ने विश्लेषण पूरा नहीं किया है।
Representative Results
पूरे प्रोटोकॉल में कई चौकियां हैं जो उपयोगकर्ता को उत्पन्न सामग्रियों की गुणवत्ता और मात्रा का मूल्यांकन करने में सक्षम बनाती हैं। प्रोटोकॉल में वर्णित चरण 12 के बाद, एक इलेक्ट्रोहीरोग्राम उत्पन्न होता है जैसा कि चित्रा 3में दिखाया गया है, एक अक्षुण्ण आरएनए नमूने (आरआईनए = 7.8) के लिए एक विशिष्ट पूर्व-कैप्चर लाइब्रेरी का प्रतिनिधि।
चित्रा 3: एक बरकरार आरएनए नमूने के लिए विशिष्ट प्री-कैप्चर लाइब्रेरी बायोएनालाइजर ट्रेस। पूर्व कब्जा पुस्तकालयों आकार में 250-400 आधार जोड़े (बीपी) के आसपास एक व्यापक चोटी के रूप में दिखाई देते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अतिप्रीकरण से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, जैसा कि चित्र4में दिखाए गए 1,000 बीपी के आसपास दूसरी चोटी द्वारा इंगित किया गया है, एफएफपीई आरएनए नमूने (डीवी200 = 46) से उत्पन्न प्री-कैप्चर लाइब्रेरी का एक प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफेरोग्राम। यदि यह चोटी मुख्य चोटी (लगभग 250-400 आधार जोड़े (बीपी) के सापेक्ष छोटी है, जैसा कि दिखाया गया है), तो यह डाउनस्ट्रीम चरणों या विश्लेषण में हस्तक्षेप नहीं करेगा। यदि दूसरी चोटी 250-400 बीपी पीक के सापेक्ष बड़ी है, तो ओवरप्रेशन को कम करने के लिए प्री-कैप्चर लाइब्रेरी को कम पीसीआर चक्रों के साथ रीमेक किया जा सकता है।
चित्रा 4: एफएफपीई आरएनए नमूने के लिए विशिष्ट प्री-कैप्चर लाइब्रेरी बायोएनालाइजर ट्रेस। 1,000 बीपी के आसपास दूसरी चोटी अधिक प्रवर्धन का संकेत है। यदि यह चोटी 250-400 बीपी (जैसा कि दिखाया गया है) के आसपास मुख्य चोटी के सापेक्ष छोटी है, तो यह डाउनस्ट्रीम चरणों या विश्लेषण में हस्तक्षेप नहीं करेगा। यदि दूसरी चोटी 250-400 बीपी पीक के सापेक्ष बड़ी है, तो ओवर-प्रवर्धन को कम करने के लिए प्री-कैप्चर लाइब्रेरी को कम पीसीआर चक्रों के साथ रीमेक किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
जैसा कि स्टेप 12.1.3 में वर्णित है, एडाप्टर डिमर्स की उपस्थिति का मूल्यांकन यह निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए कि अतिरिक्त सफाई आवश्यक है या नहीं। चित्रा 5 में दिखाए गए इलेक्ट्रोफ्लोग्राम अस्वीकार्य(चित्रा 5ए,डीवी200 = 33) और स्वीकार्य(चित्रा 5बी,डीवी200 = 46) एडाप्टर डिमर के स्तर के प्रतिनिधि हैं, जो 128 बीपी के आसपास तेज चोटी के रूप में दिखाई देरहे हैं।
चित्रा 5: प्री-कैप्चर लाइब्रेरी बायोएनालाइजर निशान। एडाप्टर डिमर 128 बीपी के आसपास एक तेज चोटी के रूप में दिखाता है।(ए)अत्यधिक एडाप्टर डिमर इस इलेक्ट्रोप्रोग्राम में मौजूद हैं। (ख)इस ट्रेस में स्वीकार्य एडाप्टर डिमर स्तर ों को दर्शाया गया है। दोनों निशान हल्के अधिक प्रवर्धन के सबूत दिखाते हैं, लेकिन यह इम्यूनोप्रिम परख के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
प्रोटोकॉल के पूरा होने पर, अनुक्रमण से पहले, अंतिम पुस्तकालयों को फिर से डिजिटल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है। FFPE आरएनए से बने पुस्तकालयों को बरकरार आरएनए से बने पुस्तकालयों की तुलना में एक छोटे औसत आकार वितरण के लिए करते हैं । बरकरार आरएनए नमूनों के लिए, जिसके परिणामस्वरूप ट्रेस चित्रा 6 (RIN = 9.5) के समान दिखना चाहिए। अपमानित या एफएफपीई आरएनए के लिए, जिसके परिणामस्वरूप ट्रेस को चित्रा 7 (डीवी200 = 36) के समान दिखना चाहिए।
चित्रा 6: एक बरकरार आरएनए नमूने के लिए विशिष्ट अंतिम पुस्तकालय बायोएनालाइजर ट्रेस। अंतिम पुस्तकालयों आकार में 250-400 आधार जोड़े (बीपी) के आसपास एक व्यापक चोटी के रूप में दिखाई देते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7: एफएफपीई आरएनए नमूने के लिए विशिष्ट अंतिम लाइब्रेरी बायोएनालाइजर ट्रेस। FFPE आरएनए से बने पुस्तकालयों को बरकरार आरएनए से बने पुस्तकालयों की तुलना में एक छोटे औसत आकार वितरण के लिए करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
जैसा कि वर्णित है, इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न परिणामों को दो प्रमुख तरीकों से लागू किया जा सकता है, जैसा कि चित्र8में दिखाया गया है।
चित्रा 8: प्रोटोकॉल के दो मामलों का उपयोग करें। इस प्रतिरक्षा प्रोफाइलिंग परख से उत्पन्न परिणाम दो प्रमुख अनुवाद अनुप्रयोगों में लागू होते हैं। (क)पहला उपयोग मामला मानव ठोस ट्यूमर ऊतक (एफएफपीई अभिलेखागार सहित) से शुरू होता है और नमूने के लिए एक व्यक्तिगत प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल उत्पन्न करता है। (ख)एक बार मानव नमूनों की पलटन के लिए उत्पन्न होने के बाद, डेटा को बहुआयामी बायोमार्कर और इसी बायोमार्कर रिपोर्ट उत्पन्न करने के लिए चश्मे पोर्टल का उपयोग करके संयुक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
इन उपयोग मामलों में से प्रत्येक को प्रदर्शित करने के लिए, एक छोटे से अनुवाद अध्ययन से प्रतिनिधि डेटा21शामिल है । इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए नमूनों में 7 रोगियों के नमूनों का एक सेट है और गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) के लिए इलाज किया जाता है । नमूने पूर्व और पोस्ट उपचार बायोप्सी से रोगी मिलान ठोस ट्यूमर ऊतक हैं । सबसे पहले, एक प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल उत्पन्न करने के लिए व्यक्तिगत नमूनों का विश्लेषण किया गया था, जैसे कि चित्र9में दिखाई गई उदाहरण रिपोर्ट।
चित्रा 9: एनएससीएलसी नमूने के लिए उदाहरण व्यक्तिगत प्रतिरक्षा रिपोर्ट। चश्मे पोर्टल पाइपलाइन प्रत्येक नमूने के लिए एक ग्राफिकल रिपोर्ट उत्पन्न करती है, जिसमें एनएससीएलसी ठोस ट्यूमर नमूने के लिए उत्पन्न एक प्रतिनिधि रिपोर्ट यहां दिखाई जाती है। (A)रिपोर्ट के सामने की ओर रेखांकन एफएफपीई ऊतक से निकाले गए आरएनए नमूने में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं के टूटने को दर्शाया गया है । (ख)रिपोर्ट के रिवर्स साइड में प्रतिरक्षा कोशिकाओं (निरपेक्ष प्रतिशत में) की एक तालिका और जीन अभिव्यक्ति (प्रति मिलियन या टीपीएम में) से बचने के साथ-साथ परख के लिए प्रदर्शन का विवरण भी शामिल है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
प्रतिरक्षा प्रोफाइल पूर्व और उपचार के बाद समझने के लिए कैसे एक चिकित्सा (कीमोथेरेपी या विकिरण, इस अध्ययन में) ट्यूमर माइक्रोवातावरण संशोधित किया गया है इस्तेमाल किया जा सकता है । एक उदाहरण चित्रा 10में दिखाया गया है, जहां प्रत्येक प्रतिरक्षा कोशिका और कुल प्रतिरक्षा सामग्री के लिए प्रतिशत में परिवर्तन एक ही रोगी के लिए पूर्व और पोस्ट कीमोथेरेपी दिखाया जाता है ।
चित्रा 10: उदाहरण पूर्व और पोस्ट उपचार परिणाम। एक ही एनएससीएलसी रोगी से पूर्व और उपचार के बाद के नमूनों से उत्पन्न व्यक्तिगत प्रतिरक्षा कोशिका और कुल प्रतिरक्षा सामग्री डेटा दिखाया गया है। इस उदाहरण में, रोगी को उपचार के रूप में कीमोथेरेपी आहार प्राप्त हुआ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
रोगियों को तुलना के लिए नैदानिक परिणामों या फेनोटाइप जैसे मानदंडों द्वारा समूहीकृत किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 11में, एनएससीएलसी अध्ययन में नमूनों की तुलना उपचार के बाद रोग प्रगति के समय के अनुसार की गई थी । रोगियों के एक सबसेट ने 18 महीनों में रोग की पुनरावृत्ति दिखाई, और एक अन्य सबसेट ने 18 महीनों में तेजी से प्रगति की। रोग प्रगति के ख्यात बायोमार्कर की पहचान करने के लिए प्रत्येक नमूने की तुलना औसत डेल्टा मूल्य (पूर्व और उपचार के बाद मूल्यों के बीच अंतर) की तुलना की जाती है।
चित्रा 11: उदाहरण नैदानिक परिणाम तुलना। मिलान पूर्व और उपचार के बाद NSCLC नमूनों में प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिशत के बीच मात्रात्मक परिवर्तन की गणना की गई और "डेल्टा" मूल्य के रूप में रिपोर्ट की गई । पीले रंग में प्रकाश डाला उन अस्तित्व की स्थिति के बीच स्पष्ट संकेत परिवर्तन दिखाओ । ब्लू बार रोग प्रगति तक और 18 महीनों के लिए औसत डेल्टा मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं, नारंगी सलाखों रोग प्रगति तक 18 महीनों के लिए औसत डेल्टा मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अंत में, इसी तरह के नमूना समूहों का उपयोग विशेष रूप से प्री-ट्रीटमेंट नमूनों को देखने के लिए किया जा सकता है ताकि बायोमार्कर रिपोर्ट उत्पन्न करने के लिए चश्मे पोर्टल का उपयोग करके भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की पहचान की जा सके। चित्रा 12में दिखाया गया है, वही नैदानिक फेनोटाइप (रोग प्रगति) जैसा कि ऊपर वर्णित नमूना समूहों को परिभाषित करता है। इस उदाहरण में, दो प्रतिरक्षा एस्केप जीन को नमूना समूहों (सीडी47 और OX40, चित्रा 12एके निचले पैनल में दिखाए गए) के सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर के रूप में पहचाना गया था। इस उदाहरण में, क्योंकि व्यक्तिगत जीन बायोमार्कर स्पष्ट सांख्यिकीय महत्व के साथ मजबूत हैं, बहुआयामी बायोमार्कर महत्वपूर्ण भविष्य कहनेवाला मूल्य (इम्यूनोप्रिमिज्म, जैसा कि चित्र1 2बीके शीर्ष सही बार चार्ट में लेबल) नहीं जोड़ता है। परख के लिए सभी 18 विश्लेषणों के परिणामों सहित डेटा की पूरी तालिका, सांख्यिकीय विश्लेषण और एक संक्षिप्त तरीकों सारांश सहित रिपोर्ट के रिवर्स साइड पर संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है ।
चित्रा 12: एनएससीएलसी नमूनों के लिए उदाहरण बायोमार्कर रिपोर्ट। बायोमार्कर डिस्कवरी पाइपलाइन विस्तृत आंकड़ों के साथ व्यक्तिगत बायोमार्कर की एक दृश्य रिपोर्ट और एक मशीन-लर्निंग बहुआयामी बायोमार्कर प्रदान करती है। (क)इस अध्ययन के लिए, पाइपलाइन ने 18 महीने की दहलीज के साथ रोग प्रगति को परिभाषित करने के लिए सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण के रूप में दो व्यक्तिगत बायोमार्कर (सीडी47 और OX40) की पहचान की । (ख)विधि और पूर्ण परिणामों के बारे में विवरण रिपोर्ट के रिवर्स साइड पर शामिल हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक तालिका 1: पुनः एजेंट किट सामग्री। इम्यूनोप्रििज्म किट में प्रदान की गई सामग्रियों की एक सूची सूचीबद्ध है, साथ ही निर्माता के प्रोटोकॉल में संदर्भित भाग संख्याओं के साथ। आवश्यक अन्य सभी उपकरण और सामग्री सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं। सुरक्षा डेटा शीट (एसडीएस) के लिए https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/ पर जाएं। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।
पूरक तालिका 2: थर्मल साइकिलर कार्यक्रम। प्रोटोकॉल भर में संदर्भित अनुशंसित साइकिल कार्यक्रम प्रोग्रामिंग में आसानी के लिए संक्षेप में दिए गए हैं। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।
पूरक तालिका 3: अनुक्रमण सूचकांक गाइड। रिएजेंट किट में प्रदान किए गए इंडेक्स प्राइमर्स सूचीबद्ध हैं; पोस्ट-अनुक्रमण डिमल्टीप्लेक्सिंग के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया में एक अद्वितीय प्राइमर जोड़ा जाता है। अनुशंसित निम्न स्तर के मल्टीप्लेक्सिंग संयोजन भी प्रदान किए जाते हैं। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।
Discussion
प्रोटोकॉल के लिए 20 एनजी बरकरार या 40 एनजी अत्यधिक अपमानित (एफएफपीई) आरएनए की आवश्यकता होती है। आरएनए नमूना डीएनए, लवण (जैसे, एमजी2 +,या ग्वानिडिनियम लवण), डाइवेलेंट सेशन चेलेटिंग एजेंट (जैसे, ईटीए, ईटीए, साइट्रेट), या ऑर्गेनिक्स (जैसे, फिनॉल और इथेनॉल) से मुक्त होना चाहिए। आरएनए नमूनों के साथ आगे बढ़ने की सिफारिश नहीं की जाती है जिसमें डीवी200 और एलटी; 20% है। इन-किट नियंत्रण आरएनए के उपयोग की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है क्योंकि ये नियंत्रण पुस्तकालय की तैयारी से विश्लेषण तक पूरे प्रोटोकॉल में प्रदर्शन का मूल्यांकन करने का साधन प्रदान करते हैं।
प्रोटोकॉल 0.2 mL पीसीआर पट्टी ट्यूबों का उपयोग कर प्रदर्शन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यदि पसंद किया जाता है, तो प्रोटोकॉल को 96-अच्छी पीसीआर प्लेट में कुओं का उपयोग करके भी किया जा सकता है। बस पीसीआर ट्यूब या स्ट्रिप ट्यूब के सभी संदर्भों के स्थान पर 96-कूप पीसीआर प्लेट के कुओं का उपयोग करें। केवल स्पष्ट कुओं के साथ पीसीआर प्लेटों का उपयोग करें, क्योंकि मनका शुद्धिकरण और धोने के चरणों के दौरान मोतियों के पूर्ण पुनर्निलंबन की पुष्टि करना नेत्रहीन रूप से महत्वपूर्ण है।
प्रोटोकॉल के दौरान, अभिकर्मकों को जमे हुए या बर्फ पर रखें जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो। जब तक वे पूरी तरह से गल न जाएं तब तक अभिकर्मकों का उपयोग न करें। उपयोग से पहले सभी अभिकर्मकों को अच्छी तरह से मिलाना सुनिश्चित करें।
एंजाइमों को उपयोग करने के लिए तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें और उपयोग के तुरंत बाद -20 डिग्री सेल्सियस पर लौटें। केवल आणविक ग्रेड nuclease मुक्त पानी का उपयोग करें; डीपीसी-उपचारित पानी का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है। मिश्रण करने के लिए पाइपिंग करते समय, समाधान अच्छी तरह से मिश्रित होने तक कुल मात्रा का कम से कम 50% धीरे-धीरे एस्पिरेट और वितरित करें। पिपेट एंजाइमों युक्त सभी मास्टर घोला जा सकता है मिश्रण। एंजाइमों को मिलाने के लिए भंवर का उपयोग करने से इनकार हो सकता है और उनके प्रदर्शन से समझौता हो सकता है। मनका शुद्धिकरण के दौरान, आणविक ग्रेड इथेनॉल से हौसले से बने 80% इथेनॉल समाधानों का उपयोग करें। इथेनॉल समाधानों का उपयोग करना जो ताजा नहीं हैं, उनके परिणामस्वरूप कम पैदावार हो सकती है। मोतियों को सुखाने से बचें, क्योंकि यह एल्यूशन दक्षता को कम कर सकता है (मोतियों को सूखे होने पर फटा हुआ दिखता है)।
जैसा कि चरण 10 में वर्णित है, प्रत्येक प्रतिक्रिया में अद्वितीय इंडेक्स प्राइमर जोड़े जाते हैं। इन सूचकांकों के दृश्यों के आधार पर, निम्न स्तर के मल्टीप्लेक्सिंग के लिए, कुछ सूचकांक संयोजन इष्टतम हैं। इन सूचकांकों के दृश्यों के लिए डेटा पोस्ट अनुक्रमण को डिमल्टीप्लेक्स करने की आवश्यकता होती है। अनुक्रम और अनुशंसित मल्टीप्लेक्सिंग संयोजन पूरक तालिका 3में प्रदान किए जाते हैं । इस एक ही चरण में, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि अनुशंसित पीसीआर चक्रों की संख्या उपयोग की गई आरएनए की गुणवत्ता के आधार पर भिन्न होती है, और पीसीआर ओवर-प्रवर्धन को रोकने के लिए कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इम्यूनोप्रििज्म अक्षुण्ण नियंत्रण आरएनए और अन्य उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए के लिए, 10 पीसीआर चक्रों के साथ अनुकूलन शुरू करें। इम्यूनोप्रििज्म एफएफपीई कंट्रोल आरएनए और अन्य अत्यधिक अपमानित/एफएफपीई आरएनए के लिए, 15 पीसीआर चक्रों के साथ अनुकूलन शुरू करें । पीसीआर चक्रों को अनुकूलित करने के लिए विश्लेषण की जाने वाली सामग्री के आरएनए प्रतिनिधि का उपयोग करके एक परीक्षण पुस्तकालय का उत्पादन करने की सिफारिश की जाती है। पीसीआर चक्रों की न्यूनतम संख्या का उपयोग किया जाना चाहिए जो लगातार पर्याप्त प्री-कैप्चर लाइब्रेरी पैदावार (>200 एनजी) प्राप्त करते हैं। बायोएनालाइजर ट्रेस पर 1000 बीपी के आसपास एक माध्यमिक चोटी अधिक प्रवर्धन(चित्रा 4)का संकेत है। अधिक प्रवर्धन को कम किया जाना चाहिए, लेकिन एक छोटे से माध्यमिक चोटी की उपस्थिति परख के परिणामों में हस्तक्षेप नहीं करेगी।
नमूना हानि को कम करने और ट्यूब स्विचकरने से बचने के लिए, यदि आपका वैक्यूम सांद्रता की अनुमति देता है, तो चरण 13 पीसीआर ट्यूबों, स्ट्रिप ट्यूबों, या 1.5 मीटर माइक्रोट्यूब के बजाय 96-अच्छी पीसीआर प्लेट में किया जा सकता है। रोटर को कई अकेन्द्रों पर हटाया जा सकता है। यह स्ट्रिप ट्यूब या प्लेटों को वैक्यूम में फिट करने में सक्षम बनाता है। वैक्यूम एकाग्रता तो कोई केंद्रीकरण के साथ जलीय desiccation सेटिंग का उपयोग कर चलाया जा सकता है । निर्देशों के लिए अपने वैक्यूम केंद्रित करने के लिए मैनुअल से परामर्श करें। यदि नमूनों को पट्टी ट्यूब या 96-अच्छी प्लेट में सूख दिया जाता है, तो संकरण चरण को एक ही पोत में किया जा सकता है।
चरण 17 के दौरान, बीड कैप्चर दक्षता बढ़ाने के लिए हर 10-12 न्यूनतम भंवर सुनिश्चित करें। ट्यूब खोलने से रोकने के लिए मिश्रण करते समय गर्म पट्टी ट्यूबों की टोपियां सावधानी से पकड़ें।
चरण 18 में वर्णित वॉश उच्च गैर-विशिष्ट संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं और इसका बारीकी से पालन किया जाना चाहिए। प्रत्येक धोने पर मोतियों को पूरी तरह से फिर से निलंबित करना सुनिश्चित करें, वॉश बफर को पूरी तरह से हटा दें, और वॉश बफर 2 वॉश के दौरान, नमूनों को एक ताजा पट्टी ट्यूब (चरण 18.6.5) में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को पूरी तरह से निलंबित कर दिया गया है और पूरे ऊष्मायन के दौरान निलंबन में बने रहें। ट्यूब कैप पर छिड़काव से कैप्चर पर नकारात्मक प्रभाव नहीं पड़ेगा। कमरे के तापमान धोता के दौरान, एक माइक्रोप्लेट भंवर मिक्सर आसान पुनर्निलंबन के लिए दो मिनट के ऊष्मायन अवधि की संपूर्णता के लिए नमूनों भंवर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को सूखने न दें। यदि आवश्यक हो, तो मोतियों को सुखाने से बचने के लिए बफ़र्स में ऊष्मायन का विस्तार करें। यदि एक से अधिक स्ट्रिप ट्यूब का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रत्येक धोने के लिए एक समय में एक पट्टी ट्यूब के साथ काम करते हैं जबकि अन्य पट्टी ट्यूब थर्मोसाइकिलर में बैठते हैं। यह मोतियों को सुखाने या भागने से बचने में मदद कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप खराब पुनर्सस्पेंशन या अन्य उप-इष्टतम तकनीकें होती हैं। पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए, एक समय में 8 से अधिक पुस्तकालय प्रतिक्रियाओं को संसाधित करने की सिफारिश नहीं की जाती है।
वर्तमान प्रतिरक्षा प्रोफाइलिंग तकनीक जानकारी का सातत्य प्रदान करती है - हजारों डेटा बिंदुओं से जिसमें किसी व्यक्ति, असतत डेटा पॉइंट (एकल-प्लेक्स आईएचसी) को महत्वपूर्ण व्याख्या (आरएनए अनुक्रमण) की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है जो बीच में कहीं है, एक केंद्रित गुंजाइश के साथ उच्च संवेदनशीलता को सक्षम करता है, लेकिन चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा के केवल एक सबसेट पर कब्जा करता है। थोक आरएनए निष्कर्षण की प्रकृति के कारण, यह प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा कोशिकाओं और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के बीच स्थानिक संबंधों के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है, हालांकि, इस जानकारी को जोड़ने के लिए परिणाम इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के साथ पूरित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न डेटा के लिए असंख्य अनुप्रयोग हैं, क्योंकि कैंसर के जीव विज्ञान के बारे में एक बीमारी के रूप में बहुत कुछ सीखा जाना है, और इसके इलाज के लिए विकसित किए जा रहे उपचार। जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, व्यक्तिगत प्रतिरक्षा रिपोर्ट यह समझने के लिए उपयोगी है कि रोग प्रगति या उपचार जैसी घटनाओं के जवाब में रोगी की प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल कैसे बदल सकती है। जबकि यहां प्रस्तुत परिणाम कुछ उदाहरण का उपयोग मामलों प्रदान करते हैं, एक चिकित्सा की कार्रवाई के तंत्र की जांच और इस तरह के प्रगति मुक्त और समग्र अस्तित्व के रूप में नैदानिक परिणामों के ख्यात बायोमार्कर की पहचान सहित अंय अनुप्रयोगों भी कर रहे है व्यावहारिक. बायोमार्कर खोज अनुप्रयोगों के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, यह सुनिश्चित करने के लिए अच्छे अध्ययन डिजाइन का अभ्यास करना महत्वपूर्ण है कि समरूप आबादी का विश्लेषण किया जाए, सांख्यिकीय शक्ति के लिए पर्याप्त नमूने शामिल किए जाते हैं, और पूर्वाग्रह के स्रोतों पर विचार किया जाता है। परख की केंद्रित, सुव्यवस्थित प्रकृति के कारण, एक बार खोजे जाने के बाद इन बायोमार्कर के नैदानिक सत्यापन और डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन की दिशा में एक मार्ग की कल्पना करना संभव है।
Disclosures
सभी लेखकों को कोफैक्टर जीनोमिक्स, इंक द्वारा नियोजित किया जाता है, जो कंपनी विकसित होती है और इस लेख में उपयोग किए जाने वाले इम्यूनोप्रिज़्म रिएजेंट किट और सूचना उपकरणों का उत्पादन करती है। इम्यूनोप्रिज़्म परख केवल अनुसंधान उपयोग के लिए है, और नैदानिक प्रक्रियाओं में उपयोग के लिए नहीं है।
Acknowledgments
लेखक प्रतिनिधि परिणामों के लिए जैविक नमूने प्रदान करने के लिए ट्राइस्टार प्रौद्योगिकी समूह को स्वीकार करना चाहते हैं, साथ ही साथ अपनी तकनीकी विशेषज्ञता के लिए कोफैक्टर जीनोमिक्स में पूरे आणविक, विश्लेषण, उत्पाद और वाणिज्यिक टीमों और समर्थन.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR 8 tube strip | USA Scientific | 1402-2700 | USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip |
| 200 Proof Ethanol | MilliporeSigma | EX0276-1 | Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment |
| 96-well thermal cyclers | BioRad | 1861096 | |
| Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads | Beckman-Coulter | A63882 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification beads |
| Digital electrophoresis chips and kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Agilent High Sensitivity DNA chips and kit |
| Digital electrophoresis system | Agilent Technologies | G2939AA | Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer |
| Streptavidin Beads | ThermoFisher Scientific | 65306 | Dynabeads M-270 Streptavidin |
| ImmunoPrism Kit – 24 reaction | Cofactor Genomics | CFGK-302 | Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit – 24 reactions |
| Human Cot-1 DNA | ThermoFisher Scientific | 15279011 | Invitrogen brand |
| Magnetic separation rack | Alpaqua/Invitrogen | A001322/12331D | 96-well Magnetic Ring Stand |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22620701 | |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2600 | USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube |
| NextSeq550 | Illumina | SY-415-1002 | Any Illumina sequencer may be used for this protocol |
| Nuclease-free water | ThermoFisher Scientific | AM9937 | |
| Prism Extraction Kit | Cofactor Genomics | CFGK-401 | Cofactor Prism FFPE Extraction Kit – 24 samples |
| Purified RNA | - | - | Purified from human tissue samples |
| Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | Qubit 4 System |
| Fluorometric Assay Tubes | Axygen | PCR-05-C | 0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps |
| High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit | Life Technologies | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| Vacuum concentrator | Eppendorf | 22820001 | VacufugePlus |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| Water bath or heating block | VWR/USA Scientific | NA/2510-1102 | VWR water bath/USA Scientific heating block |
References
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