Summary
Использование РНК-подхода для определения количественных иммунных профилей твердых опухолевых тканей и использования клинических когорт для открытия биомаркеров иммунной онкологии описывается с помощью молекулярных и информационных протоколов.
Abstract
Иммунотерапия показывает перспективность в лечении онкологических больных, но сложная неоднородность микроокружения опухоли делает прогнозирование ответна на лечение сложной задачей. Способность решать относительные популяции иммунных клеток, присутствующих в опухолевой ткани и вокруг нее, как было показано, клинически-отречена к пониманию реакции, но ограничена традиционными методами, такими как цитометрия потока и иммуногистохимия ( IHC), из-за большого количества ткани требуется, отсутствие точных маркеров типа клеток, и многие технические и материально-технические препятствия. Один анализ (например, иммуноприризм иммунопрофилирования Анализ) преодолевает эти проблемы путем размещения как небольшое количество РНК и сильно деградировали РНК, общие черты РНК, извлеченные из клинически архивированных твердой ткани опухоли. Анализ доступен через набор реагентов и облачную информатику, которая обеспечивает сквозное количественное, высокое разрешение иммуно-профилирования для платформ секвенирования Illumina. Исследователи начинают с всего лишь двух разделов формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE) ткани или 20-40 нг общего РНК (в зависимости от качества образца), и протокол генерирует иммунный профиль доклад количественно восемь типов иммунных клеток и десять иммунных побега генов, захватывая полное представление о микроокружении опухоли. Для использования полученных данных не требуется никакого дополнительного биоинформатического анализа. При наличии соответствующих выборочных когорт протокол может также использоваться для определения статистически значимых биомаркеров в группе пациентов, представляющих интерес.
Introduction
Количественная оценка опухолевых лимфоцитов (TILs) и других молекул, связанных с иммунитетом, в формалино-фиксированных и парафинвстроенных (FFPE) твердых образцов опухоли человеческой ткани продемонстрировала ценность в клинических исследованиях1,2,3. Общие методы, такие как поток цитометрии и одноклеточных рибонуклеиновой кислоты (РНК) секвенирования полезны для свежей ткани и крови4, но не подходят для анализа материалов FFPE из-за невозможности создать жизнеспособные суспензии клеток. Современные методы, которые были использованы для количественной оценки этих клеток в ткани FFPE страдают от серьезных проблем. Иммуногистохимия (IHC) и другие подобные рабочие процессы изображений требуют специфических антител для обнаружения белков поверхности клеток, которые могут быть трудно стандартизировать в лабораториях, чтобы воспроизводимая количественная количественная оценка5. Такие платформы, как система nCounter, полагаются на экспрессию отдельных генов для определения ключевых иммунных клеток6,ограничивая чувствительность и специфичность обнаружения. Более общие методы секвенирования РНК, в сочетании с автономными программными средствами, доступны, но требуют значительной оптимизации и проверки до использования7,8,9,10,11,12. Последние достижения в сочетании микродиссекции лазерного захвата (LCM) с РНК секвенирования для ткани FFPE показал обещание; однако, более высокой пропускной, под ключ решение требуется для трансляционных исследований, направленных на выявление надежных биомаркеров13,14. Методы генерации многомерных биомаркеров, таких как прогностическое иммуномоделирование, которые определяют когорты пациентов, включая терапевтические ответчики, подтипы рака или результаты выживания с высокой прогностической точностью и статистической значимостью, становятся все более важными в эпоху точной медицины и иммунотерапии15,16.
Для удовлетворения этой потребности, иммунный профилирования анализ был разработан для обеспечения чувствительной и конкретной количественной оценки иммунных клеток в твердой ткани опухоли FFPE с использованием стандартизированных РНК-секвенирующих реагентов и облачной информатики. В дополнение к размещению деградированной РНК из ткани FFPE, протокол способен разместить РНК, полученных из ограничивающих образцов тканей, таких как биопсия основных игл, аспиратии иглы, и микро- или макро-расчлененные ткани. Данные РНК из каждого образца сравнивают с базой данных моделей экспрессии генов иммунных клеток, называемых иммунными моделями экспрессии здоровья, для количественной оценки иммунных клеток в процентах от общего числа клеток, присутствующих в выборке. Кратко, эти модели были построены с использованием машинного обучения методы для выявления уникальных многогенных моделей выражения из всего транскриптома данных, полученных из очищенных популяций иммунных клеток (изолированы с помощью канонических маркеров клеток поверхности)17,18. Многомерные модели выражения здоровья, лежащие в основе технологии, позволяют количественно йенеиммунным клеткам в процентах от общего числа клеток, присутствующих в неоднородной смеси. Это позволяет исследователю генерировать меж- и внутри-образец сравнений иммунных клеток, которые, как было показано, имеют клиническое значение19,20. Другие приложения включают количественную оценку иммунного ответа до и после лечения, как описано в репрезентативных результатах. Анализ сообщает о множественных особенностях иммунной контельтекстуры опухоли и микроокружения опухоли, включая абсолютный процент восьми типов иммунных клеток (производных от моделей экспрессии генов): CD4и Т-клетки, CD8и Т-клетки, CD56, CD19и B-клетки, CD14- моноциты, Tregs, макрофаги M1 и M2 макрофаги. Кроме того, в ассе сообщается о выражении (в транскриптах на миллион, или TPM) десяти генов иммунного побега: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 и ARG1.
Набор реагентов используется для обеспечения готовности библиотек высокого качества к секвенированию на платформе Illumina в соответствии с гибридным методом подготовки библиотеки на основе захвата, как показано на рисунке 1. Если исследователь не имеет платформы секвенирования Illumina в своей лаборатории, они могут представить свои образцы в основную лабораторию для секвенирования. После сгенерирования данные секвенирования загружаются на портал Prism для автоматизированного анализа, а всеобъемлющий количественный профиль для каждого отдельного образца в виде Иммунного отчета(рисунок 2А)возвращается пользователю. Пользователи могут также определить группы выборки в prism Portal для создания Biomarker Report(рисунок 2B),подчеркивая статистически значимые биомаркеры, которые различают две когорты пациентов. Важно отметить, что данные, генерируемые набором реагентов, предназначены только для использования в исследованиях и не могут использоваться в диагностических целях.
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса. В этом протоколе РНК сначала преобразуется в кДНК. Секвенирование адаптеров ligated, и адаптер-ligated cDNA усиливается и штрих-кодпируется ПЦР для создания библиотеки предварительного захвата. Биотинилатированные зонды затем гибридизируются с конкретными целями кДНК, которые затем захватываются с помощью стрептавидина. Несвязанная, нецелевая кДНК удаляется путем стирки. Окончательное обогащение PCR дает библиотеку после захвата, готовую к секвенированию. «Общая РНК должна быть из образцов человека; может быть нетронутой или деградиромой (FFPE) РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель иммунных отчетов. Рабочий процесс генерирует два отчета, индивидуальный иммунный отчет(A) для каждого обработанного образца, и отчет о биомаркерах(B) для определенных когорты пациентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Протокол требует примерно 16 ч времени подготовки (от общей РНК до библиотек, готовых к секвенированию); однако, как отмечено в протоколе, существует ряд дополнительных остановочных пунктов. Анализ использует богатый, динамичный характер транскриптомики, чтобы выйти за рамки устаревших одноанализных биомаркеров к многомерным моделям экспрессии генов, тем самым позволяя всеобъемлющую биологическую характеристику образцов тканей со стандартизированными реагенты и простые в использовании программные средства. Это дает исследователям возможность использовать современные технологии в своей собственной лаборатории, используя машинное обучение и базу данных моделей экспрессии здоровья, чтобы получить более точные, количественные иммунные профили драгоценных клинических образцов, и обнаружить многомерные биомаркеры РНК с полным статистическим анализом.
Protocol
Образцы тканей человека, использованные в представленных здесь результатах представлений, были приобретены у авторитетной организации (TriStar Technology Group) и получили информацию о согласии доноров, позволяющей научные и коммерческие исследования, а также одобрение компетентных этических Комитет.
Часть I: Подготовка библиотеки предварительного захвата
1. Количественная и квалификация РНК
- Количественная РНК с помощью флюорометрического асссиуса для определения соответствующего вклада в асссе. Оцените качество входного РНК с помощью электрофореза для определения значения целостности РНК (RIN) и процент фрагментов, которые являются значениями 200 нуклеотидов (DV200).
- Для нетронутых (RIN No gt; 7) или частично деградированных образцов РНК (RIN No 2 до 7) следовать библиотеке подготовки шаги для высокого качества / нетронутой РНК, начиная с шага 2.1. Качество РНК имеет важное значение для выбора правильного времени фрагментации в программе теплового цикла #1(Дополнительная таблица 2).
- Для сильно деградированных образцов (например, RIN No 1 до 2 или FFPE) определите значение DV200. Эти образцы не требуют фрагментации и будут следовать инструкциям для деградированных РНК, начиная с шага 2.2.
- Подготовьте соответствующее количество общей РНК для каждого образца для путем разбавления 20 нг РНК (Высокое качество / Неинтин РНК с RIN Nogt; 2) или 40 нг РНК (Деградированная / FFPE РНК с DV200 до 5 кл/л в безядерной воде. Обработка образцов с DV200 злт; 20% не рекомендуется. Для контрольных образцов РНК, предоставленных комплектом, разбавьте 1 зл соответствующей РНК в 4 зликатбезной воды. Контрольные образцы будут следовать той же обработке, что и для высококачественных (Intact) или деградированных (FFPE) РНК-материалов, как помечено. Смотрите дополнительную таблицу 1 для всех реагентов, включенных в комплект.
2. Фрагментация РНК и грунтовка
- Следуйте шагу 2.1.1 для высококачественной/ нетронутой РНК с RIN
- Для высококачественной РНК, собрать фрагментации и грунтовки реакции на льду в нуклеаз-бесплатно ПЦР трубки в соответствии с таблицей 1.
- Тщательно перемешайте, повысив вверх и вниз несколько раз. Затем, кратко спина вниз образцы в микроцентрифуге
ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех центрифуг спинов в протоколе, скорость 1000 х г, по крайней мере 3 с рекомендуется. - Поместите образцы в тепловой циклизатор и использовать программу #1(Дополнительная таблица 2).
- Немедленно перенесите трубки на лед и перейдите к первому синтезу кДНК для высококачественной РНК (Шаг 3.1). Для одновременной подготовки как высококачественной, так и FFPE РНК, начните подготовку РНК FFPE (Шаг 2.2) во время фрагментации инкубации.
- Тщательно перемешайте, повысив вверх и вниз несколько раз. Затем, кратко спина вниз образцы в микроцентрифуге
- Для высококачественной РНК, собрать фрагментации и грунтовки реакции на льду в нуклеаз-бесплатно ПЦР трубки в соответствии с таблицей 1.
| Фрагментация и примоинг Микс | Объем (КЛ) |
| Intact или частично деградировали РНК (20 нг) | 5 |
| Первый strand Синтез Реакции буфера | 4 |
| Случайные праймеры | 1 |
| Общий объем | 10 |
Таблица 1: Фрагментация и грунтовка реакции на высококачественную РНК. Компоненты фрагментации и грунтовочной реакции на высококачественную РНК должны быть собраны и смешаны на льду в соответствии с показанными объемами. Мастер сочетание First Strand синтез реакции буфера и случайных праймеров могут быть сделаны и добавлены к образцам РНК.
- Следуйте Шаг 2.2.1 для деградированных / FFPE РНК с DV200
- Для сильно деградированных (FFPE) РНК, которая не требует фрагментации, собрать грунтовки реакции, как описано в таблице 2. Для нетронутой РНК, не забудьте следовать шаг2.1.
- Тщательно перемешайте, повысив вверх и вниз несколько раз. Затем, кратко спина вниз образцы в микроцентрифуге.
- Поместите образцы в тепловой циклизатор и использовать программу #2(Дополнительная таблица 2).
- Перенесите трубки на лед и перейдите к первому синтезу кДНК-стэнда для высокодеградной (FFPE) РНК (Шаг 3.2).
- Для сильно деградированных (FFPE) РНК, которая не требует фрагментации, собрать грунтовки реакции, как описано в таблице 2. Для нетронутой РНК, не забудьте следовать шаг2.1.
| Первобытная реакция | Объем (КЛ) |
| РНК FFPE (40 нг) | 5 |
| Случайные праймеры | 1 |
| Общий объем | 6 |
Таблица 2: Случайная реакция грунтовки для сильно деградированных РНК. Компоненты грунтовки реакции для сильно деградированных РНК должны быть собраны на льду в нуклеазе свободной трубки ПЦР.
3. Первый Strand кДНК Синтез
- Следуйте шагу 3.1.1 для высококачественной/ нетронутой РНК с RIN
- Для нетронутой РНК (высокого качества) соберите реакцию Первого синтеза стрядок на льду в безнуточной пЦР-трубке в соответствии с таблицей 3.
- Сохраняя реакции на льду, тщательно перемешать путем pipetting вверх и вниз несколько раз. Кратко спина вниз образцы в микроцентрифуге, и перейти непосредственно к первой нити синтеза инкубации (Шаг 4).
- Для нетронутой РНК (высокого качества) соберите реакцию Первого синтеза стрядок на льду в безнуточной пЦР-трубке в соответствии с таблицей 3.
| Первый синтез стрядей | Объем (КЛ) |
| Фрагментированная и primed РНК (Шаг 2.1.3) | 10 |
| Первый Strand синтез специфичность реагент | 8 |
| Первый Strand синтез фермента Mix | 2 |
| Общий объем | 20 |
Таблица 3: Первая реакция синтеза стрядки для высококачественной РНК. Компоненты фрагментации и грунтовочной реакции на высококачественную РНК должны быть собраны и смешаны на льду в соответствии с приведенными объемами. Мастер-микс первого струйного синтеза специтаторности реагента и first Strand синтез фермента Mix могут быть сделаны и добавлены к фрагментированным и загрунтованные образцы РНК.
- Следуйте Шаг 3.2.1 для деградированных / FFPE РНК с DV200
- Для сильно деградированных РНК (FFPE), собрать первую реакцию синтеза стрядок на льду в нуклеазе-бесплатно ПЦР трубки в соответствии с таблицей 4.
- Сохраняя реакции на льду, тщательно перемешать путем pipetting вверх и вниз несколько раз. Кратко спина вниз образцы в микроцентрифуге, и перейти непосредственно к первой нити синтеза инкубации (Шаг 4).
- Для сильно деградированных РНК (FFPE), собрать первую реакцию синтеза стрядок на льду в нуклеазе-бесплатно ПЦР трубки в соответствии с таблицей 4.
| Первый синтез стрядей | Объем (КЛ) |
| Primed РНК (Шаг 2.2.3) | 6 |
| Первый strand Синтез Реакции буфера | 4 |
| Первый Strand Специфика Реагент | 8 |
| Первый Strand синтез фермента Mix | 2 |
| Общий объем | 20 |
Таблица 4: Реакция первого синтеза стрядок для сильно деградированных РНК. Компоненты фрагментации и грунтовочной реакции для сильно деградированных РНК должны быть собраны и смешаны на льду в соответствии с показанным объемами. Мастер сочетание First Strand синтез реакции буфера, First Strand синтеза специфичность реагента, и First Strand синтез фермента Mix могут быть сделаны и добавлены к загрунтованных образцов РНК.
4. Первая инкубация синтеза стрядок
- Сохраняя трубки на льду, тщательно перемешать, трубя вверх и вниз несколько раз. Кратко спина вниз образцы в микроцентрифуге. Инкубировать образцы в разогретом тепловом цикле после программы #3(Дополнительная таблица 2).
5. Второй Strand кДНК Синтез
- Подготовьте вторую реакцию синтеза кДН на льду, собрав компоненты, перечисленные в таблице 5,включая первый продукт реакции на нити из шага 4.1.
| Реакция синтеза второй стрядки | Объем (КЛ) |
| Первый продукт синтеза стрядей (Шаг 4.1) | 20 |
| Второй Strand синтез реакции буфера | 8 |
| Второй Strand синтез фермента Mix | 4 |
| Безнуктовода | 48 |
| Общий объем | 80 |
Таблица 5: Реакция синтеза второй стрядки. Компоненты второй реакции синтеза кдна должны быть собраны и смешаны на льду в соответствии с объемами показано. Мастер сочетание второй стрядной синтез реакции буфера, второй strand синтез фермента Mix, и Nuclease-свободной воды могут быть сделаны и добавлены к первому продукту синтеза strand.
- Сохраняя трубки на льду, тщательно перемешать, трубя вверх и вниз несколько раз. Инкубировать в тепловом циклическом цикле после программы #4(Дополнительная таблица 2).
6. cDNA очистки с использованием SPRI (Твердая фаза обратимой неймобилизации) бисер
- Разрешить SPRI бисер, чтобы прогреть до комнатной температуры, по крайней мере 30 минут перед использованием, а затем вихрь SPRI бисер а также около 30 с, чтобы повторно.
- Добавьте 144 л повторного бисера ко второй реакции синтеза нити (80 евро). Хорошо перемешать, трубя вверх и вниз, по крайней мере 10 раз и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Кратко спина труб в микроцентрифуге и место трубки на магнитной стойке, чтобы отделить бисер от супернатанта. После того, как раствор будет чистым, тщательно удалите и отбросьте супернатант. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить бисер, которые содержат ДНК.
- Добавьте 180 л свежеприготовленного 80% этанола в трубки, находясь на магнитной стойке. Инкубировать при комнатной температуре по 30 с, а затем аккуратно удалить и отбросить супернатант.
- Повторите шаг 6.4 один раз в общей сложности 2 стирки.
- Полностью удалить остаточный этанол. Оставьте трубки на магнитной стойке и просушите шарики в течение примерно 3 минут с открытой крышкой или до тех пор, пока не высохнет. Не над сухим шариками, так как это может привести к снижению восстановления ДНК.
- Удалите трубки из магнита и добавьте 53 Л 0,1x TE Buffer (входит в набор реагентов, см. Дополнительный стол 1) к бисеру. Пипетка вверх и вниз, по крайней мере 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Поместите трубки на магнитную стойку, позволяя бисеру полностью отделиться от супернатанта. Передача 50 зл и супернатанта для очистки нукле-бесплатных ПЦР труб. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить бисер. Это необязательная точка остановки в протоколе, образцы кДНК могут храниться при -20 градусов по Цельсию.
7. Окончание ремонта библиотеки кДНК
- Соберите конечную реакцию ремонта на льду путем сборки компонентов, перечисленных в таблице 6, ко второму продукту синтеза нитей от Шага 6.8.
| Реакция на конечный ремонт | Объем (КЛ) |
| Второй продукт синтеза стрядей (Шаг 6.8) | 50 |
| Конец Ремонт Реакция Буфер | 7 |
| Конец Ремонт фермента Mix | 3 |
| Общий объем | 60 |
Таблица 6: Конечная реакция ремонта. Компоненты конечной реакции ремонта должны быть собраны и смешаны на льду в соответствии с объемами показано. Мастер сочетание конечного ремонта Реакции Буфер и конец ремонта фермента Mix могут быть сделаны и добавлены в второй strand синтез продукта.
- Установите пипетку до 50 злиц, а затем пипетка весь объем вверх и вниз, по крайней мере 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Кратко центрифуга для сбора всей жидкости со стороны труб. Важно хорошо перемешать. Наличие небольшого количества пузырьков не помешает производительности.
- Инкубировать образцы в тепловом циклическом цикле после #5 программы(Дополнительная таблица 2).
8. Лигация адаптора
- Перед настройкой реакции перевязки разбавить адаптор в ледяной адаптер разбавления буфера, как показано в таблице 7, умножая на необходимое количество образцов, плюс 10% дополнительно. Держите разбавленный адаптер на льду.
| Разбавление лигации | Объем (КЛ) |
| Адаптер | 0.5 |
| Адаптор разбавления буфер | 2 |
| Общий объем | 2.5 |
Таблица 7: Адаптор разбавления. Адаптер должен быть разбавлен на льду с буфером разбавления адаптера в зависимости от показанных объемов.
- Соберите реакцию перевязки на льду, добавив компоненты, как описано в таблице 8, в порядке, перечисленном, до конца подготовки реакции продукта от шага 7.3. Обратите внимание, что Ligation Master Mix и Ligation Enhancer можно смешивать заранее. Эта смесь стабильна, по крайней мере, 8 ч при 4 градусах Цельсия. Не передний микс Ligation Master Mix, Усилитель ligation и адаптор перед использованием в шаге лигации адаптора.
| Реакция лигации | Объем (КЛ) |
| Конец Prepped ДНК (Шаг 7.3) | 60 |
| Разбавленный адаптер (шаг 8.1) | 2.5 |
| Усилитель лиги | 1 |
| Лигационный мастер Микс | 30 |
| Общий объем | 93.5 |
Таблица 8: Реакция лигации. Компоненты реакции перевязки адаптера должны собираться на льду в соответствии с объемами, указанными в показанном порядке. Мастер-микс усилогции ligation Enhancer и Ligation Master Mix можно сделать и добавить в днк End Prepped с разбавленным адаптором. Не смешивайте разбавленный адаптор и Ligation Master Mix или Ligation Enhancer до смешивания с эндом Prepped ДНК.
- Установите пипетку до 80 злиц, а затем пипетка весь объем вверх и вниз, по крайней мере 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Выполните быстрый спин, чтобы собрать всю жидкость со стороны труб. Ligation Master Mix очень вязкий. Позаботьтесь о том, чтобы обеспечить адекватное смешивание реакции перевязки, так как неполное смешивание приведет к снижению эффективности перевязки. Наличие небольшого количества пузырьков не помешает производительности.
- Инкубировать следующие программы #6(Дополнительная таблица 2), а затем удалить перевязочный mixture из теплового циклала и добавить 3 Зл адаптор обработки фермента, в результате чего общий объем 96,5 л.
- Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы хорошо перемешать, а затем инкубировать следующие программы #7(Дополнительная таблица 2) прежде чем приступить к очищению реакции лигации.
9. Очистка реакции на лигацию с использованием SPRI Neads
- Разрешить SPRI бисер, чтобы прогреть до комнатной температуры, по крайней мере 30 минут перед использованием, а затем вихрь SPRI бисер для приблизительно 30 с, чтобы повторно.
- Добавьте 87 кЛ повторного SPRI бисера и хорошо перемешать, трубачя вверх и вниз, по крайней мере 10 раз. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Кратко спина труб в микроцентрифуге и место трубки на магнитной стойке, чтобы отделить бисер от супернатанта. После того, как раствор будет ясным (5 мин), осторожно удалите и отбросьте супернатант. Не выбрасывайте бисер.
- Добавьте 180 л свежеприготовленного 80% этанола в трубки, находясь на магнитной стойке. Инкубировать при комнатной температуре по 30 с, а затем аккуратно удалить и отбросить супернатант. Повторите шаг 9.4 один раз в общей сложности 2 стирки.
- Полностью удалить остаточный этанол. Оставьте трубки на магнитной стойке и просушите шарики в течение примерно 3 минут с открытой крышкой или до тех пор, пока не высохнет. Не над сухим шариками, так как это может привести к снижению восстановления ДНК.
- Снимите трубки с магнита и добавьте 17 кл.с. буфера 0,1x TE к бисеру. Пипетка вверх и вниз, по крайней мере 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре, а затем поместите трубки на магнитную стойку, что позволяет бисеру полностью отделиться от супернатанта.
- Передача 15 зл и супернатанта для очистки нукле-бесплатных ПЦР труб. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить бисер. Это необязательная точка остановки в протоколе, ДНК адаптора может храниться при -20 градусов по Цельсию.
10. ПЦР Обогащение адаптера Ligated ДНК
- Настройка реакции ПЦР, описанной в таблице 9. Мастер Mix, содержащий pre-Capture PCR Master Mix и Универсальный праймер может быть сделан и добавлен в адаптор ligated ДНК. Для мультиплексного секвенирования используйте уникальные индексные праймеры для каждой реакции и добавляйте к каждому образцу по отдельности.
| Обогащение ПЦР | Объем (КЛ) |
| Адаптерная днк (Шаг 10.1) | 15 |
| Предварительно захват PCR Мастер Микс | 25 |
| Универсальный ПЦР Праймер | 5 |
| Индекс (X) Праймер | 5 |
| Общий объем | 50 |
Таблица 9: ПЦР обогащение адаптера ligated ДНК. Компоненты ПЦР обогащения адаптерной реакции ДНК должны быть собраны и смешаны на льду в соответствии с объемами показано. Мастер-микс Pre-Capture PCR Master Mix и Универсальный ПЦР Праймер можно сделать и добавить в адаптер ligated ДНК. Для мультиплексного секвенирования каждому образцу должен быть дан уникальный Index Primer.
- Хорошо перемешать, аккуратно пипетки вверх и вниз 10 раз. Кратко спина труб в микроцентрифуге и место в тепловой циклизатор и выполнить усилитель ПЦР с помощью программы #8(Дополнительная таблица 2).
11. Очистка реакции ПЦР с использованием бисера SPRI
- Разрешить SPRI бисер, чтобы прогреть до комнатной температуры, по крайней мере 30 минут перед использованием, а затем вихрь SPRI бисер для приблизительно 30 с, чтобы повторно.
- Добавьте 45 юл повторного шарика к каждой реакции ПЦР (50 евро). Хорошо перемешать, труба вверх и вниз, по крайней мере 10 раз, перед инкубированием в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Кратко спина труб в микроцентрифуге и место трубки на магнитной стойке, чтобы отделить бисер от супернатанта. После того, как раствор будет ясным (5 мин), осторожно удалите и отбросьте супернатант. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить бисер, которые содержат ДНК.
- Добавьте 180 л свежеприготовленного 80% этанола в трубки, находясь в магнитной стойке. Инкубировать при комнатной температуре по 30 с, а затем аккуратно удалить и отбросить супернатант. Повторите шаг 11.4 один раз в общей сложности 2 стирки.
- Полностью удалить остаточный этанол. Оставьте трубки на магнитной стойке и просушите шарики в течение примерно 3 минут с открытой крышкой или до тех пор, пока не высохнет. Не над сухим шариками, так как это может привести к снижению восстановления ДНК.
- Снимите трубки с магнита и добавьте в бусы 23 л 0,1х TE Buffer. Пипетка вверх и вниз, по крайней мере 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Поместите трубки на магнитную стойку, позволяя бисеру полностью отделиться от супернатанта. Передача 20 Зл супернатанта для очистки нукле-бесплатных ПЦР труб. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить бисер. Это необязательная точка остановки в протоколе, библиотеки pre-Capture могут храниться при -20 градусов по Цельсию.
12. Проверка и количественная библиотека предварительного захвата
- Измерьте концентрацию библиотеки предварительного захвата с помощью флюорометра и высокой чувствительности набора анализов. Минимальная доходность 200 нг требуется, чтобы перейти к части II: Гибридизация и захват.
- Выполнить 1 зл библиотеки на цифровой системы электрофореза. При необходимости разбавить образец, чтобы избежать перегрузки чипа высокой чувствительности, в соответствии с рекомендациями производителя по протоколу.
- Убедитесь, что электроферограмма показывает узкое распределение с пиковым размером примерно 250-400 б.п. (см. Репрезентативные результаты, рисунок 3 и рисунок 4).
- Если пик 128 bp (адаптор-димер) виден в следах Bioanalyzer, а интенсивность сигнала - интенсивность библиотечного сигнала 250-400 б.п. (см. Репрезентативные результаты, рисунок 5),а затем поднять объем выборки (от шага 11,7) до 50 л с 0,1x TE Buffer и повторить очистку SPRI Bead (Step 11). Это необязательная точка остановки в протоколе, библиотеки предварительного захвата могут храниться при -20 градусов по Цельсию, прежде чем перейти к части II: Гибридизация иммуноприризма и захвата.
Часть II: Гибридизация и захват
13. Комбинат Блокирование Олигос, Cot-1 ДНК, Предварительно захвата библиотеки ДНК, и сухой
- Смешайте штрих-код библиотеки, подготовленные в шаге 11 и количественно в шаге 12, с Cot-1 ДНК и блокирование Oligos в нуклеазе-бесплатно ПЦР трубки или 1,5 мл микротрубки, как показано в таблице 10.
| Реагента | Количество/объем |
| Библиотека с штрих-кодом от шага 10.10 | 200 нг |
| Cot-1 ДНК | 2 мкг |
| Блокирование Олигос | 2 л |
Таблица 10: Подготовка и высыхание гибридизации. Компоненты, которые должны быть объединены для высыхания библиотек в рамках подготовки к гибридизации должны быть собраны в соответствии с количеством показано.
- Высушите содержимое трубки с помощью вакуумного концентратора, установленного на 30-45 градусов по Цельсию. Это необязательная точка остановки в протоколе. После сушки трубки могут храниться на ночь при комнатной температуре (15-25 градусов по Цельсию) или дольше при температуре -20 градусов по Цельсию.
14. Гибридизация зондов захвата ДНК с библиотекой
- Оттепель 2x бисера мыть буфера и гибридизации буфера, гибридизации буфера Enhancer, ИммуноПризм зонд панели, 10x мыть буфер 1, 10x мыть буфер 2, 10x мыть буфер 3, и 10x строгий буфер мыть явки при комнатной температуре. Перед использованием проинспектировать буфер гибридизации для кристаллизации солей. Если кристаллы присутствуют, нагрейте трубку при температуре 65 градусов по Цельсию, дрожа с перерывами, пока буфер полностью не растворится.
- При комнатной температуре создайте мастер-микс гибридизации в трубке. Умножьте объемы на количество образцов и добавьте 10% дополнительно, следуя таблице 11.
| Мастер-микс гибридизации | Объем (КЛ) |
| Буфер гибридизации | 8.5 |
| Гибридизация буфер усилитель | 2.7 |
| Группа зонда ImmunoPrism | 5 |
| Безобесная вода | 0.8 |
| Общий объем | 17 |
Таблица 11: Мастер-микс гибридизации. Компоненты Гибридизации Master Mix должны быть собраны и смешаны при комнатной температуре в зависимости от показанных объемов.
- Вихрь или пипетка вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать. Затем добавьте 17 зл и тысячу мастер-микс для каждой трубки, содержащей высушенную ДНК. Печать труб и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Vortex образцов, обеспечивая их полностью смешанные, и спина вниз образцы кратко в микроцентрифуге. Если это применимо, перенесите каждый образец из микротрубки мощностью 1,5 мл на нуклеазную трубку ПЦР.
- Поместите образцы в тепловой циклизатор и запустить программу #9(Дополнительная таблица 2).
- Во время инкубации подготовьте буферы для мытья (шаг 15) и стрептавидиновые бусы (шаг 16), что позволяет достаточно времени для разогрева буферов и уравновешивания стрептавидина.
15. Подготовьте буферы для мытья
ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы мытья поставляются как 2x (Бисины мыть буфер) или 10x (все другие буферы мытья) концентрированных решений.
- Во время инкубации гибридизации разбавьте 2x Bead Wash Buffer и 10x Wash Buffers, чтобы создать 1x рабочие решения, умножая на необходимое количество образцов и добавляя 10% дополнительно, следуя таблице 12. Если 10x Wash Buffer 1 облачно, нагрейте бутылку в водяной бане 65 градусов по Цельсию или нагревательном блоке, чтобы повторно приостановить частицы. Замороженные 1x Мытье буферов должны быть смешаны после оттаивания.
| Вымойте буферы | Концентрированный буфер (КЛ) | Вода без нулизы (КЛ) | Итого (L) |
| Бисо вымотка буфер | 150 | 150 | 300 |
| Вымойте буфер 1 | 25 | 225 | 250 |
| Вымойте буфер 2 | 15 | 135 | 150 |
| Вымойте буфер 3 | 15 | 135 | 150 |
| Строгий буфер мытья | 30 | 270 | 300 |
Таблица 12: Размывание буфера. Буферы для мытья концентрации должны быть разбавлены безнулетней водой при комнатной температуре в зависимости от показанных объемов.
- Aliquot 1x Мыть ебануты в нуклеазы-бесплатные пЦР трубки и место при соответствующих температурах, как указано в таблице 13. Обязательно включите достаточный перевес для пайпеттинга. Для нагретых буферов используйте тепловый цикл, установленный до 65 градусов по Цельсию с крышкой, установленной до 70 градусов по Цельсию.
| Вымойте буферы | Температура удержания | Объем/труба (КЛ) | Количество трубок/образец |
| Бисо вымотка буфер | RT (15-25 градусов по Цельсию) | 100 | 3 |
| Вымойте буфер 1 | 65 кк | 100 | 1 |
| Вымойте буфер 1 | RT (15-25 градусов по Цельсию) | 150 | 1 |
| Вымойте буфер 2 | RT (15-25 градусов по Цельсию) | 150 | 1 |
| Вымойте буфер 3 | RT (15-25 градусов по Цельсию) | 150 | 1 |
| Строгий буфер мытья | 65 кк | 150 | 2 |
Таблица 13: Разбавленные буферы для мытья. Разбавленные буферы для мытья должны быть разделены на отдельные трубки в зависимости от объемов и количества труб на показанный образец. Буферы для мытья должны быть проведены при указанной температуре перед использованием.
- Подготовьте смесь биса Resuspension Mix при комнатной температуре, как показано в таблице 14,умножая на необходимое количество образцов и добавляя 10% дополнительно.
| Бисовосстановление Реманесимикс Микс | Объем (КЛ) |
| Буфер гибридизации | 8.5 |
| Гибридизация буфер усилитель | 2.7 |
| Безобесная вода | 5.8 |
| Общий объем | 17 |
Таблица 14: Бис-повторение смеси. Компоненты смеси подвески биса должны быть собраны и смешаны при комнатной температуре в зависимости от показанных объемов.
16. Подготовка стрептавидина бисера
- Равновесие стрептавидина бусин при комнатной температуре, по крайней мере 30 минут перед использованием. Смешайте бусины тщательно вихрем в течение 15 с и aliquot 50 л бусин за захват в нуклеазы свободной пЧР трубки.
- Добавьте 100 зл 1x бисора мыть буфера (подготовлен в шаге 15,1) к каждой трубке. Аккуратно пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы смешать. Поместите трубку на магнитную стойку, позволяя бисеру полностью отделиться от супернатанта.
- Удалите и отбросьте четкий супернатант. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить бисер.
- Выполните следующую стирку.
- Снимите с магнитной стойки. Добавьте 100 зл и сот 1x бисера мыть буфера к каждой трубке, содержащей бусы, а затем пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы смешать.
- Поместите трубку в магнитную стойку, позволяя бисеру полностью отделиться от супернатанта.
- Тщательно удалите и отбросьте прозрачный супернатант.
- Повторите шаг 16.4 один раз в общей сложности два стира.
- Снимите с магнитной стойки. Добавьте 17 зл испуг смеси подвески биса от шага 15.3 к каждой трубке. Пипетка вверх и вниз несколько раз тщательно перемешать. Убедитесь, что бусы не прилипают к сторонам труб. При необходимости, кратко спина труб, чтобы собрать бисер в нижней части.
17. Привязать гибридизированную цель к бебис стрептавидина
- После 4-часовой инкубации гибридизации удалите образцы из теплового циклизатора и установите тепловой циклист для инкубации при 65 градусах Цельсия с нагретой крышкой, установленной до 70 градусов по Цельсию.
- Используя многоканальный пипетку, перенесите в образцы 17 л полностью гомогенизированных бусин. Тщательно перемешайте, повысив вверх и вниз 10 раз.
- Привязать ДНК к бисеру, поместив трубки в тепловой циклпосле следующие программы #10(Дополнительная таблица 2). Во время инкубации, кратко удалить полосы труб каждые 10-12 мин и осторожно вихрь в течение 3 с, чтобы убедиться, что бусы остаются в подвеске. Кроме того, смешать путем pipetting вверх и вниз несколько раз. Приступить к мыть Streptavidin бисер (Шаг 18).
18. Мыть стрептавидин бисер для удаления несвязанной ДНК
- Используйте буферы 1x Wash от Шага 15.2 и храните нагретые буферы в тепловом цикле во время мытья.
- Добавьте 100 юл разогретых 1x Мытье буфера 1 в трубки от шага 17.3. Тщательно перемешайте, повысив вверх и вниз 10 раз. Поместите трубки на магнитную стойку, позволяя бисеру полностью отделиться от супернатанта.
- Пипетка и отбросить супернатант, который содержит несвязанную ДНК. Снимите с магнитной стойки.
- Выполните следующие 65 градусов по Цельсию мыть.
- Добавьте 150 л предварительно разогретого 1x stringent Wash Buffer.
- Тщательно перемешайте, повысив вверх и вниз, по крайней мере 10 раз. Избегайте пузырьков во время пипетки. Убедитесь, что бисер полностью resuspended во всех трубах.
- Инкубировать в тепловом цикле при 65 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
- Поместите трубки на магнитную стойку, позволяя бисеру полностью отделиться от супернатанта. Пипетка и отбросить супернатант, который содержит несвязанную ДНК. Снимите с магнитной стойки.
- Повторите шаг 18.4 для в общей сложности двух строгих совок.
- Выполните первую стирку комнатной температуры.
- Добавьте 150 л комнатной температуры 1x Wash Buffer 1.
- Пипетка вверх и вниз от 10 до 20 раз, чтобы полностью приостановить бисер.
- Печать труб и инкубировать в течение 2 минут, чередуя между мягко вихрем в течение 30 с и отдыха в течение 30 секунд. Убедитесь, что бусы во всех скважинах остаются полностью приостановлены во всех трубах на протяжении всей инкубации.
- Кратко центрифуга труб.
- Поместите трубки на магнитную стойку, позволяя бисеру полностью отделиться от супернатанта. Пипетка и отбросить супернатанта.
- Печать труб и кратко центрифуги. Вернитесь к магнитной стойке и используйте 10-л пипетку, чтобы удалить любой остаточный буфер стирки.
- Выполните вторую комнатную стирку температуры.
- Добавьте 150 л комнатной температуры 1x Wash Buffer 2.
- Пипетка вверх и вниз от 10 до 20 раз, чтобы полностью приостановить бисер.
- Печать труб и инкубировать в течение 2 минут, чередуя между мягко вихрем в течение 30 с и отдыха в течение 30 секунд. Убедитесь, что бусы во всех скважинах остаются полностью приостановлены во всех трубах на протяжении всей инкубации.
- Кратко центрифуга труб.
- Передача всего объема бисера повторно в мытье буфера 2 для очистки нуклиз-бесплатно ПЦР труб. Важно: Перенос бисера на свежие трубки важно, чтобы избежать нецелевого загрязнения.
- Поместите трубки на магнитную стойку, позволяя бисеру полностью отделиться от супернатанта. Пипетка и отбросить супернатанта.
- Печать труб и кратко центрифуги. Вернитесь к магнитной стойке и используйте 10-л пипетку, чтобы удалить любой остаточный буфер стирки.
- Выполните третью комнатную стирку температуры.
- Добавьте 150 л комнатной температуры 1x Wash Buffer 3.
- Пипетка вверх и вниз от 10 до 20 раз, чтобы полностью приостановить бисер.
- Печать труб и инкубировать в течение 2 минут, чередуя между мягко вихрем в течение 30 с и отдыха в течение 30 секунд. Убедитесь, что бусы во всех скважинах остаются полностью приостановлены во всех трубах на протяжении всей инкубации.
- Кратко центрифуга труб.
- Поместите трубки на магнитную стойку, позволяя бисеру полностью отделиться от супернатанта. Пипетка и отбросить супернатанта.
- Печать труб и кратко центрифуги. Вернитесь к магнитной стойке и используйте пипетку в 10 л для удаления любого остаточного буфера для мытья.
- Снимите с магнитной стойки и добавьте 20 кл.л. безнудной воды в бисер.
- Pipette вверх и вниз 10 времен для того чтобы обеспечить любое шарики вставленные к стороне пробки resuspended.
- Важно: Не отбрасывайте бусы. Используйте все 20 л повторного бисера с захваченной ДНК в шаге 19.
19. Выполните Заключительный, После захвата PCR Обогащение
- Подготовьте Post-Capture PCR Master Mix в соответствии со следующей таблицей, умножая на необходимое количество образцов и добавляя 10% дополнительно, согласно таблице 15.
| После захвата PCR Мастер Микс компонент | Объем (КЛ) |
| После захвата PCR MasterMix | 25 |
| Пост-захват PCR Праймер Микс | 1.25 |
| Безобесная вода | 3.75 |
| Общий объем | 30 |
Таблица 15: После захвата PCR Мастер Mix. Компоненты Post-Capture PCR Master Mix должны быть собраны и смешаны на льду в соответствии с объемами показано.
- Добавьте 30 юл после захвата PCR Master Mix к каждому образцу для окончательного объема реакции 50 Л. Смешайте тщательно трубача вверх и вниз 10 раз.
- Поместите пЦР трубки в тепловой цикл и инкубировать следующие программы #11(Дополнительная таблица 2).
20. Очистка фрагментов ПЦР после захвата
- Разрешить SPRI бисер, чтобы прогреть до комнатной температуры, по крайней мере 30 минут перед использованием, а затем вихрь SPRI бисер для приблизительно 30 с, чтобы повторно.
- Добавьте 75 юл повторного бисера к каждому улавливанию, обогащенным ПЦР (50 л). Хорошо перемешать, пипетка вверх и вниз, по крайней мере 10 раз. Стрептавидин бисер не будет мешать очистке бисера SPRI. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Кратко спина труб в микроцентрифуге и место трубки на магнитной стойке, чтобы отделить бисер от супернатанта. После того, как раствор будет чистым, тщательно удалите и отбросьте супернатант. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить бисер, которые содержат ДНК.
- Добавьте 180 л свежеприготовленного 80% этанола в трубку, находясь в магнитной стойке. Инкубировать при комнатной температуре по 30 с, а затем аккуратно удалить и отбросить супернатант.
- Повторите шаг 20.4 один раз в общей сложности 2 стирки.
- Полностью удалить остаточный этанол. Оставьте трубку на магнитной стойке и высушите 3 мин с открытой крышкой или до тех пор, пока не высохнет. Не пересушите бусы. Это может привести к снижению восстановления ДНК.
- Снимите трубку с магнита. Выясните ДНК из бисера, добавив 22 зл 0,1x TE буфера. Хорошо перемешать, пипетка вверх и вниз несколько раз. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре. Поместите трубку на магнитную стойку, пока раствор не прояснит.
- Удалить 20 зл супернатанта и перенесите на чистую нуклеазную трубку ПЦР, стараясь не беспокоить бисер. Это необязательная точка остановки в протоколе, библиотеки могут храниться при -20 градусов по Цельсию.
21. Проверка и количественная библиотека
- Измерьте концентрацию захваченной библиотеки с помощью флюорометра и набора высокой чувствительности.
- Измерьте среднюю длину фрагмента захваченной библиотеки с помощью цифрового чипа высокой чувствительности высокой чувствительности и вычислите средний размер фрагмента для каждой библиотеки с помощью программного обеспечения системы. Средний размер фрагмента должен быть примерно 250-400 б.п. (см. Результаты репрезентативных, рисунок 6 и рисунок 7). Это необязательная точка остановки в протоколе, заполненные библиотеки могут храниться при -20 градусов по Цельсию.
22. Секвенирование на секвенирующей платформе
- Для секвенирования разбавьте библиотеки до 2 нМ и следуйте рекомендациям производителя по загрузке и эксплуатации секвенсора. Последовательность библиотек на минимальную глубину 15 миллионов одного конца читает по крайней мере 50 bp в длину.
23. Анализ секвенирующих данных для создания иммунных профилей и обнаружения биомаркеров с помощью портала Prism Portal, облачного инструмента информатики
- Создайте учетную запись Prism, посетив https://prism.cofactorgenomics.com/
- После входа в систему нажмите Submit New Project в верхней панели инструментов с любой страницы в Prism, чтобы загрузить файлы секвенирования demultiplexed FAST, или загрузить файлы, хранящиеся на BaseSpace с учетной записью Prism.
- Заполните новую форму проекта, включая название проекта, а также образцы по группам или когорте. Для создания отчета о обнаружении обнаружения биомаркеров необходима группировка образцов и соответствующих названий групп. Обратите внимание, что для создания отчета О биомаркеров обнаружения требуется не менее 3 образцов в группе. Нажмите кнопку Запуска приложения, чтобы отправить форму; страница подтверждения появится в случае успеха.
- Во время входа в систему нажмите «Смотрите результаты» в верхней панели инструментов или на любой странице Prism. Prism позволяет пользователю видеть состояние представленных проектов и просматривать отчеты о образцах и биомаркерах в рамках проекта. Там будет таблица проектов, которые пользователь создал на Prism. Таблица имеет три столбца для статуса, имени и даты отправки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Статус каждого проекта может быть:
"Бег", где анализ проекта в настоящее время работает, или,
"Успех", где анализ проекта завершен и отчеты доступны. - Если проект завершил анализ (указанный статусом "Успех"), просмотрите отчеты об отдельных образцах и отчет об открытии биомаркеров. Обратите внимание, что Отчет о обнаружении биомаркеров будет доступен только в том случае, если проект включает в себя необходимое минимум три образца в группе.
- Чтобы получить доступ к этим отчетам, вернитесь в таблицу проектов и нажмите на название проекта. На этой странице проекта будет таблица с строкой для каждого образца в проекте. Нажмите на ссылку в каждой строке, под столбцом отчета, чтобы получить доступ к индивидуальному отчету каждого образца. Сразу ниже таблицы щелкните по ссылке для отчета О биомаркере обнаружения. Если на этой странице нет ссылок, ваш проект не завершил анализ.
Representative Results
В протоколе существует ряд контрольно-пропускных пунктов, которые позволяют пользователю оценить качество и количество генерируемых материалов. После шага 12, описанного в протоколе, генерируется электроферограмма, как показано на рисунке 3,что является представителем типичной библиотеки предварительного захвата для нетронутого образца РНК (RIN 7.8).
Рисунок 3: Типичный предварительный захват библиотеки Bioanalyzer след для нетронутой РНК образца. Библиотеки предварительного захвата отображаются как широкий пик размеров около 250-400 базовых пар (bp). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Следует проявлять осторожность, чтобы избежать чрезмерного усиления, о чем свидетельствует второй пик около 1000 bp показано на рисунке 4, представитель электроферограмма предварительного захвата библиотеки, генерируемые из образца РНК FFPE (DV200 и 46). Если этот пик небольшой по отношению к основному пику (около 250-400 базовых пар (bp), как показано на рисунке), он не будет мешать ступеням или анализу вниз по течению. Если второй пик большой по отношению к пику 250-400 bp, библиотека предварительного захвата может быть переработана с меньшим количеством циклов ПЦР, чтобы уменьшить чрезмерное усиление.
Рисунок 4: Типичный след биоанализа библиотеки предварительного захвата для образца РНК FFPE. Второй пик около 1000 б.п. свидетельствует о чрезмерном усилении. Если этот пик небольшой по отношению к основному пику около 250-400 б.п. (как показано на рисунке), он не будет мешать вниз по течению шагов или анализа. Если второй пик большой по отношению к пику 250-400 bp, библиотека предварительного захвата может быть переработана с меньшим количеством циклов ПЦР, чтобы уменьшить чрезмерное усиление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Как описано в шаге 12.1.3, наличие димеров адаптера должно быть оценено, чтобы определить, если необходима дополнительная очистка. Электроферограммы, показанные на рисунке 5, являются репрезентативными неприемлемыми(рисунок 5A,DV200 и 33) и приемлемыми(рисунок 5B,DV200 и 46) уровней адаптера dimer, появляясь как острый пик вокруг 128 bp.
Рисунок 5: Предварительный захват библиотеки Bioanalyzer следов. Димер адаптера показывает вверх как острый пик вокруг 128 bp. (A) Чрезмерно dimers адаптера присутствуют в этом электроферограмме. (B) Приемлемые уровни димера адаптера изображены в этом следе. Оба следа показывают доказательства мягкого чрезмерного усиления, но это не должно мешать иммунопромизм утвердительности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
По завершении протокола, до секвенирования, окончательные библиотеки снова оцениваются с помощью цифрового электрофорасиса. Библиотеки, изготовленные из РНК FFPE, как правило, имеют меньший средний размер распределения, чем библиотеки, сделанные из нетронутой РНК. Для нетронутых образцов РНК полученный след должен быть похож на рисунок 6 (RIN No 9.5). Для деградированных или FFPE РНК, в результате след должен выглядеть как на рисунке 7 (DV200 и 36).
Рисунок 6: Типичный след биоанализа заключительная библиотека для нетронутого образца РНК. Окончательные библиотеки отображаются как широкий пик размеров около 250-400 базовых пар (bp). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Типичный след биоанализа заключительная библиотека для образца РНК FFPE. Библиотеки, изготовленные из РНК FFPE, как правило, имеют меньший средний размер распределения, чем библиотеки, сделанные из нетронутой РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Как описано, результаты, полученные с помощью этого протокола, могут быть применены двумя ключевыми способами, как показано на рисунке 8.
Рисунок 8: Два случаях использования протокола. Результаты, полученные в результате этого иммунопрофайлового опроса, применяются в двух ключевых трансляционных приложениях. (A) Первый случай использования начинается с твердой ткани опухоли человека (в том числе FFPE архивов) и генерирует индивидуальный иммунный профиль для образца. (B) После создания для когорты человеческих образцов, данные объединяются с помощью портала Prism для создания многомерного биомаркера и соответствующего Biomarker Report. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Для демонстрации каждого из этих случаев использования, репрезентативные данные из небольшого трансляционного исследованиявключены 21. Образцы, используемые в этом исследовании, представляют собой набор образцов из 7 пациентов с диагнозом и лечением немелкоклеточного рака легких (NSCLC). Образцы пациента соответствия твердой ткани опухоли от до и после лечения биопсии. Во-первых, были проанализированы отдельные образцы для создания иммунного профиля, например, пример отчета, показанного на рисунке 9.
Рисунок 9: Пример индивидуального иммунного отчета для образца NSCLC. Конвейер Prism Portal генерирует графический отчет для каждого обработанного образца, с репрезентативным отчетом, созданным для твердого образца опухоли NSCLC, показанного здесь. (A) На лицевой стороне отчета графически изображено разрушение иммунных клеток, присутствующих в образце РНК, извлеченном из ткани FFPE. (B) Обратная сторона отчета включает таблицу иммунных клеток (в абсолютных процентах) и избежать экспрессии генов (в транскриптах на миллион, или TPM), а также заявление производительности для асссе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Иммунные профили до и после лечения могут быть использованы, чтобы понять, как терапия (химиотерапия или радиация, в этом исследовании) изменила микроокружение опухоли. Пример показан на рисунке 10, где изменения в процентах для каждой иммунной клетки и общего иммунного содержания показаны до и после химиотерапии, для одного пациента.
Рисунок 10: Пример предварительных и после результатов лечения. Показаны индивидуальные данные иммунной клетки и общего иммунного содержания, полученные из образцов до и после лечения у одного пациента NSCLC. В этом примере пациент получил режим химиотерапии в качестве лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Пациенты могут быть сгруппированы по таким критериям, как клинические исходы или фенотипы для сравнения. Например, на рисунке 11, образцы в исследовании NSCLC были сопоставлены в зависимости от времени прогрессирования заболевания после лечения. Подмножество пациентов показали рецидив заболевания в йgt;18 месяцев, и другой подмножество прогрессировалбыстрее быстрее, в 18 месяцев. Среднее значение дельты (разница между значениями до и после лечения) сравнивается для каждого образца для определения явных биомаркеров прогрессирования заболевания.
Рисунок 11: Пример клинического сравнения результатов. Количественные изменения между процентами иммунных клеток в соответствующих пробах NSCLC до и после лечения были рассчитаны и сообщены как значение "дельты". Те, которые выделены желтым цветом, показывают четкие изменения сигнала между статусом выживания. Синие полосы представляют средние значения дельты для йgt;18 месяцев до прогрессирования заболевания, оранжевые полосы представляют средние значения дельты в течение 18 месяцев до прогрессирования болезни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Наконец, аналогичные группы образцов могут быть использованы специально для поиска образцов предварительной обработки для выявления прогностических биомаркеров с помощью портала Prism для создания Biomarker Report. Показанный на рисунке 12, тот же клинический фенотип (прогрессирование заболевания), как описано выше, определяет группы выборки. В этом примере были определены два гена иммунного побега как статистически значимые дифференциаторы групп выборки (CD47 и OX40, показанные в нижней панели рисунка 12A). В этом примере, поскольку биомаркеры отдельных генов являются надежными с четкой статистической значимостью, многомерный биомаркер не добавляет значительного прогностического значения (ImmunoPrism, как это намечается в верхнем правом баре диаграммы Рисунок 12B). Полная таблица данных, включая результаты по всем 18 анализам для анализа, обобщена на обратной стороне доклада, включая статистический анализ и краткое резюме методов.
Рисунок 12: Пример отчета о биомаркерах для образцов NSCLC. Конвейер Biomarker Discovery предоставляет визуальный отчет об отдельных биомаркерах и многомерном биомаркере для машинного обучения с подробной статистикой. ()Для этого исследования, трубопровод определил два отдельных биомаркеров (CD47 и OX40) как статистически значимые для определения прогрессирования заболевания с порогом 18 месяцев. (B) Подробная информация о методе и полные результаты включены на обратной стороне доклада. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная таблица 1: Материалы набора реагентов. Список материалов, представленных в наборе ImmunoPrism, перечислены вместе с номерами частей, которые указаны в протоколе производителя. Все необходимое оборудование и материалы перечислены в таблице материалов. Посетите https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/ для листов данных о безопасности (SDS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительная таблица 2: Программы теплового цикла. Рекомендуемые цикловые программы, на которые ссылаются во всем протоколе, суммируются для удобства программирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительная таблица 3: Руководство по индексу последовательности. Индексные праймеры, указанные в наборе реагентов, перечислены; к каждой реакции добавляется уникальная грунтовка для постсекового демультиплексирования. Также предоставляются рекомендуемые комбинации мультиплексирования низкого уровня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Discussion
Протокол требует 20 нг нетронутыми или 40 нг сильно деградированных (FFPE) РНК. Образец РНК должен быть не состоит из ДНК, солей (например, Mg2 "или солей гуанидиниума), дивантовых хелатных агентов катиона (например, EDTA, EGTA, цитрат), или органики (например, фенол и этанол). Не рекомендуется продолжать с рнк-образцам, которые имеют DV200 lt;20%. Настоятельно рекомендуется использовать РНК управления в комплекте, поскольку эти элементы управления обеспечивают средства для оценки производительности на протяжении всего протокола, от подготовки библиотеки до анализа.
Протокол предназначен для выполнения с использованием 0,2 мл ПЦР полосы труб. Если предпочтительнее, протокол также может быть выполнен с использованием скважин в 96-колодец ПЦР пластины. Просто используйте скважины 96-колодец ПЦР пластины вместо всех ссылок на ПЦР труб или полосы труб. Используйте ПЦР пластинтолько с четкими скважинами только, так как важно визуально подтвердить полное повторное повторное приостановление бисера во время очистки бисера и мыть шаги.
На протяжении всего протокола держите реагенты замороженными или на льду, если не указано иное. Не используйте реагенты до тех пор, пока они полностью не оттаяют. Обязательно тщательно перемешайте все реагенты перед использованием.
Держите ферменты при -20 градусов до готовности к использованию и быстро присугивая прим. Используйте только молекулярно-классовую безкакую воду; не рекомендуется использовать очищенную от DEPC воду. При смешивании трубач, аккуратно аспирировать и распределять не менее 50% от общего объема до тех пор, пока растворы не будут хорошо смешаны. Пипетка смешивают все мастер-миксы, содержащие ферменты. Использование вихря для смешивания ферментов может привести к денатурации и поставить под угрозу их производительность. Во время очистки биса, используйте свежеприготовленные 80% этилового раствора из этанола молекулярного сорта. Использование этих растворов, которые не являются свежими может привести к снижению урожайности. Избегайте более сушки бисера, так как это может уменьшить эффективность elution (бусы выглядят трещинами, если более сушеные).
Как описано в шаге 10, к каждой реакции добавляются уникальные индексные грунтовки. На основе последовательностей этих индексов, для мультиплексирования низкого уровня, определенные комбинации индексов являются оптимальными. Последовательности этих индексов необходимы для демультипантиксирования данных после секвенирования. Последовательности и рекомендуемые комбинации мультиплексирования приведены в дополнительной таблице 3. На этом же этапе важно отметить, что количество рекомендуемых циклов ПЦР варьируется в зависимости от качества используемой РНК, и для предотвращения чрезмерного усиления ПЦР может потребоваться определенная оптимизация. Для ImmunoPrism Intact Control РНК и других высококачественных РНК, начать оптимизацию с 10 циклов ПЦР. Для ImmunoPrism FFPE Управления РНК и других сильно деградированных / FFPE РНК, начать оптимизацию с 15 циклов ПЦР. Рекомендуется создание тестовой библиотеки с использованием РНК-представителя материала для анализа в целях оптимизации циклов ПЦР. Минимальное количество циклов ПЦР, которые последовательно дают достаточные выходы библиотеки предварительного захвата (Nogt;200 ng) должны быть использованы. Вторичный пик около 1000 bp на следе Bioanalyzer свидетельствует о чрезмерном усилении(рисунок 4). Чрезмерное усиление должно быть сведено к минимуму, но наличие небольшого вторичного пика не помешает результатам асссе.
Чтобы свести к минимуму потерю образца и избежать переключения труб, Шаг 13 может быть выполнен в ПЦР труб, полосы труб, или 96-хорошо ПЦР пластины вместо 1,5 мл микротруб, если ваш вакуумный концентратор позволяет. Ротор может быть удален на многих концентраторов. Это позволяет полоски труб или пластин, чтобы поместиться в вакууме. Концентрация вакуума может быть запущена с использованием aqueous desiccation настройки без центрифугации. Проконсультируйтесь с руководством для вашего вакуумного концентратора для получения инструкций. Если образцы высохли в полост-трубках или 96-колодцевой пластине, этап гибридизации может быть выполнен в одном сосуде.
Во время шага 17, не забудьте вихрь каждые 10-12 минут, чтобы увеличить эффективность захвата биса. Тщательно держите колпачки теплых полосок труб при смешивании, чтобы предотвратить трубы от открытия.
Ямы, описанные в шаге 18, имеют решающее значение для предотвращения высокого неспецифического загрязнения и должны внимательно следить за ним. Не забудьте полностью приложить бисер на каждой стирке, полностью удалить буферы для мытья, а во время мытья буфера 2 мыть, перенесите образцы на свежую полоску трубки (Шаг 18.6.5). Убедитесь, что стрептавидин бисер полностью перепбитива и остаются в подвеске в течение всего инкубации. Брызги на трубчатые колпачки не окажут негативного влияния на захват. Во время комнатной температуры моет, микроплита вихрь смеситель может быть использован для вихря образцов для всего двухминутного инкубационного периода для облегчения повторного подвески. Не дайте стрептавидинбид бисер высохнуть. При необходимости расширьте инкубации в буферах, чтобы избежать высыхания бисера. При использовании более чем одной полосы трубки, работать с одной полосой трубки в то время, для каждой стирки в то время как другие полосы трубки сидят в термоцикле. Это может помочь избежать более сушки бисера или торопится, в результате чего бедные повторного действия или других суб-оптимальных методов. Впервые пользователям не рекомендуется обрабатывать более 8 реакций библиотеки одновременно.
Современные методы иммунного профилирования обеспечивают континуум информации - от тысяч точек данных, которые требуют значительной интерпретации (секвенирование РНК) до отдельной точки данных (одноместный IHC). Описанный здесь протокол представляет собой подход, который находится где-то посередине, с сфокусированным объемом, позволяющим высокой чувствительности, но захватив только подмножество клинически значимых транскриптомических данных. Из-за характера объемной экстракции РНК, этот протокол не предоставляет информацию о пространственных отношениях между иммунными клетками и микроокружением опухоли, однако, результаты могут быть дополнены технологиями визуализации, чтобы добавить эту информацию. Есть множество приложений для данных, генерируемых этим протоколом, как есть много можно узнать о биологии рака как болезни, и терапии разрабатываются для его лечения. Как показано в репрезентативных результатах, индивидуальный иммунный отчет полезен для понимания того, как иммунный профиль пациента может меняться в ответ на такие события, как прогрессирование болезни или лечение. В то время как результаты, представленные здесь, дают некоторые примеры случаев использования, другие приложения, включая изучение механизма действия терапии и выявление исходов для лечения, таких как прогрессирование и общее выживание, также Практические. При использовании этого протокола для применения биомаркеров для обнаружения биомаркеров важно практиковать надых для анализа однородных популяций, включены достаточные образцы для статистической силы и рассматриваются источники предвзятости. Из-за целенаправленного, обтекаемого характера исследования, можно представить себе путь к клинической проверки и вниз по течению применения этих биомаркеров после открытия.
Disclosures
Все авторы работают в Cofactor Genomics, Inc., компания, которая разработала и производит набор реагентов ImmunoPrism и информационные инструменты, используемые в этой статье. ImmunoPrism Assay предназначен только для использования в научных исследованиях и не предназначен для использования в диагностических процедурах.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить TriStar Technology Group за предоставление биологических образцов для репрезентативных результатов, а также всей молекулярной, аналитической, продуктовой и коммерческой групп в Cofactor Genomics за их техническую экспертизу и Поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR 8 tube strip | USA Scientific | 1402-2700 | USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip |
| 200 Proof Ethanol | MilliporeSigma | EX0276-1 | Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment |
| 96-well thermal cyclers | BioRad | 1861096 | |
| Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads | Beckman-Coulter | A63882 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification beads |
| Digital electrophoresis chips and kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Agilent High Sensitivity DNA chips and kit |
| Digital electrophoresis system | Agilent Technologies | G2939AA | Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer |
| Streptavidin Beads | ThermoFisher Scientific | 65306 | Dynabeads M-270 Streptavidin |
| ImmunoPrism Kit – 24 reaction | Cofactor Genomics | CFGK-302 | Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit – 24 reactions |
| Human Cot-1 DNA | ThermoFisher Scientific | 15279011 | Invitrogen brand |
| Magnetic separation rack | Alpaqua/Invitrogen | A001322/12331D | 96-well Magnetic Ring Stand |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22620701 | |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2600 | USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube |
| NextSeq550 | Illumina | SY-415-1002 | Any Illumina sequencer may be used for this protocol |
| Nuclease-free water | ThermoFisher Scientific | AM9937 | |
| Prism Extraction Kit | Cofactor Genomics | CFGK-401 | Cofactor Prism FFPE Extraction Kit – 24 samples |
| Purified RNA | - | - | Purified from human tissue samples |
| Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | Qubit 4 System |
| Fluorometric Assay Tubes | Axygen | PCR-05-C | 0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps |
| High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit | Life Technologies | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| Vacuum concentrator | Eppendorf | 22820001 | VacufugePlus |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| Water bath or heating block | VWR/USA Scientific | NA/2510-1102 | VWR water bath/USA Scientific heating block |
References
- Brambilla, E., et al. Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).
- Iacono, D., et al. Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations. Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).
- Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).
- Sierant, M. C., Choi, J. Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools. Genomics Inform. 16, (2018).
- Klauschen, F., et al. Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning. Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).
- Danaher, P., et al. Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).
- Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape. Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).
- Newman, A. M., et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).
- Becht, E., et al. Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression. Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).
- Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. Data normalization considerations for digital tumor dissection. Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).
- Chen, S. H., et al. A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues. BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).
- Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nature Communications. 4, 2612 (2013).
- Foley, J. W., et al. Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ. Genome Research. , (2019).
- Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482 (2019).
- PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO. , OncologyPRO. https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer (2019).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs. JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Schillebeeckx, I., et al. Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting. Journal of Molecular Diagnostics. 21, Baltimore, MD. (2019).
- Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma. Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).
- Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer. Human Pathology. 69, 110-117 (2017).
- Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting. Cancer Research. 79 (13 Suppl), Atlanta, GA. (2019).
