Summary
Ядерные поверхностные спреды являются незаменимым инструментом для изучения хромосомных событий во время мейоза. Здесь мы демонстрируем метод подготовки и визуализации мейотических хромосом во время профазы I из сперматозитов зебры.
Abstract
Meiosis является ключевым клеточным процессом, необходимым для создания гаплоидных гамет для полового размножения. Модельорганизмов сыграли важную роль в понимании хромосомных событий, которые происходят во время мейотической профазы, включая спаривание, синапсис и рекомбинации событий, которые обеспечивают надлежащую сегрегацию хромосомы. Хотя мышь была важной моделью для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов, не все мейотические события в этой системе аналогичны человеческому мейозу. Недавно мы продемонстрировали захватывающий потенциал зебры в качестве модели человеческого сперматогенеза. Здесь мы подробно описываем наши методы визуализации мейотических хромосом и связанных с ними белков в хромосомных препаратах. Преимущество этих препаратов позволяет проводить анализ хромосомных хромосомных структур с высоким разрешением. Во-первых, мы описываем процедуру вскрытия яичек от взрослых зебр, а затем диссоциации клеток, лиза и распространения хромосом. Далее мы описываем процедуру обнаружения локализации мейотических хромосомных белков путем обнаружения иммунофлуоресценции и последовательностей нуклеиновых кислот путем флуоресценции на месте гибридизации (FISH). Эти методы представляют собой полезный набор инструментов для цитологического анализа мейотического хроматина архитектуры в системе зебрафиш. Исследователи в сообществе зебры должны быть в состоянии быстро освоить эти методы и включить их в свой стандартный анализ репродуктивной функции.
Introduction
Сексуальное размножение происходит через сочетание двух гаплоидных гамет, каждый из которых несет половину хромосомного дополнения соматической клетки. Meiosis является специализированным делением клеток, который производит гаплоидные гаметы через один раунд репликации ДНК и два последовательных раунда сегрегации хромосомы. В профазе I гомологичные хромосомы (омологи) должны пройти спаривание, рекомбинацию и синапсис, последний из которых характеризуется образованием синаптонемного комплекса, состоящего из двух омологовых осей, мостовых поперечной нитью, Sycp1(Рисунок 1A, B). Неспособность должным образом выполнить эти процессы может привести к производству анеуплоидных гамет, которые являются основной причиной выкидышей у людей1. Наши знания о координации между сопряжением, рекомбинации и синапсиса было облегчено исследований в широком диапазоне организмов, таких как дрожжи, C. elegans, мышь, и Drosophila, среди других2. В то время как общий процесс гомологичных хромосомных спаривания с последующим сегрегацией хорошо сохраняется, его зависимость от рекомбинации и синапсиса и порядок этих событий варьируется.
Мейотическое двухструное разрыв (DSB) образование, которое инициирует гомологичную рекомбинацию, происходит вблизи теломер, сгруппированных в букете во время лептотена и синапсиса вытекает вскоре после3,4. Эта конфигурация формирования DSB и синапсис инициации также является характеристикой мужского мейоза у людей, но не в мыши5,6,7,8, предполагая, что зебрафиш может служить моделью для человеческого сперматогенеза. Есть также несколько практических преимуществ изучения зебрафиш мейоз. Как мужчины, так и самки проходят гейттогенез на протяжении всей взрослой жизни, их гонады легко доступны, и сотни потомства генерируются из одного креста. Кроме того, эмбрионы прозрачны и развиваются внешне, что облегчает раннее выявление аберраций в эмбриональном развитии из-за анеуплоидных гамет3,9. Недостатки использования зебры в том, что они медленно достигают половой зрелости (60 дней), а количество материала, необходимого для ядерных поверхностных спредов, должно быть собрано у взрослых животных в зависимости от их размера.
Препараты мейотической хромосомы являются жизненно важным инструментом для изучения динамики хромосом во всех модельных организмах, так как ключевые признаки динамики мейотической хромосомы могут быть исследованы. В зебрафиш, ключевые аспекты прогрессирования мейотической программы и ядерной организации были расчленены путем зондирования ядерных поверхностных спредов, упомянутых здесь как хромосомные спреды, с антителами для иммунофлюоресценции обнаружения белков и / или нуклеиновых кислот FISH3,4,9,10,11,12. Действительно, поляризованная локализация кластерных теломер в букете может быть сохранена в спред-препарате(рисунок 1С). В последнее время мы использовали зебра фишка сперматозоидов хромосомы распространяется вместе с методами обнаружения флуоресценции и супер-разрешение микроскопии, чтобы выяснить детальное прогрессирование динамики теломер зебры, гомологические хромосомы сопряжения, двойной нитны перерыв локализации, и синапс и синапсис на ключевых мейотических переходов3. Здесь мы представляем методы подготовки хромосомных спредов из сперматозитов яичек зебры, а затем окрашиваем их флуоресцентными пептидными нуклеиновыми кислотами (ПНА) зондами для повторных последовательностей теломер и иммунофуфрезесценции, связанных с белками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, связанные с зебрафиш были выполнены с использованием этических стандартов, утвержденных Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе.
1. Процедура распространения хромосомы
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол предназначен для создания 4-6 слайдов, с сотнями распространенных мейотических ядер на слайд. Количество используемых яичек будет зависеть от размера рыбы. Будьте в состоянии использовать 20 животных на 60 дней после оплодотворения (dpf) и 15 животных на 6 месяцев после оплодотворения (mpf). Для крупных зебр (например, 12 миль на галлон) 10 животных должно быть достаточно. Имейте в виду, что яички некоторых мейотических мутантов (например, spo11-/-) будет несколько меньше3. В этом протоколе один пул яичек рассматривается как единый образец. Параллельно рекомендуется готовить не более 4 образцов.
- Сделайте следующие решения перед началом процедуры распространения
ПРИМЕЧАНИЕ: Удобно готовить следующие решения в количествах, указанных для использования в будущих экспериментах по распространению.- Подготовьте раствор сахарозы 0,1 М путем растворения 3,42 г сахарозы в 100 мл дистиллированной воды. Принесите сахарозы решение рН 8 с помощью 1 M Tris-HCl, который также на рН 8. Затем фильтр стерилизовать раствор сахарозы. Хранить при комнатной температуре.
- Сделать 10x фосфат-буферный солен (PBS) стокового раствора до конечной концентрации 1,37 М NaCl, 27 мМ KCl, 73 мМ Na2HPO4 и 27,6 мМ KH2PO4 в 1,8 л дистиллированной воды. Перемешать до растворения, а затем настроить рН до 7,3 с помощью NaOH и autoclave. Хранить при комнатной температуре.
- Сделать 400 мг /мЛ DNase I раствор в стерильной дистиллированной воде. Хранить при -20 градусах по Цельсию. Рекомендуется подготовить 5 мл этого раствора, а затем хранить в качестве 100 аликвот.
- Сделать следующие решения в день распространения протокола
ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективности времени, лучше всего сделать коллагеназный раствор сразу после вскрытия всех яичек, а затем сделать трипсин и трипсина ингибитор решения в то время, что образцы лечатся в коллагеназе.- Растворите 4 мг коллагеназа в 200 qL модифицированной среды Орла Dulbecco (DMEM) на образец (2% w/v коллагеназа окончательная концентрация). Держите на льду до тех пор, пока это необходимо. Коллагенеза будет разъединять яички.
- Растворите 1,4 мг трипсина в 200 ЗЛ DMEM на образец (0,7% w/v конечной концентрации трипсина). Держите на льду до тех пор, пока это необходимо. Трипсин поможет разъединить клетки.
- Растворите 10 мг ингибитора трипсина в 500 Л DMEM на образец (2% w/v трипсинингингинг окончательный концентрации). Держите на льду до тех пор, пока это необходимо. Ингибитор трипсина предотвращает трипсин от деградации клеток.
- Приготовьте раствор формальдегида 1% (из 16% готового раствора) с 0,15% Triton X-100 в стерильной дистиллированной воде. Держите на льду до тех пор, пока это необходимо. 1% формальдегида может быть подготовлен в то время как яички лечатся с трипсином и DNase I (т.е. во время шага 1.4.7 процедуры распространения).
ВНИМАНИЕ: Формальдегид опасен.
- Рассечение яичек от взрослых самцов зебры
- Эвтанизировать самца зебры (Зgt; 60 dpf), погрузив их в ледяную воду. Рыбу можно хранить в ледяной воде до готовности к вскрытию, однако ее следует как можно скорее вскрыть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм дикого типа AB используется для этой процедуры, но другие штаммы дикого типа также должны быть поддаются. Самое долгое время, когда мы держали рыбу в ледяной воде до вскрытия, составляет 3 ч без какого-либо заметного влияния на протокол. - Обезглавить одну рыбу за один раз с помощью небольших ножниц, а затем использовать микро ножницы, чтобы сократить вдоль брюшной средней линии подвергать полости тела.
- Вскрыть яички с помощью щипц (см. Таблица материалов) на 1,65x увеличение под микроскопом. Проведите вскрытия в силиконовой шерсти чашку Петри с покрытым неглубоким бассейном 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Яичный материал находится между плавательным пузырем и кишечником и будет выглядеть легче, чем мышечная ткань(рисунок 2A). Яичек должны иметь 2 доли при удалении из зебры(Рисунок 2B). - Удалите как можно больше жира и окружающих тканей из яичек, как это возможно. Затем добавьте каждый расчлененный яичек непосредственно в трубку 5 мл с 2 мл DMEM и держать на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.3.3 и 1.3.4 должны быть освоены до проведения любых экспериментов.
- Эвтанизировать самца зебры (Зgt; 60 dpf), погрузив их в ледяную воду. Рыбу можно хранить в ледяной воде до готовности к вскрытию, однако ее следует как можно скорее вскрыть.
- Диссоциация яичек
- Предварительно подогрев10 мл сахарозного раствора 0,1 М до 37 градусов по Цельсию.
- Добавьте 200 злколлазе в трубку 5 мл с яичками. Смешайте раствор, инвертируя его несколько раз.
- Аккуратно встряхните яички в шейкере-инкубаторе горизонтально при 100 об/мин при 32 градусах по Цельсию в течение 50 минут до тех пор, пока DMEM не будет облачным и яички не будут небольшими кусками. Быстро инвертировать трубку каждые 10 минут, чтобы облегчить диссоциацию.
- Чтобы промыть коллагенеза, добавьте DMEM в окончательный объем 5 мл и несколько раз инвертировать трубку. Пеллетя яички на 200 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Удалите 3 мл супернатанта так, чтобы оставалось только 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление, удаление и передача DMEM делается с пластиковыми пипетками передачи для всей процедуры распространения хромосомы. - Повторите шаг 1.4.4 в два раза больше для итогового 3 DMEM смывов. Не приостанавливайте действие гранул между dMEM.румает. После последней мытья DMEM, удалить 4 мл супернатанта так, что только 1 мл остается.
- Добавьте 1 мл DMEM общим объемом 2 мл и добавьте 200 л раствора трипсина и 20 л раствора DNase I. Перевернуть трубку несколько раз, чтобы смешать раствор.
- Горизонтально встряхните трубку при 32 градусах по Цельсию в течение 5-15 мин при 100 об/мин до тех пор, пока раствор DMEM не содержит лишь несколько комков. Быстро инвертировать трубку каждые 5 минут, чтобы облегчить диссоциацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Комки должны быть значительно меньше после встряхивания. - Добавьте 500 зл и 50 0л раствора ингибитора трипсина и 50 Зл раствора DNase I. Перевернуть трубку несколько раз, чтобы смешать, а затем кратко спина вниз на 200 х г в течение 3 мин при комнатной температуре, чтобы удалить жидкость или комки, которые могут придерживаться трубки крышка или стороне трубки.
- Поместите трубку на лед и resuspend подвески клетки, неоднократно pipetting вверх и вниз с пластиковой передачи пипетки в течение 2 минут для облегчения диссоциации любых оставшихся сгустков. Не позволяйте подвеске клетки войти в луковицу перекладины. После 2 мин, пипетка подвески обратно в трубку 5 мл.
- Предварительно промокните 100 мкм ячейки ситечко с DMEM и поместите его на вершине 50 мл трубки на льду.
- Передача подвески ячейки через ситечко одну каплю за один раз с помощью пластиковой передачи пипетки. Убедитесь, что суспензия ячейки не попадает в лампу переносного пипетки.
- Перенесите фильтрат с помощью пластиковой трубки передачи на новую трубку 5 мл и добавьте DMEM до конечного объема 5 мл. Обязательно соберите объединенные ячейки, прикрепленные к нижней стороне фильтра, с помощью чистой пластиковой трубки для переноски. Пеллетклетки на 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулы.
- Добавьте 5 зл и раствор DNase I непосредственно в гранулы. Затем смешайте гранулы с раствором DNase I, аккуратно соскребая внешнюю нижнюю часть трубки 4-5 раз вдоль пустой 1,5 мл микроцентрифуговой трубки стойки. Слишком жесткое соскоб может привести к уменьшению восстановленных спредов.
- Добавьте DMEM в окончательный объем 5 мл и смешайте раствор, несколько раз перевернув трубку. Она является общей для сгустков по-прежнему присутствовать после первого лечения DNase I.
- Пеллетия клеточной подвески на 200 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Повторите шаги 1.4.13-1.4.16 еще 1-3 раза, пока повторно еле не слипаются при добавлении DMEM. После последнего спина, удалить столько супернатант, как это возможно, не нарушая гранулы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидать сокращения размера гранул с каждым DNase I лечения; превышение 4 общей DNase I смеет может привести к значительной потере клеток. Если гранулы не видны после DNase I шаги лечения, не приступайте к процедуре. Откажитесь от неиспользованных DNase I. - Добавьте 1 мл 1x PBS и resuspend гранулы, аккуратно соскоб наружную нижнюю часть трубки вдоль пустой 1,5 мл трубки стойки.
- Гралет клеточной подвески на 200 х г в течение 5 минут, то удалить столько супернатант, как это возможно, не нарушая гранулы.
- Вырезать 3 мм от конца 200 л пипетки отзыв, чтобы расширить диафрагму и resuspend гранулы в 80 qL 0,1 М сахарозы решение пайпеткой вверх и вниз с разрезаpip наконечником. Пусть клеточная подвеска сидит при комнатной температуре в течение 3 мин.
- Распространение хромосом на стеклянные горки
- Пальто один слайд с 100 л 1% формальдегида с 0,15% Тритон X-100 со стороной кончика пипетки. Затем добавьте 18 л сахарозной подвески клеток на центр слайда по прямой линии перпендикулярно длинному краю. Наклоните горку вперед и назад (60 евро), чтобы облегчить распространение подвески ячейки на все углы.
- Поместите слайды плашмя вниз в слегка трещины открытой влажности камеры (Рисунок 3), чтобы предотвратить раствор формальдегида от сушки. Поместите камеру влажности в темный ящик на ночь.
- Снимите крышку с камеры влажности и дайте слайдам полностью высохнуть.
- Поместите горки в банку Коплин затем заполнить банку Коплин с дистиллированной водой и инкубировать в течение 5 минут с нежной тряски при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут быть помещены в банку Коплин в зигзагообразном рисунке, чтобы максимизировать количество слайдов на банку Коплин. Убедитесь, что есть место для жидкости, чтобы пройти между всеми слайдами. - Вылейте воду и заполните банку с 1:250 смачивания агента (см. Таблица материалов). Вымойте 2 раза в течение 5 минут каждый с нежной тряской при комнатной температуре.
- Разрешить слайды полностью высохнуть и хранить при -20 градусов по Цельсию, пока они не окрашены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самый длинный мы сохранили слайды без каких-либо заметных деградации хромосом составляет 2 месяца.
2. Теломер ПНА зонд окрашивания
ПРИМЕЧАНИЕ: Telomere повторяется может быть окрашены с помощью фторофора конъюгированных теломер PNA зондов, которые гибридизируются на ведущих нити теломер повторяется (CCCTAA). Зонды PNA имеют нейтральную основу, что увеличивает сродство гибридизации к отрицательно заряженной ДНК, в результате чего практически нет фона. Шаг зондирования теломер является необязательным. Чтобы перейти к окрашиванию антител, регидратные слайды в 1x PBS, как указано в шаге 2.2.2., а затем перейти непосредственно к "Первичное окрашивание антител".
-
Сделать PNA зонд реагентов перед началом теломер окрашивания
ПРИМЕЧАНИЕ: Удобно готовить следующие решения в количествах, указанных для использования в будущих экспериментах. Условия хранения приведены ниже.- Приготовьте 2 l 20x солен-натрия цитрата (SSC) раствор с окончательной концентрацией 3 M NaCl и 0.3 M цитрат натрия. Автоклав и хранить при комнатной температуре.
- Сделайте 50 мл раствора предварительной гибридизации, содержащего перенос РНК, в окончательную концентрацию 50% формамида, 5x SSC, 50 мкг/мл гепарина, 500 мкг/мл переноса РНК, 0,1% Tween 20 и добавить 460 л лимонной кислоты, чтобы довести раствор до рН No 6. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
ВНИМАНИЕ: Формамид опасен. Подготовьте раствор в дымящийся капюшон. - Сделайте 50 мл раствора предварительной гибридизации, подготовленного так же, как и в шаге 2.1.2 без добавления переноса РНК. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
- Зонды PNA telomere TelC-Cy3 и TelC-Alexa647 готовятся в виде 50 запасов мкм в формеамиде в соответствии с инструкциями производителя. Храните зонды PNA в виде аликвот оверок 8 qL при -80 градусах по Цельсию.
- Сделать не менее 1 мл 100 мг/мл бульонного раствора бычьего сывороточных вин (BSA) в стерильной дистиллированной воде. Хранить при -20 градусах по Цельсию. При приготовлении более 1 мл акций BSA, храните раствор в виде 1 мл aliquots.
- Используя трубку 2 мл, подготовьте 2 мл раствора гибридизации, добавив 27 л 100 мг/мл BSA и 8 л из 50 мм зонда PNA до 1,965 мл раствора предварительной гибридизации, содержащего перенос РНК. Хранить в темноте при -20 градусах по Цельсию.
-
PNA теломер зонд окрашивания
- Разогреть духовку гибридизации до 82 градусов по Цельсию.
- Re-гидрат слайды с 500 л 1x PBS на слайд в течение 5 минут в камере влажности при комнатной температуре. Удалите PBS, нажав на сторону слайда на бумажном полотенце.
- Нагрейте горки и трубку 2 мл, содержащую раствор гибридизации непосредственно на металлической поверхности в разогретой печи гибридизации в течение 2 мин.
- Сохраняя слайды на металлической поверхности, добавьте 100 qL раствора гибридизации на слайд, а затем покройте слайды пластиковыми крышками (25 мм х 75 мм), вырезанными по форме из автоклавного мешка. Пусть слайды сидеть на 82 градусов по Цельсию в течение 10-12 мин.
- Поместите горки в камеру влажности в темноте при 37 градусах по Цельсию в течение 16-24 ч. С этого момента и для первичного и вторичного окрашивания антител, слайды должны храниться в темноте, чтобы избежать фотоотбеления сигнала флуоресценции. После инкубационного периода реагенты для окрашивания антител можно подготовить в течение шага 2.2.9.
- Удалите крышки с помощью наконечника пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения удаления coverslip, 50-100 qL раствора гибридизации без передачи РНК может быть мягко обойтись между слайдом и крышкой, как coverslip в настоящее время отменены. - Pipette 500 л предварительно гибридизации раствор без передачи РНК на каждом слайде и место слайды в камере влажности в течение 15 минут при комнатной температуре. Удалите раствор, нажав на сторону слайда на бумажное полотенце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Решение предварительной гибридизации без переноса РНК не предварительно нагревается до добавления на каждый слайд. - Pipette 500 л 50% до гибридизации раствор без передачи РНК в 1x PBS на каждый слайд и место слайды в камере влажности в течение 15 минут при комнатной температуре. Удалите раствор, нажав на сторону слайда на бумажное полотенце.
- Перенесите слайды в банку Коплин и промойте 3 раза в 1x PBS с нежной тряской в течение 15 минут за стирку при комнатной температуре.
- Удалите слайды из банки Коплин и удалить избыток PBS, нажав сторону слайда на бумажное полотенце. Затем приступаем к шагу 3.2 "Первичное окрашивание антител".
3. Окрашивание антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела, поднятые на известные мейотические белки могут быть использованы для иммунофлуоресценции обнаружения в распространении хромосомы препаратов. Вторичные антитела, спряженные с различными флюорофорами, позволяют одновременно запятнать несколько белков, если первичные антитела были подняты у разных животных.
-
Сделайте следующие решения в день первичного и вторичного окрашивания антител
- Сделать 1 L PBT с 1x PBS и 0,1% Тритон X-100 разбавленной в дистиллированной воде. Хранить при комнатной температуре. Это может быть подготовлено заранее и в больших количествах для будущих экспериментов распространения.
- Приготовьте 500 кл блока антител на слайд до конечной концентрации 2 мг/мл BSA и 2% козьей сыворотки в ПБТ.
- Чтобы сделать 100 л первичной или вторичной смеси антител на слайд, добавьте соответствующие антитела в правильной концентрации (см. Таблица материалов)в блок антитела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антител может быть определена эмпирически. В обсуждении, мы включаем список антител мы пробовали с успехом (с разбавления / концентрации) и те, которые мы пытались без успеха.
-
Первичное окрашивание антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Кролик анти-человека SCP3 и курица анти-зебрафиш Sycp1, как правило, используются для первичного окрашивания антител.- После удаления избыточного PBS со слайдов, добавить 500 л блока антител на слайд и поместите слайды в камере влажности при комнатной температуре в течение как минимум 20 минут.
- Удалите блок антител, нажав на сторону слайда на бумажном полотенце.
- Добавьте 100 злитроблоков первичного антитела в блок е антитела на слайд и накройте слайды пластиковым покрытием, сделанным из автоклавного мешка. Поместите горки в камеру влажности на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Удалите крышки с наконечником пипетки и мыть слайды 2 раза в течение как минимум 5 минут каждый с 1x PBS в банку Коплин с нежной тряской при комнатной температуре.
- Удалите PBS, нажав на сторону слайда на бумажном полотенце.
-
Вторичное окрашивание антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Конъюгированные козы анти-кролик а анти-кроличьи и анти-куриные антитела к различным флюорофорам используются для окрашивания при концентрации 1:1000.- Добавьте 500 кл. блока антител на слайд и поместите горки в камеру влажности при комнатной температуре в течение как минимум 5 минут.
- Удалите блок антител, нажав на сторону слайда на бумажном полотенце.
- Добавьте 100 злитровых антител в блок антител на слайд и накройте слайды пластиковым покрытием, сделанным из автоклавного мешка. Поместите горки в камеру влажности на 1 ч при 37 градусах Цельсия.
- Удалите крышки с наконечником пипетки и мыть слайды 3 раза в течение как минимум 5 минут каждый с 1x PBS в банку Коплин с нежной тряской при комнатной температуре.
- Промыть слайды один раз в течение как минимум 2 мин с дистиллированной водой в банку Коплин с нежной тряской при комнатной температуре.
- Воздух сушить горки наклонены, чтобы облегчить сушки.
- Поместите 20 зл анти-увядающей монтант с или без DAPI (см. Таблица материалов)в виде 3 равномерно расположенных точек на стеклянных крышках (24 мм х 60 мм).
- Поместите слайды лицом вниз на стеклянные крышки затем печать coverslips с лаком для ногтей на краю перекрытия матовый конец слайда.
- Храните подготовленные слайды при 4 градусах Цельсия до готовности к визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы наметили метод для подготовки и визуализации зебрафиш сперматоцитов распространения препаратов. При правильном выполнении наша процедура дает хорошо спред, не перекрывающиеся ядра. Чтобы восстановить такие ядра, важно иметь соответствующее количество исходного материала (т.е. яички), лечить яички в течение достаточного периода времени в трипсине и достаточное количество DNase I лечения. Эти спреды могут быть окрашены для теломер и мейотических белков для изучения мейотической прогрессии во время профазы I. Рисунок 1 изображает примеры спреда препаратов окрашенных для хромосомных особенностей на разных стадиях профазы I. Рисунок 4 иллюстрирует пример плохо распространенных ядер.
Рисунок 1: Представитель супер-разрешение изображения хромосомных препаратов распространения окрашенных PNA и антитела зондов. (A) Схема синаптонемного комплекса. (B) Синапсированная пара омологов, показывающих протеин оси хромосомы Sycp3 (зеленый), поперечный белок нити Sycp1 (красный), и ДНК (синий) изображение структурной микроскопии освещения (SIM) с использованием 100x цели. Шкала бар No 1 мкм. (C) Панели слева показывают три этапа мейотической профазы: лептотен (вверху), ранне-зиготен (средний) и пахитен (внизу). Бар шкалы 5 мкм. Справа: репрезентативные изображения, содержащие теломеры (магента) для каждого этапа. Шкала бар No 1 мкм. Цифры адаптированы из Блохина и др.3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Пример яичек зебры (7 месяцев после оплодотворения). (A) Изображение показывает относительное расположение яичек в зебры. Яичек сидит между плавательный пузырь и кишечник. (B) Длина яичка. Младшие зебры будут иметь меньшие яички. Для хромосомы распространяется, удалить как можно больше жира и окружающих тканей, как это возможно из яичка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Камера влажности для слайдов. Наша камера влажности изготовлена с использованием полистирола пены поле (21 см х 19 см х 6 см), предназначенных для отправки электропорации кювет. Мы вставили влажные тонкие салфетки ткани (см. Таблица материалов)в любой другой паз. Горки расположены на плоской вершине хребтов, не касаясь влажных салфеток. Также доступна коммерческая камера влажности (см. Таблицу Материалов). Мы предвидим, что любой полистирол пены окно оснащено хребтов и канавки (например, с использованием стеклянных пипетки13) могут быть использованы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Примеры некачественных спредов из-за недостаточного лечения DNase I. Меотические хромосомы, окрашенные для Sycp3, изображенных SIM с помощью 20-кратной цели. Недостаточное лечение DNase I приводит к перекрывающимся ядрам из-за вязкой сахарозной суспензии, которая предотвращает правильное распространение клеток на слайде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Примеры хромосомы распространяется с использованием альтернативного метода11. Мейотические хромосомы, окрашенные для Sycp3 (зеленый) и Sycp1 (красный). Хромосомные спреды были подготовлены, как описано Sansam и Pezza11. Этот метод может быть выполнен с использованием отдельных зебры, а не несколько зебры, необходимых для нашего протокола. В наших руках часто встречаются хромосомы, которые плохо распространяются. Существует также заметное увеличение фонового окрашивания, что результаты от мусора, который остается на слайдах во время процедуры распространения хромосомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем методы зондирования расположения теломер и хромосо-связанных белков в ядерной поверхности распространяется из сперматоцитов, изолированных от яичек зебры. Мы ожидаем, что эти методы будут применимы для анализа сперматоцитов у других видов телеост с корректировкой на размер яичек.
Хотя только несколько антител были подняты на зебрафиш мейотических белков, мы имели успех, используя следующие антитела, поднятые на человека (h) или мыши (м) белков. Наша лаборатория подняла антитела к зебрафиш Sycp1 белка (zfSycp1) в курицу, которая служила надежным маркером для синаптонемного комплекса (SC), однако, этот белок присутствует только от раннего зиготена до позднего пахитена, когда хромосомы полностью синапсированы. Кролик анти-hSYCP3 антитела был очень надежным для обнаружения мейотических хромосомных осей от лептотена до растворения SC в конце pachytene (Рисунок 1B, C). Примечательно, что мы не наблюдали классической стадии диплота с полнометражными топорами, определенными Sycp3, и отсутствием Sycp1, предполагая, что, в отличие от мыши, топоры могут деградировать после выхода из pachytene3. Другие коммерчески доступные антитела к m, h или zf meiotic протеинам которые давали положительные результаты также вклюают рекомбинацию/репликацию кролика anti-hRAD51 и anti-hRPA кролика. Источник каждого используемого антитела и разбавления указаны в таблице материалов. Те, кого мы пытались без успеха, используя по крайней мере три различных разбавления включают коза анти-hDMC1, мышь анти-hMlh1, мышь анти-хомяк Sycp3, мышь анти-hRPA.
Существует три критических этапа процедуры распространения хромосом. Первый сбор нужного количества материала. Пятнадцать нетронутых яичек должно быть достаточно для протокола распространения для самцов мф, и это число может быть скорректировано вверх или вниз в зависимости от размера животных. Имейте в виду, что некоторые мейотические мутанты будут иметь меньшие яички, поэтому 2 дополнительных животных должны быть использованы. Вторым важным шагом является разобщение клеток. Во время пищеварения трипсина, если яички не отделяются на небольшие комки, вполне вероятно, что слишком мало клеток будет восстановлено после процедуры распространения. Третьим ключевым шагом является наличие видимых гранул после лечения DNase I. Если гранулы не видны, вполне вероятно, что процедура распространения даст практически нет ядер. Потеря гранул может возникнуть, если слишком мало животных используются или если слишком много DNase я моет осуществляется. С другой стороны, слишком мало DNase I лечения может привести к висксовой сахарозы клеточной суспензии, которая предотвратит клетки от распространения на слайде (Рисунок 4). Важно продолжать выполнять DNase I лечения (максимум 4 лечения) до тех пор, пока сгустки больше не присутствуют при добавлении DMEM.
Представленная техника распространения хромосом дает сотни хорошо распространенных ядер на слайд. Используя эту процедуру, мы смогли обеспечить подробный анализ ключевых событий во время сперматогенеза зебры, используя супер-разрешение микроскопии3. В наших руках, этот протокол вызвал лучшее распространение хромосомы, с меньшим количеством мусора на слайде, и меньше фоновых окрашивания по сравнению с более быстрыми методами с использованием отдельных животных, описанных Moens14 и Sansam и Pezza11 (Рисунок 5). Эти различия, вероятно, из-за использования коллагеназы, трипсина и DNase лечения в нашем протоколе. Двумя ограничениями нашей техники являются требование использования 10-20 взрослых самцов зебры и более трудоемкие ферментные процедуры и стиральные шаги. Если обнаружение суперразрешения не требуется, если материал зебры ограничен, или более двух условий тестируются параллельно, тем быстрее методы могут быть более подходящими альтернативами14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Трента Ньюмана и Масуду Шарифи за комментарии к рукописи и An Nguyen за помощь в оптимизации методов распространения и окрашивания хромосом от зебры миоцитов. Эта работа была поддержана NIH R01 GM079115, присужденной S.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
