Summary
Nukleare overflade spreads er et uundværligt redskab til at studere kromosom begivenheder under meiose. Her demonstrerer vi en metode til at forberede og visualisere meiotiske kromosomer under profase I fra zebrafisk spermatocytter.
Abstract
Meiosis er den vigtigste cellulære proces, der kræves for at skabe haploid gameter til seksuel reproduktion. Modelorganismer har været medvirkende til at forstå de kromosomhændelser, der finder sted under meiotiske profase, herunder parrings-, synapsis- og rekombinationshændelser, der sikrer korrekt kromosomadskillelse. Mens musen har været en vigtig model for at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse processer, er det ikke alle meiotiske hændelser i dette system, der svarer til menneskelig meiose. Vi har for nylig vist zebrafiskens spændende potentiale som en model af human spermatogenese. Her beskriver vi i detaljer vores metoder til at visualisere meiotiske kromosomer og tilhørende proteiner i kromosomspredende præparater. Disse præparater har den fordel, at de tillader høj opløsningsanalyse af kromosomstrukturer. For det første beskriver vi proceduren for dissekere fra voksne zebrafisk, efterfulgt af celledissociation, lysis og spredning af kromosomerne. Dernæst beskriver vi proceduren for påvisning af lokalisering af meiotiske kromosomproteiner ved immunofluorescensdetektion og nukleinsyresekvenser ved fluorescens in situ hybridisering (FISH). Disse teknikker omfatter et nyttigt sæt værktøjer til cytologisk analyse af meiotisk kromatinarkitektur i zebrafisksystemet. Forskere i zebrafisk samfund bør være i stand til hurtigt at mestre disse teknikker og indarbejde dem i deres standard analyser af reproduktiv funktion.
Introduction
Seksuel reproduktion fortsætter gennem kombinationen af to haploid gameter, der hver bærer halvdelen af kromosomkomplementet af en somatiske celle. Meiosis er en specialiseret celledivision, der producerer haploid gameter gennem en runde af DNA replikation og to på hinanden følgende runder af kromosom adskillelse. I profase I skal homologiske kromosomer (homologer) gennemgå parring, rekombination og synapsis, hvoraf sidstnævnte er karakteriseret ved dannelsen af synaptonemal komplekset, der består af to homologakser, der er brooveret af den tværgående glødetråd, Sycp1 (Figur 1A, B). Manglende korrekt udføre disse processer kan føre til produktion af aneuploid gameter, som er en førende årsag til aborter hos mennesker1. Vores viden om koordineringen mellem parring, rekombination og synapsis er blevet lettet af undersøgelser i en bred vifte af organismer, såsom gær, C. elegans, mus, og Drosophila, blandt andre2. Mens den generelle proces med homolog kromosom parring efterfulgt af adskillelse er godt bevaret, dens afhængighed af rekombination og synapsis og rækkefølgen af disse begivenheder varierer.
Meiotisk dobbelt-streng pause (DSB) dannelse, som indleder homologre rekombination, forekommer nær telomeres grupperet i buketten under leptotenog synapsis opstår kort efter3,4. Denne konfiguration af DSB dannelse og synapsis indledning er også et karakteristisk træk ved mandlig meiose hos mennesker, men ikke i mus5,6,7,8, tyder på, at zebrafisk kan tjene som model for menneskelige spermatogenese. Der er også flere praktiske fordele ved at studere zebrafisk meiose. Både mænd og kvinder gennemgår gametogenese gennem hele voksenalderen, deres gonader er let tilgængelige, og hundredvis af afkom genereres fra et enkelt kors. Desuden er embryonerne gennemsigtige og udvikler sig eksternt, hvilket letter tidlig påvisning af afvigelser i embryonal udvikling på grund af aneuploid kønsceller3,9. Ulemper ved at bruge zebrafisk er, at de er langsomme til at nå seksuel modenhed (~ 60 dage), og mængden af materiale, der er nødvendige for nukleare overflade spreads skal indsamles fra ~ 10-20 voksne dyr, afhængigt af deres størrelse.
Meiotiske kromosompræparater er et vigtigt redskab til at studere kromosomdynamik på tværs af alle modelorganismer, da centrale signaturer af meiotisk kromosomdynamik kan undersøges. I zebrafisk, centrale aspekter af udviklingen af det meiotiske program og nukleare organisation er blevet dissekeret gennem sondering nukleare overflade breder sig, benævnt her som kromosom spreads, med antistoffer til immunfluorescens påvisning af proteiner og / eller nukleinsyrer af FISH3,4,9,10,11,12. Faktisk kan den polariserede lokalisering af klyngede telomerer i buketten bevares i spredningen forberedelse (Figur 1C). For nylig har vi brugt zebrafisk spermatocyt kromosom breder sig sammen med fluorescens detektionsmetoder og superopløsning mikroskopi til at belyse den detaljerede progression af zebrafisk telomere dynamik, homolog kromosom parring, dobbelt-streng pause lokalisering, og synapsis på centrale meiotiske overgange3. Her præsenterer vi metoder til at forberede kromosomspreads fra spermatocytter af zebrafisk testiklerne og efterfølgende plette dem med fluorescerende peptid nukleinsyre (PNA) sonder til gentagne telomere sekvenser og immunfluorescens påvisning af kromosom tilknyttede proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der involverede zebrafisk, blev udført ved hjælp af etiske standarder, der blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee hos UC Davis.
1. Kromosom spredning procedure
BEMÆRK: Følgende protokol er designet til at skabe 4-6 dias, med hundredvis af spredt meiotiske kerner pr dias. Antallet af anvendte testikler afhænger af fiskenes størrelse. Forvent at bruge 20 dyr på ~ 60 dage efter befrugtning (dpf) og 15 dyr på ~ 6 måneder efter befrugtning (mpf). For store zebrafisk (f.eks. 12 mpf) bør 10 dyr være tilstrækkelige. Vær opmærksom på, at testiklerne af nogle meiotiske mutanter (f.eks. spo11-/-) vil være noget mindre3. I denne protokol betragtes en pulje af testikler som en enkelt prøve. Det anbefales, at der ikke fremstilles mere end 4 prøver parallelt.
- Gør følgende løsninger, før du starter spredningsproceduren
BEMÆRK: Det er praktisk at forberede følgende løsninger i de mængder, der er angivet til brug i fremtidige spredningsforsøg.- Der fremstilles en 0,1 M saccharoseopløsning ved at opløse 3,42 g saccharose i 100 ml destilleret vand. Bring saccharoseopløsningen på pH 8 ved hjælp af 1 M Tris-HCl, der også er på pH 8. Filtrer derefter sterilisere saccharoseopløsningen. Opbevares ved stuetemperatur.
- Lav en 10x fosfat-buffered saltvand (PBS) lager opløsning til en endelig koncentration på 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 og 27,6 mM KH2PO4 i 1,8 L destilleret vand. Rør indtil opløst, derefter justere pH til 7,3 ved hjælp af NaOH og autoklave. Opbevares ved stuetemperatur.
- Lav en opløsning på 400 μg/ml DNase i sterilt destilleret vand. Opbevares ved -20 °C. Det anbefales at tilberede 5 ml af denne opløsning og derefter opbevares som 100 μL aliquots.
- Gør følgende løsninger på dagen for spredningsprotokollen
BEMÆRK: For tidseffektivitet er det bedst at lave kollagenopløsningen umiddelbart efter dissekeringen af alle testikler og derefter lave trypsin- og trypsinhæmmereløsningerne i den tid, prøverne behandles i kollagen.- 4 mg kollagennase opløses i 200 μL af Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) pr. prøve (2% w/v collagenase endelig koncentration). Hold på is, indtil det er nødvendigt. Kollagenvil adskille testiklerne.
- 1,4 mg trypsin opløses i 200 μL DMEM pr. prøve (0,7 % w/v trypsin seneste koncentration). Hold på is, indtil det er nødvendigt. Trypsin vil hjælpe med at adskille cellerne.
- 10 mg trypsinhæmmer opløses i 500 μL DMEM pr. prøve (2% w/v trypsinhæmmer, endelig koncentration). Hold på is, indtil det er nødvendigt. Trypsinhæmmer forhindrer trypsin i at forringe cellerne.
- Forbered en 1% formaldehydopløsning (fra en 16% færdigopløsning) med 0,15% Triton X-100 i sterilt destilleret vand. Hold på is, indtil det er nødvendigt. Den 1% formaldehyd kan forberedes, mens testiklerne bliver behandlet med trypsin og DNase I (dvs. i løbet af trin 1.4.7 i spredningprocedure).
FORSIGTIG: Formaldehyd er farligt.
- Dissektion af testikler fra voksne mandlige zebrafisk
- Euthanize mandlige zebrafisk (> 60 dpf) ved at nedlægge dem i isvand. Fiskene kan holdes i isvand, indtil de er klar til at dissekere, men de bør dissekeres så hurtigt som muligt.
BEMÆRK: Den vilde type stamme AB anvendes til denne procedure, men andre vilde stammer bør også være modtagelige. Den længste tid, vi har holdt fisk i isvand før dissekere er 3 timer uden nogen mærkbar effekt på protokollen. - Halshugge en fisk ad gangen med små saks og derefter bruge mikro saks til at skære langs ventrale midterlinjen til at udsætte kroppenhulen.
- Dissekere testis ved hjælp af pincet (se Tabel over materialer)ved 1.65x forstørrelse under et mikroskop. Udfør dissections i en silikone-belagt petriskål med dækket af en lavvandet pool på 1x PBS.
BEMÆRK: Testis er placeret i mellem svømmeblæren og tarmen og vil fremstå lettere end muskelvæv (Figur 2A). Testis skal have 2 lapper, når de fjernes fra zebrafisken (figur 2B). - Fjern så meget fedt og omgivende væv fra testis som muligt. Derefter tilsættes hver dissekeret testis direkte i en 5 ml rør med 2 ml DMEM og holde på is.
BEMÆRK: Trin 1.3.3 og 1.3.4 skal beherskes, inden der udføres forsøg.
- Euthanize mandlige zebrafisk (> 60 dpf) ved at nedlægge dem i isvand. Fiskene kan holdes i isvand, indtil de er klar til at dissekere, men de bør dissekeres så hurtigt som muligt.
- Dissociation af testikler celler
- Forvarm 100 ml 0,1 M saccharoseopløsning til 37 °C.
- Der tilsættes 200 μL kollagenopløsning til 5 ml-røret med testiklerne. Bland opløsningen ved at vende den flere gange.
- Ryst forsigtigt testiklerne i en kuvøse shaker vandret ved 100 omdr./min. ved 32 °C i 50 minutter til en time, indtil DMEM er uklar, og testiklerne er i små bidder. Hurtigt vende røret hver 10 min for at lette dissociation.
- For at vaske kollagennase ud skal du tilføje DMEM til en endelig 5 ml volumen og vende røret et par gange. Pellet testiklerne på ~ 200 x g i 3 min ved stuetemperatur. Fjern 3 ml af supernatantet, så der kun er 2 ml tilbage.
BEMÆRK: Tilsætning, fjernelse og overførsel af DMEM sker med plastoverførselspipetter i hele kromosomspredningsproceduren. - Gentag trin 1.4.4 to gange mere for i alt 3 DMEM vasker. Pelleten må ikke suspenderes igen mellem DMEM-vaske. Efter den sidste DMEM vask, fjerne 4 ml af supernatant, således at kun 1 ml tilbage.
- Tilføj 1 ml DMEM for et samlet volumen på 2 ml, og der tilsættes 200 μL af trypsinopløsningen og 20 μL DNase I-opløsning. Inverter røret et par gange for at blande opløsningen.
- Røret rystes vandret ved 32 °C i 5-15 min ved 100 omdrejninger i minuttet, indtil DMEM-opløsningen kun indeholder nogle få klumper. Hurtigt vende røret hver 5 min at lette dissociation.
BEMÆRK: Klumperne skal være betydeligt mindre efter rystelser. - Der tilsættes 500 μL af trypsinhæmmeropløsningen og 50 μL DNase I-opløsning. Inverter røret et par gange for at blande, derefter kort spin ned på ~ 200 x g i 3 min ved stuetemperatur for at fjerne væske eller klumper, der kan overholde rørdækslet eller siden af røret.
- Anbring røret på is, og celleaffjedringen suspenderes igen ved gentagne gange at pipettere op og ned med en plastoverførselspipette i 2 minutter for at lette dissociation af eventuelle resterende klumper. Lad ikke celleaffjedringen gå ind i pæren på overførselspipette. Efter 2 min, pipette suspensionen tilbage i 5 ml rør.
- Forvåd en 100 μm celle si med DMEM og læg den på toppen af en 50 ml rør på is.
- Overfør celleaffjedringen gennem sien en dråbe ad gangen ved hjælp af en plastoverførsel pipette. Sørg for, at celleaffjedringen ikke går ind i pæren på overførselspipette.
- Overfør filtraten ved hjælp af en plastoverførselspipette til et nyt 5 ml rør, og tilføj DMEM til et endeligt volumen på 5 ml. Sørg for at samle de samlede celler fastgjort til undersiden af filteret med en ren plastoverførsel pipette. Pellet cellerne på ~ 200 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Fjern så meget supernatant som muligt uden at forstyrre pellet.
- Tilsæt 5 μL DNase Jeg opløsning direkte ind i pellet. Bland derefter pellet med DNase Jeg løsning ved forsigtigt skrabe den udvendige bund af røret 4-5 gange langs en tom 1,5 ml mikrocentrifuge rør rack. Skrabning for hårdt kan resultere i en reduktion af genvundne spreads.
- Tilføj DMEM til et endeligt volumen på 5 ml, og bland opløsningen ved at vende røret flere gange. Det er almindeligt, at klumper stadig er til stede efter den første DNase I behandling.
- Pellet cellen suspension på ~ 200 x g i 2 min ved stuetemperatur.
- Gentag trin 1.4.13-1.4.16 yderligere 1-3 gange, indtil den genophængte pellet ikke klumper sig sammen ved tilsætning af DMEM. Efter det sidste spin skal du fjerne så meget supernatant som muligt uden at forstyrre pellet.
BEMÆRK: Forvent en reduktion i pellet størrelse med hver DNase Jeg behandling; over 4 samlede DNase jeg vasker kan resultere i betydelige tab af celler. Hvis ingen pellet er synlig efter DNase I behandlinger trin, ikke gå videre med proceduren. Kassér enhver ubrugt DNase I. - Tilsæt 1 ml 1x PBS, og pelleten tømmes igen ved forsigtigt at skrabe ydersiden af røret langs en tom 1,5 ml rørrist.
- Pellet cellen suspension på ~ 200 x g i 5 min derefter fjerne så meget supernatant som muligt uden at forstyrre pellet.
- Skær ~3 mm fra slutningen af en 200 μL pipettespids for at udvide blænden og resuspendere pellet i ~ 80 μL af 0,1 M saccharose opløsning ved at pipettere op og ned med snitpipette spidsen. Lad celleaffjedringen sidde ved stuetemperatur i 3 min.
- Spredning af kromosomer på glasdias
- Coat et dias med 100 μL 1% formaldehyd med 0,15% Triton X-100 med siden af en pipettespids. Derefter tilsættes 18 μL af saccharosecelleaffjedringen på midten af sliden i en lige linje vinkelret på den lange kant. Vip diaset frem og tilbage (~60°) for at lette spredningen af celleaffjedringen til alle hjørner.
- Placer gliderne fladt ned i et let revnet åbent fugtighedskammer (figur 3) for at forhindre formaldehydopløsningen i at tørre. Placer fugtighedskammeret i en mørk skuffe natten over.
- Tag låget ud af fugtighedskammeret, og lad objektglassene tørre helt.
- Placer dias i en Coplin krukke derefter fylde Coplin krukke med destilleret vand og inkubere i 5 minutter med blid rysten ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Diasene kan placeres i Coplin krukken i en zigzag mønster for at maksimere antallet af dias pr Coplin krukke. Sørg for, at der er plads til, at der kan passere væske mellem alle diasene. - Hæld vandet ud og fyld krukken med 1:250 befugtningsmiddel (se Tabel over materialer). Vask 2 gange i 5 minutter hver med skånsom omrystning ved stuetemperatur.
- Lad lysglassene tørre helt og opbevareved -20 °C, indtil de er plettet.
BEMÆRK: Den længste vi har gemt dias uden nogen mærkbar nedbrydning af kromosomer er ~ 2 måneder.
2. Telomere PNA sonde farvning
BEMÆRK: Telomere gentager kan farves ved hjælp af fluorophore-konjugerede telomere PNA sonder, der hybridiserer til førende streng telomere gentagelser (CCCTAA). PNA sonder har en neutral rygrad, hvilket øger hybridisering affinitet til negativt ladede DNA, hvilket resulterer i lidt at ingen baggrund. Den telomere sondering trin er valgfri. For at gå videre til antistoffarvning, rehydrere dias i 1x PBS som angivet i trin 2.2.2., derefter gå direkte til "Primær antistof farvning".
-
Gør PNA sonden reagenser, før du starter telomere farvning
BEMÆRK: Det er praktisk at forberede følgende løsninger i de mængder, der er angivet til brug i fremtidige forsøg. Opbevaringsforholdene er angivet nedenfor.- Der fremstilles 2 L 20x saltvands-natriumcitratopløsning (SSC) med en endelig koncentration på 3 M NaCl og 0,3 M natriumcitrat. Autoklave og opbevares ved stuetemperatur.
- Lav 50 ml pre-hybridiseringsopløsning, der indeholder overførsel RNA til en endelig koncentration på 50% formamid, 5x SSC, 50 μg/mL heparin, 500 μg/mL transfer RNA, 0,1% Tween 20 og tilsæt 460 μL 1 M citronsyre for at bringe opløsningen til pH ~6. Opbevares ved -20 °C.
FORSIGTIG: Formamid er farlig. Klargør opløsningen i en røghætte. - Lav 50 ml før-hybridiseringsopløsning, der er fremstillet på samme måde som i trin 2.1.2 uden at tilføje overførsels-RNA. Opbevares ved -20 °C.
- PNA telomere sonder TelC-Cy3 og TelC-Alexa647 er fremstillet som 50 μM bestande i formamid som pr producentens anvisninger. PNA-sonderne opbevares som 8 μL aliquots ved -80 °C.
- Der fremstilles mindst 1 ml 100 mg/ml lageropløsning af kvægserumalbumin (BSA) i sterilt destilleret vand. Opbevares ved -20 °C. Hvis du forbereder mere end 1 ml lager BSA, skal opløsningen opbevares som 1 ml aliquots.
- Ved hjælp af et 2 ml rør skal der fremstilles 2 ml hybridiseringsopløsning ved at tilsætte 27 μL 100 mg/ml BSA og 8 μL PNA-sonde til 1,965 ml førhybridiseringsopløsning, der indeholder overførselsRNA. Opbevares i mørke ved -20 °C.
-
PNA telomere sonde farvning
- Forvarm hybridiseringsovnen til 82 °C.
- Re-hydrat slides med 500 μL af 1x PBS per dias i 5 min i en luftfugtighed kammer ved stuetemperatur. Fjern PBS ved at trykke på siden af sliden på et køkkenrulle.
- Lysglassene opvarmes, og det 2 ml rør, der indeholder hybridiseringsopløsningen, er direkte på en metaloverflade i den opvarmede hybridiseringsovn i 2 min.
- Mens diaspå metaloverfladen bevares, tilsættes 100 μL af hybridiseringsopløsningen pr. dias, og dæk derefter objektglassene med plastdækslips (~25 mm x 75 mm) skåret til form ud af en autoklavepose. Lad dias sidde ved 82 °C i 10-12 min.
- Anbring gliderne i et fugtighedskammer i mørke ved 37 °C i 16-24 timer. Fra dette punkt og for den primære og sekundære antistof farvning, skal diasholdes i mørke for at undgå fotoblegning af fluorescens signal. Efter inkubationstiden kan reagenserne til antistoffarvning fremstilles under trin 2.2.9.
- Fjern dæksedlerne med en pipettespids.
BEMÆRK: For at lette fjernelsen af dækstrækket kan ~50-100 μL af hybridiseringsopløsningen uden overførsel DISPENSERes forsigtigt mellem sliden og dæksgridsen, når dæksslipløftes. - Pipette 500 μL af pre-hybridiseringsopløsning uden overførsel RNA på hvert dias og placer diasene i fugtighedskammeret i 15 minutter ved stuetemperatur. Fjern opløsningen ved at trykke på siden af sliden på en køkkenrulle.
BEMÆRK: Forhybridiseringsopløsningen uden overførsel ER IKKE forvarmet, før den tilføjes på hvert dias. - Pipette 500 μL 50% pre-hybridisering sopløsning uden overførsel RNA i 1x PBS til hver slide og placere dias i luftfugtigheden kammer i 15 min ved stuetemperatur. Fjern opløsningen ved at trykke på siden af sliden på en køkkenrulle.
- Overfør diasene til en Coplin krukke og vask 3 gange i 1x PBS med skånsom rysten i 15 min per vask ved stuetemperatur.
- Fjern dias fra Coplin krukken og fjerne overskydende PBS ved at trykke på siden af diaspå et køkkenrulle. Fortsæt derefter til trin 3.2 "Primær antistof farvning".
3. Antistof farvning
BEMÆRK: Antistoffer, der er opdrættet til kendte meiotiske proteiner, kan anvendes til immunofluorescenspåvisning i spredte kromosompræparater. Sekundære antistoffer konjugeret til forskellige fluorophorer gør det muligt at farve flere proteiner samtidigt, hvis de primære antistoffer blev opdrættet i forskellige dyr.
-
Gør følgende løsninger på dagen for den primære og sekundære antistof farvning
- Lav 1 L PBT med 1x PBS og 0,1% Triton X-100 fortyndet i destilleret vand. Opbevares ved stuetemperatur. Dette kan forberedes i god tid og i store mængder til fremtidige spredningsforsøg.
- Der fremstilles 500 μL antistofblok pr. dias til en endelig koncentration på 2 mg/ml BSA og 2% gedeserum i PBT.
- For at gøre 100 μL primær eller sekundær antistofblanding pr. dias tilsættes de relevante antistoffer ved den korrekte koncentration (se materialetabel)i antistofblokken.
BEMÆRK: Antistofkoncentrationen kan være nødvendigt at bestemme empirisk. I diskussionen, inkluderer vi en liste over antistoffer, vi har prøvet med succes (med fortynding / koncentrationer) og dem, vi har prøvet uden held.
-
Primær antistoffarvning
BEMÆRK: Kanin anti-menneskelige SCP3 og kylling anti-zebrafisk Sycp1 bruges typisk til primær antistof farvning.- Efter fjernelse af overskydende PBS fra dias, tilsættes 500 μL antistof blok per dias og placere dias i en luftfugtighed kammer ved stuetemperatur i mindst 20 min.
- Fjern antistofblokken ved at trykke på siden af dias på en køkkenrulle.
- Tilsæt 100 μL primær antistofblanding i antistofblok pr. dias og dæk objektglassene med en plastikdæksel lavet af en autoklavepose. Anbring gliderne i et fugtighedskammer natten over ved 4 °C.
- Fjern dæksedlerne med en pipettespids, og vask rutsjebanerne 2 gange i mindst 5 minutter hver med 1x PBS i en Coplin-krukke med skånsom omrystning ved stuetemperatur.
- Fjern PBS ved at trykke på siden af sliden på et køkkenrulle.
-
Sekundær antistoffarvning
BEMÆRK: Konjugerede gedeantikanin- og antikyllingesantistoffer til forskellige fluorophorer anvendes til farvning ved en 1:1000-koncentration.- Der tilsættes 500 μL antistofblok pr. rutsjebane, og anbring diasene i fugtighedskammeret ved stuetemperatur i mindst 5 min.
- Fjern antistofblokken ved at trykke på siden af sliden på en køkkenrulle.
- Tilsæt 100 μL sekundær antistofblanding i antistofblok pr. dias og dæk objektglassene med en plastikdæksel lavet af en autoklavepose. Anbring gliderne i et fugtighedskammer i 1 time ved 37 °C.
- Fjern dæksedlerne med en pipettespids, og vask rutsjebanerne 3 gange i mindst 5 minutter hver med 1x PBS i en Coplin-krukke med skånsom rysten ved stuetemperatur.
- Skyl diasene én gang i mindst 2 minutter med destilleret vand i en Coplin krukke med skånsom rysten ved stuetemperatur.
- Lufttørre de vippede dias for at lette tørringen.
- 20 μL anti-fade mountant med eller uden DAPI (se Tabel over materialer)som 3 jævnt afstand prikker på glas dækslips (24 mm x 60 mm).
- Placer dias med forsiden nedad på glasdækstrækket derefter forsegle coverslips med neglelak på kanten overlapper den matterede ende af diaset.
- De forberedte lysrum opbevares ved 4 °C, indtil de er klar til billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har skitseret en metode til at forberede og visualisere zebrafisk spermatocyt sprede præparater. Når den udføres korrekt, giver vores procedure godt spredt, ikke-overlappende kerner. For at genvinde sådanne kerner, er det vigtigt at have den passende mængde udgangsmateriale (dvs. testikler), behandle testikler i en tilstrækkelig lang tid i trypsin og et tilstrækkeligt antal DNase I behandlinger. Disse spreads kan derefter farves for telomerer og meiotiske proteiner til at studere meiotisk progression under profase I. Figur 1 viser eksempler på spredte præparater, der er plettet til kromosomale træk på forskellige stadier af profase I. Figur 4 illustrerer et eksempel på dårligt spredte kerner.
Figur 1: Repræsentative superopløsningsbilleder af kromosomspredte præparater, der er plettet med PNA- og antistofsonder. (A) Skema af synaptonemal kompleks. (B) Et synapseret par homologer, der viser det kromosomakseprotein Sycp3 (grøn), det tværgående filamentprotein Sycp1 (rød) og DNA (Blå), der er afbildet af strukturel belysningsmikroskopi (SIM) med et mål på 100 x. Skalaen bar = 1 μm. (C) Panelerne til venstre viser tre faser af meiotiske prophase: leptotene (top), tidlig zygotene (i midten) og pachytene (nederst). Skalabjælken = 5 μm. Højre: repræsentative billeder, der indeholder telomerer (magenta) for hver fase. Skalabjælken = 1 μm. Tallene er tilpasset fra Blokhina et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempel på zebrafisktestier (~7 måneder efter befrugtning). (A) Billedet viser testis' relative placering i zebrafisken. Testis sidder mellem svømmeblæren og tarmen. B) Længden af en tester. Yngre zebrafisk vil have mindre testikler. For kromosom spreads, fjerne så meget fedt og omgivende væv som muligt fra testiklerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fugtighedskammer til dias. Vores fugtighedskammer er lavet ved hjælp af en polystyren skum boks (21 cm x 19 cm x 6 cm) designet til at skibet elektroporation cuvetter. Vi indsatte vådt tyndt vævsklude (se materialetabel)i hver anden rille. Rutsjebanerne placeres fladt oven på højderyggene uden at røre ved vådservietterne. En kommerciel luftfugtighed kammer er også tilgængelig (se Tabel over materialer). Vi forestiller os, at enhver polystyrenskumboks udstyret med kamme og riller (f.eks. ved hjælp af glaspipetter13)kan anvendes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Eksempler på spredninger af dårlig kvalitet på grund af utilstrækkelige DNase I-behandlinger. Meiotiske kromosomer farves for Sycp3 afbildet af SIM ved hjælp af en 20x mål. Utilstrækkelig DNase Jeg behandlinger fører til overlappende kerner på grund af en tyktflydende saccharose celle suspension, der forhindrer celler i korrekt spredning på diaset. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Eksempler på kromosomspreads ved hjælp af en alternativ metode11. Meiotiske kromosomer plettet for Sycp3 (grøn) og Sycp1 (rød). Kromosomspreads blev udarbejdet som beskrevet af Sansam og Pezza11. Denne metode kan udføres ved hjælp af individuelle zebrafisk i stedet for de flere zebrafisk, der kræves til vores protokol. I vores hænder er det almindeligt at se kromosomer, der ikke er godt spredt. Der er også en mærkbar stigning i baggrunden farvning, der skyldes vragrester, der er tilbage på dias under kromosom spredning procedure. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi metoder til at sonde placeringen af telomerer og kromosom-associerede proteiner i nuklear overflade breder sig fra spermatocytter isoleret fra zebrafisk testikler. Vi forventer, at disse metoder vil være gældende for analyse af spermatocytter i andre teleostarter med tilpasning til testisstørrelse.
Mens kun et par antistoffer er blevet rejst til zebrafisk meiotiske proteiner, har vi haft succes med at bruge følgende antistoffer rejst til menneskelige (h) eller mus (m) proteiner. Vores laboratorium har rejst antistoffer mod zebrafisk Sycp1 protein (zfSycp1) i kylling, der har tjent som en pålidelig markør for synaptonemal kompleks (SC), men dette protein er kun til stede fra tidlig zygoten til sen pachytene, når kromosomer er fuldt synapseret. Kanin anti-hSYCP3 antistof har været meget pålidelig til at opdage meiotiske kromosom akser fra leptotenindtil opløsningen af SC i slutningen af pachyten(Figur 1B, C). Især har vi ikke observeret en klassisk diploten fase med fuld længde akser defineret af Sycp3 og fraværet af Sycp1, hvilket tyder på, at i modsætning til mus, kan akserne nedbrydes efter exit fra pachytene3. Andre kommercielt tilgængelige antistoffer mod m, h eller zf meiotiske proteiner, der har givet positive resultater omfatter også DNA rekombination / replikation kanin anti-hRAD51 og kanin anti-hRPA. Kilden til hvert antistof og den anvendte fortynding er angivet i materialetabellen. Dem, vi har prøvet uden held ved hjælp af mindst tre forskellige fortyndinger omfatter ged anti-hDMC1, mus anti-hMlh1, mus anti-hamster Sycp3, mus anti-hRPA.
Der er tre kritiske stadier af kromosomspredningsproceduren. Den første er at indsamle den korrekte mængde materiale. Femten intakte testikler bør være tilstrækkelige til spredning protokol for ~ 6 mpf hanner, og dette tal kan justeres op eller ned afhængigt af størrelsen af dyrene. Husk, at nogle meiotiske mutanter vil have mindre testikler, så yderligere 2 dyr skal anvendes. Det andet vigtige skridt er dissociation af celler. Under trypsin fordøjelse, hvis testiklerne ikke dissociaterer i små klumper, er det sandsynligt, at for få celler vil blive inddrevet fra spredning procedure. Et tredje vigtigt skridt er tilstedeværelsen af en synlig pellet efter DNase I behandlinger. Hvis en pellet ikke er synlig, er det sandsynligt, at spredningen procedure vil give lidt at ingen kerner. Tab af en pellet kan opstå, hvis for få dyr anvendes, eller hvis for mange DNase jeg vasker udføres. På den anden side kan for få DNase I behandlinger resultere i en viscid saccharose celle suspension, som vil forhindre celler i at sprede sig på diaset(figur 4). Det er vigtigt at fortsætte med at udføre DNase I behandlinger (for højst 4 behandlinger), indtil klumper ikke længere er til stede ved tilsætning af DMEM.
Den præsenterede kromosom sprede teknik giver hundredvis af godt spredt kerner per dias. Ved hjælp af denne procedure, Vi har været i stand til at give en detaljeret analyse af vigtige begivenheder under zebrafisk spermatogenese ved hjælp af super-opløsning mikroskopi3. I vores hænder har denne protokol genereret bedre spredning kromosomer, med mindre snavs på diaset, og mindre baggrund farvning sammenlignet med hurtigere metoder ved hjælp af enkelte dyr beskrevet af Moens14 og Sansam og Pezza11 (Figur 5). Disse forskelle skyldes sandsynligvis brugen af kollagen, trypsin og DNase-behandlinger i vores protokol. To begrænsninger af vores teknik er kravet om at bruge 10-20 voksne zebrafisk hanner og de mere besværlige enzym behandlinger og vask trin. Hvis det ikke er nødvendigt at påvise superopløsning, hvis zebrafiskmaterialet er begrænset, eller mere end to betingelser testes parallelt, kan de hurtigere metoder være mere egnede alternativer14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Trent Newman og Masuda Sharifi for kommentarer til manuskriptet og An Nguyen for at hjælpe med at optimere metoder til spredning og farvning kromosomer fra zebrafisk meiocytter. Dette arbejde blev støttet af NIH R01 GM079115 tildelt S.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
