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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Published: March 3, 2020 doi: 10.3791/60671
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, Davis, 2Integrative Genetics and Genomics Graduate Group, University of California, Davis

Summary

Nukleare Oberflächenausbreitungen sind ein unverzichtbares Werkzeug, um Chromosomenereignisse während der Meiose zu untersuchen. Hier zeigen wir eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung meiotischer Chromosomen während der Prophase I aus Zebrafisch-Spermatozyten.

Abstract

Meiose ist der wichtigste zelluläre Prozess erforderlich, um haploide Gameten für die sexuelle Reproduktion zu erstellen. Modellorganismen haben entscheidend dazu beigetragen, die Chromosomenereignisse zu verstehen, die während der meiotischen Prophase stattfinden, einschließlich der Paarungs-, Synapsen- und Rekombinationsereignisse, die eine korrekte Chromosomensegregation gewährleisten. Während die Maus ein wichtiges Modell für das Verständnis der molekularen Mechanismen war, die diesen Prozessen zugrunde liegen, sind nicht alle meiotischen Ereignisse in diesem System analog zur menschlichen Meiose. Kürzlich haben wir das spannende Potenzial des Zebrafisches als Modell der menschlichen Spermatogenese demonstriert. Hier beschreiben wir detailliert unsere Methoden zur Visualisierung meiotischer Chromosomen und zugehöriger Proteine in Chromosomenausbreitungspräparaten. Diese Präparate haben den Vorteil, dass eine hochauflösende Analyse von Chromosomenstrukturen möglich ist. Zunächst beschreiben wir das Verfahren zur Zersebung von Hoden von erwachsenen Zebrafischen, gefolgt von Zelldissoziation, Lyse und Verbreitung der Chromosomen. Als Nächstes beschreiben wir das Verfahren zum Nachweis der Lokalisation von meiotischen Chromosomenproteinen durch Immunfluoreszenznachweis und Nukleinsäuresequenzen durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Diese Techniken umfassen eine nützliche Reihe von Werkzeugen für die zytologische Analyse der meiotischen Chromatin-Architektur im Zebrafischsystem. Forscher in der Zebrafischgemeinschaft sollten in der Lage sein, diese Techniken schnell zu beherrschen und in ihre Standardanalysen der Fortpflanzungsfunktion zu integrieren.

Introduction

Die sexuelle Fortpflanzung erfolgt durch die Kombination zweier haploider Gameten, die jeweils die Hälfte des Chromosoms einer somatischen Zelle tragen. Meiose ist eine spezialisierte Zellteilung, die haploide Gameten durch eine Runde DNA-Replikation und zwei aufeinander folgende Runden der Chromosomensegregation produziert. In proPhase I müssen homologe Chromosomen (Homologe) paarwerden, rekombinieren und synapsisieren, wobei letztere durch die Bildung des synaptonemalen Komplexes gekennzeichnet ist, der zwei Homologachsen umfasst, die durch das Querfilament, Sycp1 (Abbildung 1A,B) überbrückt werden. Wenn diese Prozesse nicht ordnungsgemäß ausgeführt werden, kann dies zur Produktion von aneuploiden Gameten führen, die eine der Hauptursachen für Fehlgeburten beim Menschen sind1. Unser Wissen über die Koordination zwischen Paarung, Rekombination und Synapse wurde durch Studien in einer Vielzahl von Organismen, wie Hefe, C. elegans,Maus und Drosophila,unter anderem2erleichtert. Während der allgemeine Prozess der homologen Chromosomenpaarung, gefolgt von Segregation, gut konserviert ist, variiert seine Abhängigkeit von Rekombination und Synapse und die Reihenfolge dieser Ereignisse.

Meiotische Doppelstrangbruchbildung (DSB), die eine homologe Rekombination initiiert, tritt in der Nähe von Telomere auf, die während Leptotene im Bouquet gebündelt sind, und Synapse folgt kurz nach3,4. Diese Konfiguration der DSB-Bildung und Synapsis-Initiation ist auch ein Merkmal der männlichen Meiose beim Menschen, aber nicht in Maus5,6,7,8, was darauf hindeutet, dass Zebrafische als Modell für die menschliche Spermatogenese dienen können. Es gibt auch mehrere praktische Vorteile des Studiums Zebrafisch Meiose. Sowohl Männchen als auch Weibchen durchlaufen Gametogenese während des gesamten Erwachsenenalters, ihre Gonaden sind leicht zugänglich, und Hunderte von Nachkommen werden aus einem einzigen Kreuz erzeugt. Darüber hinaus sind die Embryonen transparent und entwickeln sich extern, was die Früherkennung von Aberrationen in der embryonalen Entwicklung durch aneuploide Gameten3,9erleichtert. Nachteile der Verwendung von Zebrafischen sind, dass sie langsam die Geschlechtsreife erreichen (ca. 60 Tage) und die Menge an Material, das für nukleare Oberflächenausbreitungen benötigt wird, muss von 10-20 erwachsenen Tieren gesammelt werden, abhängig von ihrer Größe.

Meiotische Chromosomenausbreitungspräparate sind ein wichtiges Werkzeug, um die Chromosomendynamik über alle Modellorganismen hinweg zu untersuchen, da Schlüsselsignaturen der meiotischen Chromosomendynamik untersucht werden können. Bei Zebrafischen wurden Schlüsselaspekte des Fortschreitens des meiotischen Programms und der nuklearen Organisation durch die Sondierung von nuklearen Oberflächenausbreitungen, hier als Chromosomausbreitung bezeichnet, mit Antikörpern zum Immunfluoreszenznachweis von Proteinen und/oder Nukleinsäuren durch FISH3,4,9,10,11,12seziert. Tatsächlich kann die polarisierte Lokalisierung von gruppierten Telomere im Bouquet in der Ausbreitungszubereitung erhalten bleiben (Abbildung 1C). Kürzlich haben wir Zebrafisch-Spermatozyten-Chromosom-Spreads zusammen mit Fluoreszenz-Detektionsmethoden und superhochauflösender Mikroskopie verwendet, um das detaillierte Fortschreiten der Zebrafisch-Telomer-Dynamik, homologen Chromosomenpaarung, Doppelstrang-Break-Lokalisierung und Synapsen an wichtigen meiotischen Übergängen3zu klären. Hier stellen wir Methoden zur Vorbereitung von Chromosomenausbreitungen aus Spermatozyten der Zebrafischhoden vor und färben sie anschließend mit fluoreszierenden Peptidnukleinsäure-Sonden (PNA) zu wiederholten Telomersequenzen und Immunfluoreszenznachweis von Chromosomen-assoziierten Proteinen.

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Protocol

Alle Methoden, die Zebrafische betreffen, wurden nach ethischen Standards durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der UC Davis genehmigt wurden.

1. Chromosomenausbreitungsverfahren

HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde entwickelt, um 4-6 Dias mit Hunderten von verteilten meiotischen Kernen pro Folie zu erstellen. Die Anzahl der verwendeten Hoden hängt von der Größe der Fische ab. Erwarten Sie, 20 Tiere bei 60 Tagen nach der Befruchtung (dpf) und 15 Tiere mit 6 Monaten nach der Befruchtung (mpf) zu verwenden. Für große Zebrafische (z.B. 12 mpf) sollten 10 Tiere ausreichen. Beachten Sie, dass die Tests einiger meiotischer Mutanten (z.B. spo11-/-) etwas kleiner sein werden3. In diesem Protokoll wird ein Pool von Hoden als einzelne Probe betrachtet. Es wird empfohlen, nicht mehr als 4 Proben parallel zu bereiten.

  1. Erstellen Sie die folgenden Lösungen, bevor Sie mit dem Streuvorgang beginnen
    HINWEIS: Es ist praktisch, die folgenden Lösungen in den mengen vorzubereiten, die für zukünftige Streuexperimente angegeben sind.
    1. Bereiten Sie eine 0,1 M Saccharoselösung vor, indem Sie 3,42 g Saccharose in 100 ml destilliertem Wasser auflösen. Bringen Sie die Saccharoselösung mit 1 M Tris-HCl auf pH 8, die ebenfalls bei pH 8 liegt. Anschließend sterilisieren Sie die Saccharoselösung. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
    2. Stellen Sie eine 10x phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 und 27,6 mM KH2PO4 in 1,8 l destilliertem Wasser vor. Rühren, bis er aufgelöst ist, dann den pH-Wert mit NaOH und Autoklav auf 7,3 einstellen. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
    3. Machen Sie eine 400-g/ml-DNase-I-Lösung in sterilem destilliertem Wasser. Bei -20 °C lagern. Es wird empfohlen, 5 ml dieser Lösung vorzubereiten und dann als 100 L Aliquots zu speichern.
  2. Am Tag des Streuprotokolls die folgenden Lösungen finden
    HINWEIS: Aus Gründen der Zeiteffizienz ist es am besten, die Kollagenase-Lösung sofort nach der Sezung aller Hoden herzustellen und dann die Trypsin- und Trypsin-Inhibitor-Lösungen während der Zeit zu machen, in der die Proben in Kollagennase behandelt werden.
    1. Lösen Sie 4 mg Kollagennase in 200 l des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco pro Probe (2% w/v Kollagenase Endkonzentration). Auf Eis bleiben, bis es nötig ist. Die Kollagenase dissoziiert die Hoden.
    2. 1,4 mg Trypsin in 200 l DMEM pro Probe auflösen (0,7% w/v Trypsin-Endkonzentration). Auf Eis bleiben, bis es nötig ist. Das Trypsin hilft, die Zellen zu dissoziieren.
    3. Lösen Sie 10 mg Trypsin-Inhibitor in 500 l DMEM pro Probe (2% w/v Trypsin-Inhibitor-Endkonzentration). Auf Eis bleiben, bis es nötig ist. Trypsin-Inhibitor verhindert, dass Trypsin die Zellen abbaut.
    4. Bereiten Sie eine 1% Formaldehydlösung (aus einer 16% vorgefertigten Lösung) mit 0,15% Triton X-100 in sterilem destilliertem Wasser vor. Auf Eis bleiben, bis es nötig ist. Das 1% Formaldehyd kann hergestellt werden, während die Hoden mit Trypsin und DNase I behandelt werden (d.h. während Schritt 1.4.7 des Streuvorgangs).
      VORSICHT: Formaldehyd ist gefährlich.
  3. Zerlegung von Hoden von erwachsenen männlichen Zebrafischen
    1. Euthanisieren Sie männliche Zebrafische (> 60 dpf), indem Sie sie in Eiswasser tauchen. Die Fische können in Eiswasser gehalten werden, bis sie seziert werden können, sollten aber so schnell wie möglich seziert werden.
      HINWEIS: Für dieses Verfahren wird der Wild-Stamm AB verwendet, aber auch andere Wild-Typ-Stämme sollten freundlich sein. Die längste Zeit, die wir Fische vor der Sezzeit im Eiswasser gehalten haben, ist 3 h ohne spürbare Auswirkungen auf das Protokoll.
    2. Enthaupten Sie einen Fisch nach dem anderen mit einer kleinen Schere und verwenden Sie dann eine Mikroschere, um entlang der ventralen Mittellinie zu schneiden, um die Körperhöhle freizulegen.
    3. Sezieren Sie die Hoden mit Zangen (siehe Materialtabelle) bei 1,65-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop. Führen Sie die Sezierungen in einer silikonbeschichteten Petrischale mit einem flachen Pool von 1x PBS.
      HINWEIS: Der Hoden befindet sich zwischen der Schwimmblase und dem Darm und erscheint leichter als Muskelgewebe (Abbildung 2A). Die Hoden sollten 2 Lappen haben, wenn sie vom Zebrafisch entfernt werden (Abbildung 2B).
    4. Entfernen Sie so viel Fett und umgebendes Gewebe aus dem Hoden wie möglich. Dann fügen Sie jeden sezierten Hoden direkt in ein 5 ml Rohr mit 2 ml DMEM und halten Sie auf Eis.
      HINWEIS: Die Schritte 1.3.3 und 1.3.4 sollten vor den Experimenten gemeistert werden.
  4. Dissoziation von Hodenzellen
    1. Vorwärmen 100 ml 0,1 M Saccharoselösung auf 37 °C.
    2. Fügen Sie dem 5 ml-Rohr mit den Hoden 200 l Kollagenaselösung hinzu. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sie mehrmals invertieren.
    3. Schütteln Sie die Hoden in einem Inkubator-Shaker bei 100 Rpm bei 32 °C 50 min bis eine Stunde lang vorsichtig, bis das DMEM trüb ist und die Hoden in kleinen Brocken liegen. Schnell es alle 10 min umkehren, um die Dissoziation zu erleichtern.
    4. Um die Kollagenase auszuwaschen, fügen Sie DMEM zu einem endgültigen 5 ml Volumen hinzu und invertieren Sie das Rohr ein paar Mal. Pellet die Hoden bei 200 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie 3 ml des Überstandes, so dass nur noch 2 ml übrig sind.
      HINWEIS: Das Hinzufügen, Entfernen und Übertragen von DMEM erfolgt mit Kunststoff-Transferpipetten für die gesamte Chromosomenstreuung.
    5. Wiederholen Sie Schritt 1.4.4 zweimal für insgesamt 3 DMEM-Wärungen. Setzen Sie das Pellet zwischen dmEM-Wärungen nicht wieder aus. Nach der letzten DMEM-Wäsche 4 ml des Überstandes entfernen, so dass nur noch 1 ml übrig bleibt.
    6. Fügen Sie 1 ml DMEM für ein Gesamtvolumen von 2 ml hinzu und fügen Sie 200 l der Trypsin-Lösung und 20 l DNase I-Lösung hinzu. Invertieren Sie das Rohr ein paar Mal, um die Lösung zu mischen.
    7. Das Rohr bei 32 °C horizontal für 5-15 min bei 100 U/min schütteln, bis die DMEM-Lösung nur wenige Klumpen enthält. Schnell es alle 5 min umkehren, um die Dissoziation zu erleichtern.
      HINWEIS: Die Klumpen sollten nach dem Schütteln deutlich kleiner sein.
    8. Fügen Sie 500 l der Trypsin-Inhibitor-Lösung und 50 l DNase I-Lösung hinzu. Invertieren Sie das Rohr ein paar Mal zu mischen, dann kurz drehen Sie sich bei 200 x g für 3 min bei Raumtemperatur, um Flüssigkeit oder Klumpen zu entfernen, die an der Rohrkappe oder der Seite des Rohres haften können.
    9. Legen Sie das Rohr auf Eis und setzen Sie die Zellsuspension wieder auf, indem Sie wiederholt mit einer Kunststoff-Transferpipette für 2 min nach oben und unten pfeifen, um die Dissoziation aller verbleibenden Klumpen zu erleichtern. Lassen Sie die Zellsuspension nicht in die Glühbirne der Transferpipette. Nach 2 min, Pipette die Suspension zurück in das 5 ml Rohr.
    10. Ein 100-m-Zellsieb mit DMEM vorbefeuchten und auf einem 50 ml-Rohr auf Eis legen.
    11. Übertragen Sie die Zellsuspension durch das Sieb einen Tropfen nach dem anderen mit einer Kunststoff-Transferpipette. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension nicht in die Glühbirne der Transferpipette gelangt.
    12. Übertragen Sie das Filtrat mit einer Kunststoff-Transferpipette auf ein neues 5 ml-Rohr und fügen Sie DMEM zu einem Endvolumen von 5 ml hinzu. Achten Sie darauf, die gepoolten Zellen an der Unterseite des Filters mit einer sauberen Kunststoff-Transferpipette befestigt zu sammeln. Pellet die Zellen bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    13. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören.
    14. Fügen Sie 5 L DNase I Lösung direkt in das Pellet. Mischen Sie dann das Pellet mit der DNase I Lösung, indem Sie den äußeren Boden des Rohres 4-5 Mal entlang eines leeren 1,5 ml Mikrozentrifugenrohrträgers vorsichtig kratzen. Zu hart zu kratzen kann zu einer Verringerung der wiedergewonnenen Spreads führen.
    15. Fügen Sie DMEM zu einem Endvolumen von 5 ml hinzu und mischen Sie die Lösung, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren. Es ist üblich, dass Klumpen nach der ersten DNase I Behandlung noch vorhanden sind.
    16. Pellet die Zellsuspension bei 200 x g für 2 min bei Raumtemperatur.
    17. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.13-1.4.16 zusätzlich 1-3 Mal, bis das resuspendierte Pellet nach Zugabe von DMEM nicht verklumpt. Entfernen Sie nach der letzten Drehung so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören.
      HINWEIS: Erwarten Sie eine Verringerung der Pelletgröße bei jeder DNase I Behandlung; mehr als 4 gesamte DNase I-Wassen können zu einem signifikanten Zellverlust führen. Wenn nach den DNase I-Behandlungsschritten kein Pellet sichtbar ist, fahren Sie nicht mit dem Verfahren fort. Verwerfen Sie alle nicht verwendeten DNase I.
    18. Fügen Sie 1 ml 1x PBS hinzu und setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie den äußeren Boden des Rohres entlang eines leeren 1,5 ml Rohrträgers vorsichtig kratzen.
    19. Pellet die Zellsuspension bei 200 x g für 5 min dann entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören.
    20. Schneiden Sie 3 mm vom Ende einer 200-L-Pipettenspitze, um die Blende zu verbreitern, und setzen Sie das Pellet in einer Lösung mit einer Saccharose lösung in Höhe von 80 l 0,1 M auf, indem Sie mit der geschnittenen Pipettenspitze nach oben und unten pfeifen. Lassen Sie die Zellaufhängung bei Raumtemperatur für 3 min sitzen.
  5. Verbreitung von Chromosomen auf Glasdias
    1. Mantel eines Schlittens mit 100 l 1% Formaldehyd mit 0,15% Triton X-100 mit der Seite einer Pipettenspitze. Dann fügen Sie 18 l der Saccharosezellaufhängung auf die Mitte der Rutsche in einer geraden Linie senkrecht zur langen Kante. Neigen Sie den Schlitten hin und her (ca. 60°), um die Ausbreitung der Zellsuspension auf alle Ecken zu erleichtern.
    2. Legen Sie die Dias flach nach unten in eine leicht rissige offene Feuchtigkeitskammer(Abbildung 3), um das Trocknen der Formaldehydlösung zu verhindern. Legen Sie die Feuchtigkeitskammer über Nacht in eine dunkle Schublade.
    3. Entfernen Sie den Deckel aus der Feuchtigkeitskammer und lassen Sie die Rutschen vollständig trocknen.
    4. Legen Sie die Dias in ein Coplin-Glas, dann füllen Sie das Coplin-Glas mit destilliertem Wasser und inkubieren Sie für 5 min mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Die Dias können im Coplin-Glas in einem Zickzack-Muster platziert werden, um die Anzahl der Dias pro Coplin-Glas zu maximieren. Stellen Sie sicher, dass zwischen allen Folien Platz für Flüssigkeit vorhanden ist.
    5. Gießen Sie das Wasser aus und füllen Sie das Glas mit 1:250 Benetzungsmittel (siehe Tabelle der Materialien). Waschen Sie 2 mal für 5 min mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur.
    6. Lassen Sie die Dias vollständig trocknen und lagern Sie bei -20 °C, bis sie gebeizt sind.
      HINWEIS: Die längste, die wir Dias gespeichert haben, ohne dass die Chromosomen spürbar abgebaut werden, beträgt 2 Monate.

2. Telomere PNA-Sonde Färbung

HINWEIS: Telomerwiederholungen können mit fluorophorkonjugierten Telomer-PNA-Sonden gefärbt werden, die zu führenden Strangtelomer-Wiederholungen (CCCTAA) hybridisieren. PNA-Sonden haben ein neutrales Rückgrat, was die Hybridisierungsaffinität zu negativ geladener DNA erhöht, was zu wenig bis keinem Hintergrund führt. Der Telomer-Sondierungsschritt ist optional. Um mit der Antikörperfärbung fortzufahren, diagleitet rehydrieren Sie in 1x PBS, wie in Schritt 2.2.2. angegeben, und fahren Sie dann direkt zu "Primäre Antikörperfärbung" über.

  1. Machen Sie die PNA-Sonde-Reagenzien vor Beginn der Telomerfärbung
    HINWEIS: Es ist praktisch, die folgenden Lösungen in den mengen vorzubereiten, die für zukünftige Experimente angegeben sind. Die Lagerbedingungen sind unten aufgeführt.
    1. 2 L Mitsaline-Natriumcitrat(SSC) Lösung mit einer Endkonzentration von 3 M NaCl und 0,3 M Natriumcitrat vorbereiten. Autoklav und lagern bei Raumtemperatur.
    2. Machen Sie 50 ml Vorhybridisierungslösung mit Transfer-RNA zu einer Endkonzentration von 50% Formamid, 5x SSC, 50 g/ml Heparin, 500 g/ml-Transfer-RNA, 0,1% Tween 20 und fügen Sie 460 l 1 M Zitronensäure hinzu, um die Lösung auf pH-Wert 6 zu bringen. Bei -20 °C lagern.
      VORSICHT: Formamid ist gefährlich. Bereiten Sie die Lösung in einer Dunstabzugshaube vor.
    3. Machen Sie 50 ml Vorhybridisierungslösung auf die gleiche Weise wie in Schritt 2.1.2 ohne Zugabe von Transfer-RNA vorbereitet. Bei -20 °C lagern.
    4. Die PNA-Telomersonden TelC-Cy3 und TelC-Alexa647 werden gemäß herstellerspezifischen Anweisungen als 50-M-Lagerbestände in Formamid hergestellt. Bewahren Sie die PNA-Sonden bei -80 °C als 8 L-Aliquots auf.
    5. Machen Sie mindestens 1 ml 100 mg/ml Stammlösung von Rinderserumalbumin (BSA) in sterilem destilliertem Wasser. Bei -20 °C lagern. Wenn Sie mehr als 1 ml Lager BSA vorbereiten, lagern Sie die Lösung als 1 ml Aliquots.
    6. Bereiten Sie mit hilfe einer 2 ml-Röhre eine Hybridisierungslösung von 2 ml auf, indem Sie 27 l 100 mg/ml BSA und 8 l von 50 -M PNA-Sonde zu 1,965 ml Vorhybridisierungslösung mit Transfer-RNA hinzufügen. Bei -20 °C im Dunkeln lagern.
  2. PNA Telomersonde Färbung
    1. Den Hybridisierungsofen auf 82 °C vorheizen.
    2. Rehydratrutschen mit 500 l 1x PBS pro Rutsche für 5 min in einer Feuchtekammer bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die PBS, indem Sie auf die Seite der Folie auf einem Papiertuch tippen.
    3. Erhitzen Sie die Dias und das 2 ml-Rohr mit der Hybridisierungslösung direkt auf einer Metalloberfläche im beheizten Hybridisierungsofen für 2 min.
    4. Während Sie die Dias auf der Metalloberfläche halten, fügen Sie 100 l der Hybridisierungslösung pro Schlitten hinzu und decken Sie die Dias dann mit Kunststoffabdeckungen (ca. 25 mm x 75 mm) ab, die aus einem Autoklavenbeutel geschnitten werden. Lassen Sie die Dias bei 82 °C für 10-12 min sitzen.
    5. Legen Sie die Dias in einer Feuchtigkeitskammer im Dunkeln bei 37 °C für 16-24 h. Von diesem Zeitpunkt an und für die primäre und sekundäre Antikörperfärbung müssen die Dias im Dunkeln gehalten werden, um photobleichen des Fluoreszenzsignals zu vermeiden. Nach der Inkubationszeit können die Reagenzien für die Antikörperfärbung in Schritt 2.2.9 hergestellt werden.
    6. Entfernen Sie die Abdeckungen mit einer Pipettenspitze.
      HINWEIS: Um die Entfernung des Deckelschlupfes zu erleichtern, können beim Heben des Deckelschlupfes die Hybridisierungslösung ohne Transfer-RNA sanft zwischen dem Schlitten und dem Deckelschlupf abgegeben werden.
    7. Pipette 500 l Vorhybridisierungslösung ohne Transfer-RNA auf jedes Dia und legen die Dias 15 min bei Raumtemperatur in die Feuchtekammer. Entfernen Sie die Lösung, indem Sie auf die Seite der Folie auf einem Papiertuch tippen.
      HINWEIS: Die Vorhybridisierungslösung ohne Transfer-RNA wird nicht vorgewärmt, bevor sie jedem Dia hinzugefügt wird.
    8. Pipette 500 l 50% Vorhybridisierungslösung ohne Transfer-RNA in 1x PBS zu jedem Schlitten und legen Sie die Dias 15 min bei Raumtemperatur in die Feuchtekammer. Entfernen Sie die Lösung, indem Sie auf die Seite der Folie auf einem Papiertuch tippen.
    9. Die Dias in ein Coplin-Glas geben und 3 mal in 1x PBS mit sanftem Schütteln für 15 min pro Wäsche bei Raumtemperatur waschen.
    10. Entfernen Sie die Dias aus dem Coplin-Glas, und entfernen Sie überschüssige SPBS, indem Sie auf die Seite des Dias auf einem Papiertuch tippen. Fahren Sie dann mit Schritt 3.2 "Primäre Antikörperfärbung" fort.

3. Antikörperfärbung

HINWEIS: Antikörper, die zu bekannten meiotischen Proteinen erhoben werden, können zur Immunfluoreszenzdetektion in Spread-Chromosompräparaten verwendet werden. Sekundäre Antikörper, die mit verschiedenen Fluorophoren konjugiert sind, ermöglichen es, mehrere Proteine gleichzeitig zu färben, wenn die primären Antikörper bei verschiedenen Tieren aufgezogen wurden.

  1. Machen Sie die folgenden Lösungen am Tag der primären und sekundären Antikörperfärbung
    1. Machen Sie 1 L PBT mit 1x PBS und 0.1% Triton X-100 in destilliertem Wasser verdünnt. Bei Raumtemperatur aufbewahren. Dies kann im Voraus und in großen Mengen für zukünftige Streuexperimente vorbereitet werden.
    2. Bereiten Sie 500 l Antikörperblock pro Folie auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml BSA und 2% Ziegenserum in PBT vor.
    3. Um 100 l primärer oder sekundärer Antikörpermix pro Folie zu bilden, fügen Sie die entsprechenden Antikörper in der richtigen Konzentration (siehe Materialtabelle) in den Antikörperblock ein.
      HINWEIS: Die Antikörperkonzentration muss möglicherweise empirisch bestimmt werden. In die Diskussion nehmen wir eine Liste von Antikörpern auf, die wir mit Erfolg (mit Verdünnung/Konzentrationen) ausprobiert haben, und solche, die wir erfolglos versucht haben.
  2. Primärer Antikörper-Färbung
    HINWEIS: Kaninchen anti-human SCP3 und Huhn Anti-Zebrafisch Sycp1 werden in der Regel für primäre Antikörper Färbung verwendet.
    1. Nachdem Sie überschüssige PBS von den Dias entfernt haben, fügen Sie 500 l Antikörperblock pro Schlitten hinzu und legen Sie die Dias mindestens 20 min in eine Feuchtekammer bei Raumtemperatur.
    2. Entfernen Sie den Antikörperblock, indem Sie auf die Seite des Dias auf einem Papiertuch tippen.
    3. Fügen Sie 100 L primärer Antikörper-Mix in Antikörperblock pro Schlitten und decken Sie die Dias mit einem Kunststoff-Abdeckungsslip aus einem Autoklavenbeutel. Legen Sie die Dias über Nacht bei 4 °C in eine Feuchtigkeitskammer.
    4. Entfernen Sie die Abdeckungen mit einer Pipettenspitze und waschen Sie die Dias 2 Mal für jeweils mindestens 5 Minuten mit 1x PBS in einem Coplin-Glas mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur.
    5. Entfernen Sie die PBS, indem Sie auf die Seite der Folie auf einem Papiertuch tippen.
  3. Sekundäre Antikörperfärbung
    HINWEIS: Konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen- und Anti-Hühner-Antikörper gegen verschiedene Fluorophore werden zur Färbung in einer Konzentration von 1:1000 verwendet.
    1. Fügen Sie 500 l Antikörperblock pro Rutsche hinzu und legen Sie die Dias mindestens 5 min bei Raumtemperatur in die Feuchtekammer.
    2. Entfernen Sie den Antikörperblock, indem Sie auf die Seite des Dias auf einem Papiertuch tippen.
    3. Fügen Sie 100 L sekundären Antikörper-Mix in Antikörper-Block pro Rutsche und decken Sie die Dias mit einem Kunststoff-Abdeckungsslip aus einem Autoklavenbeutel. Legen Sie die Dias in eine Feuchtigkeitskammer für 1 h bei 37 °C.
    4. Entfernen Sie die Abdeckungen mit einer Pipettenspitze und waschen Sie die Dias 3 mal für mindestens 5 min mit 1x PBS in einem Coplin Glas mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur.
    5. Spülen Sie die Dias einmal für mindestens 2 min mit destilliertem Wasser in einem Coplin-Glas mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur.
    6. Luft trocknen die Schlitten gekippt, um das Trocknen zu erleichtern.
    7. Platzieren Sie 20 L Anti-Fade-Mountant mit oder ohne DAPI (siehe Materialtabelle) als 3 gleichmäßig verteilte Punkte auf Glasabdeckungen (24 mm x 60 mm).
    8. Legen Sie die Dias nach unten auf die Glasabdeckungen und versiegeln Sie dann die Abdeckungen mit Nagellack auf der Kante, die das gefrostete Ende der Rutsche überlappt.
    9. Bewahren Sie die vorbereiteten Dias bei 4 °C auf, bis sie für die Bildgebung bereit sind.

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Representative Results

Wir haben eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung von Zebrafisch Spermatozyten-Spread-Präparate skizziert. Bei korrekter Durchgeführte ergibt unser Verfahren gut verteilte, nicht überlappende Kerne. Um solche Kerne zurückzugewinnen, ist es wichtig, die entsprechende Menge an Ausgangsmaterial (d.h. Hoden), Hoden für eine ausreichende Dauer in Trypsin und eine ausreichende Anzahl von DNase I Behandlungen zu behandeln. Diese Aufstriche können dann für Telomere und meiotische Proteine gebeizt werden, um die meiotische Progression während der Prophase I zu untersuchen. Abbildung 1 zeigt Beispiele von Ausbreitungspräparaten, die für chromosomale Merkmale in verschiedenen Stadien der Prophase I gebeizt werden. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für schlecht verteilte Kerne.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Hochauflösende Bilder von Chromosomenausbreitungspräparaten, die mit PNA und Antikörpersonden gefärbt sind. (A) Schematic des synaptonemalen Komplexes. (B) Ein synapsiertes Homologepaar, das das Chromosomenachsenprotein Sycp3 (grün), das Transvergängliche Filamentprotein Sycp1 (rot) und die DNA (Blau) zeigt, die durch die strukturelle Beleuchtungsmikroskopie (SIM) mit einem 100-fachen Objektiv dargestellt wird. Die Skalenbalken = 1 m . (C) Die Platten auf der linken Seite zeigen drei Stufen der meiotischen Prophase: Leptotene (oben), Frühzygoten (Mitte) und Pachytene (unten). Der Maßstabsbalken = 5 m. Rechts: repräsentative Bilder mit Telomere (Magenta) für jede Stufe. Die Skala bar = 1 m. Die Figuren sind von Blokhina et al.3adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Beispiel für Zebrafischhoden (7 Monate nach der Befruchtung). (A) Das Bild zeigt die relative Position der Hoden innerhalb des Zebrafisches. Der Hoden sitzt zwischen der Schwimmblase und dem Darm. (B) Die Länge eines Hodens. Jüngere Zebrafische haben kleinere Hoden. Für Chromosomenbreiten, entfernen Sie so viel Fett und umgebendes Gewebe wie möglich aus dem Hoden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Feuchtigkeitskammer für Dias. Unsere Feuchtigkeitskammer besteht aus einer Polystyrolschaumbox (21 cm x 19 cm x 6 cm), die für den Versand von Elektroporationsküvetten entwickelt wurde. Wir haben in jede andere Nut feuchte dünne Gewebetücher (siehe Materialtabelle)eingesetzt. Die Rutschen werden flach auf den Graten platziert, ohne die feuchten Tücher zu berühren. Eine kommerzielle Feuchtigkeitskammer ist ebenfalls vorhanden (siehe Materialtabelle). Wir stellen uns vor, dass jede Polystyrol-Schaumbox mit Rippen und Nuten (z.B. mit Glaspipetten13) verwendet werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Beispiele für minderwertige Spreads aufgrund unzureichender DNase-I-Behandlungen. Meiotische Chromosomen, die für Sycp3 gebeizt wurden, wurden von SIM mit einem 20-fachen Objektiv abgebildet. Unzureichende DNase-I-Behandlungen führen zu überlappenden Kernen aufgrund einer viskosen Saccharosezellsuspension, die verhindert, dass sich Zellen auf dem Dia richtig ausbreiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Beispiele für Chromosomenausbreitungen mit einer alternativen Methode11. Meiotische Chromosomen für Sycp3 (grün) und Sycp1 (rot). Chromosomenbreiten wurden wie von Sansam und Pezza11beschrieben vorbereitet. Diese Methode kann mit einzelnen Zebrafischen und nicht mit den für unser Protokoll erforderlichen Zebrafischen durchgeführt werden. In unseren Händen ist es üblich, Chromosomen zu sehen, die nicht gut verbreitet sind. Es gibt auch eine spürbare Zunahme der Hintergrundfärbung, die durch Ablagerungen resultiert, die während des Chromosomenstreuvorgangs auf den Dias zurückgelassen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Hier beschreiben wir Methoden zur Untersuchung der Lage von Telomeren und chromosomassoziierten Proteinen in nuklearen Oberflächenausbreitungen aus Spermatozyten, die aus Zebrafischhoden isoliert sind. Wir erwarten, dass diese Methoden für die Analyse von Spermatozyten in anderen Teleostarten mit Anpassung an die Größe der Hoden anwendbar sein werden.

Während nur wenige Antikörper zu meiotischen Proteinen von Zebrafischen erhoben wurden, hatten wir Erfolg mit den folgenden Antikörpern, die auf menschliche (h) oder Mausproteine (m) angehoben wurden. Unser Labor hat Antikörper gegen Zebrafisch Sycp1 Protein (zfSycp1) in Huhn, das als zuverlässiger Marker für den synaptonemalen Komplex (SC) gedient hat, jedoch ist dieses Protein nur von frühem Zygoten bis späte Pachyten vorhanden, wenn Chromosomen vollständig synapsiert sind. Der Kaninchen-Anti-hSYCP3-Antikörper war sehr zuverlässig, um meiotische Chromosomenachsen von Leptotenbis zur Auflösung des SC in späten Pachytenzuzen zu erkennen (Abbildung 1B,C). Insbesondere haben wir keine klassische Diploten-Stufe mit von Sycp3 definierten Achsen in voller Länge und das Fehlen von Sycp1 beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Achsen, anders als bei der Maus, nach dem Verlassen von Pachytene3abgebaut werden können. Andere kommerziell erhältliche Antikörper gegen m, h oder zf meiotische Proteine, die positive Ergebnisse gebracht haben, sind auch DNA-Rekombination/Replikation Kaninchen Anti-hRAD51 und Kaninchen Anti-hRPA. Die Quelle jedes Antikörpers und die verwendete Verdünnung ist in der Materialtabelleaufgeführt. Diejenigen, die wir ohne Erfolg mit mindestens drei verschiedenen Verdünnungen versucht haben, gehören Ziege Anti-hDMC1, Maus Anti-hMlh1, Maus Anti-Hamster Sycp3, Maus Anti-hRPA.

Es gibt drei kritische Stadien des Chromosomstreuungsverfahrens. Die erste ist das Sammeln der richtigen Menge an Material. Fünfzehn intakte Hoden sollten für das Streuprotokoll für 6 mpf Männchen ausreichen, und diese Zahl kann je nach Größe der Tiere nach oben oder unten eingestellt werden. Denken Sie daran, dass einige meiotische Mutanten kleinere Hoden haben werden, so dass 2 zusätzliche Tiere verwendet werden sollten. Der zweite wichtige Schritt ist die Trennung von Zellen. Während der Trypsinverdauung, wenn die Hoden nicht in kleine Klumpen dissoziieren, ist es wahrscheinlich, dass zu wenige Zellen aus dem Ausbreitungsverfahren zurückgewonnen werden. Ein dritter wichtiger Schritt ist das Vorhandensein eines sichtbaren Pellets nach den DNase I Behandlungen. Wenn ein Pellet nicht sichtbar ist, ist es wahrscheinlich, dass das Streuverfahren wenig bis keine Kerne ergibt. Der Verlust eines Pellets kann entstehen, wenn zu wenige Tiere verwendet werden oder wenn zu viele DNase I-Wassen durchgeführt werden. Andererseits können zu wenige DNase-I-Behandlungen zu einer visziden Saccharosezellsuspension führen, die eine Ausbreitung der Zellen auf dem Dia verhindert (Abbildung 4). Es ist wichtig, weiterhin DNase I Behandlungen (für maximal 4 Behandlungen) durchzuführen, bis Klumpen nach Zugabe von DMEM nicht mehr vorhanden sind.

Die vorgestellte Chromosomenstreutechnik liefert Hunderte von gut verteilten Kernen pro Rutsche. Mit diesem Verfahren konnten wir eine detaillierte Analyse der wichtigsten Ereignisse während der Zebrafisch-Spermatogenese mit Super-Auflösungsmikroskopie3liefern. In unseren Händen hat dieses Protokoll eine bessere Verbreitung von Chromosomen erzeugt, mit weniger Schmutz auf dem Dia und weniger Hintergrundfärbung im Vergleich zu schnelleren Methoden mit einzelnen Tieren, die von Moens14 und Sansam und Pezza11 beschrieben werden (Abbildung 5). Diese Unterschiede sind wahrscheinlich auf die Verwendung von Kollagenase, Trypsin und DNase Behandlungen in unserem Protokoll. Zwei Einschränkungen unserer Technik sind die Anforderung, 10-20 erwachsene ZebrafischMännchen und die mühsameren Enzymbehandlungen und Waschschritte zu verwenden. Wenn eine Erkennung mit superAuflösung nicht erforderlich ist, wenn das Zebrafischmaterial begrenzt ist oder mehr als zwei Bedingungen parallel getestet werden, können die schnelleren Methoden geeignetere Alternativen sein14,15,16.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Trent Newman und Masuda Sharifi für ihre Kommentare zum Manuskript und An Nguyen für ihre Hilfe bei der Optimierung von Methoden zur Verbreitung und Färbung von Chromosomen aus Zebrafisch-Meiocyten. Diese Arbeit wurde von NIH R01 GM079115 an S.M.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free ThermoFisher Scientific 28908
2 mL Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips Corning 2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips VWR International 16004-312
50 mL conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific 363696
Autoclave bag Several commercial brands available Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605-100 Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm Fisher Scientific 08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed Biotium 203775-500uL Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1 Generated by Burgess lab N/A Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-500MG
Coplin jar Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas Roche Diagnostics 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps Fine Science Tools 11252-30 Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL VWR International 89429-308
Formamide Fisher Scientific BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11039 Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11042 Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1 Santa Cruz Biotechnology sc-8973 Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008 Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012 Use at 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10mL
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-100KU
Humidity chamber Fisher Scientific 50-112-3683
Hybridization Oven VWR International 230401V (Model 5420)
Incubator Shaker New Brunswick Scientific Model Classic C25
KCl Fisher Scientific P217-500
Kimwipes Kimerbly-Clark Professional 34155 Used for the humidity chamber
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Microscope Several commercial brands available Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3 Abcam ab97672 Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1 BD Biosciences 550838 Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA Sigma-Alrich MABE285 Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O Fisher Scientific S373-500
NaCl Fisher Scientific S271-3
Photo-Flo 200 solution Electron Microscopy Sciences 74257
Plastic transfer pipettes Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647 PNA Bio Inc F1013 Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3 PNA Bio Inc F1002 Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36971
Rabbit anti-hRPA Bethyl A300-244A Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3 Abcam ab150292 Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51 GeneTex GTX100469 Use at 1:300
Sodium citrate Fisher Scientific S279-500
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm Fisher Scientific 50-822-353 Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit Fisher Scientific NC9897184 Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin Worthington Biochemical LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white Sigma-Aldrich T9253-500MG
Tween 20 Bio-Rad 170-6531 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) Fine Science Tools 15018-10

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References

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Genetik Ausgabe 157 Meiose Zebrafisch Hoden Chromosomenausbreitungen synaptonemaler Komplex Telomere PNA-Sonden Hybridisierung Immunfluoreszenzmikroskopie Superauflösungsmikroskopie Antikörperfärbung Fluoreszenz in situ Hybridisierung FISH
Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten
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Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, … More

Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).

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