Summary
Les écarts de surface nucléaires sont un outil indispensable pour étudier les événements chromosomiques pendant la méiose. Ici nous démontrons une méthode pour préparer et visualiser des chromosomes méiotiques pendant la prophase I des spermatocytes de poisson zèbre.
Abstract
La méiose est le processus cellulaire clé nécessaire pour créer des gamètes haploïdes pour la reproduction sexuelle. Les organismes modèles ont joué un rôle déterminant dans la compréhension des événements chromosomiques qui ont lieu pendant la prophase méiotique, y compris les événements d’appariement, de synapse et de recombinaison qui assurent une ségrégation chromosomique appropriée. Bien que la souris ait été un modèle important pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces processus, tous les événements méiotiques de ce système ne sont pas analogues à la méiose humaine. Nous avons récemment démontré le potentiel passionnant du poisson zèbre comme modèle de spermatogénèse humaine. Ici nous décrivons, en détail, nos méthodes pour visualiser les chromosomes méiotiques et les protéines associées dans les préparations de propagation de chromosome. Ces préparations ont l’avantage de permettre l’analyse à haute résolution des structures chromosomiques. Tout d’abord, nous décrivons la procédure pour disséquer des testicules du poisson zèbre adulte, suivi de la dissociation cellulaire, de la lyse, et de la diffusion des chromosomes. Ensuite, nous décrivons la procédure pour détecter la localisation des protéines méiotiques de chromosome, par détection d’immunofluorescence, et séquences d’acide nucléique, par hybridation in situ de fluorescence (FISH). Ces techniques constituent un ensemble utile d’outils pour l’analyse cytologique de l’architecture de la chromatine méiotique dans le système de poisson zèbre. Les chercheurs de la communauté des poissons zèbres devraient être en mesure de maîtriser rapidement ces techniques et de les intégrer dans leurs analyses standard de la fonction reproductrice.
Introduction
La reproduction sexuelle se poursuit par la combinaison de deux gamètes haploïdes, chacun portant la moitié du complément chromosomique d’une cellule somatique. La méiose est une division cellulaire spécialisée qui produit des gamètes haploïdes à travers une série de réplication de l’ADN et deux cycles successifs de ségrégation chromosomique. Dans la prophase I, les chromosomes homologues (homologs) doivent subir l’appariement, la recombinaison et la synapse, ce dernier étant caractérisé par la formation du complexe synaptonemal qui comprend deux axes homologués pontés par le filament transversal, Sycp1 (Figure 1A,B). Le défaut d’exécuter correctement ces processus peut conduire à la production de gamètes aneuploid, qui sont une cause principale de fausses couches chez l’homme1. Notre connaissance de la coordination entre l’appariement, la recombinaison et la synapse a été facilitée par des études dans un large éventail d’organismes, tels que la levure, C. elegans, la souris, et la drosophile, entre autres2. Tandis que le processus général de l’appariement homologue de chromosome suivi de la ségrégation est bien conservé, sa dépendance à la recombinaison et à la synapse et l’ordre de ces événements varie.
La formation de rupture à double brin méiotique (DSB), qui initie une recombinaison homologue, se produit près des télomères regroupés dans le bouquet pendant le leptotene et la synapse s’ensuit peu après3,4. Cette configuration de la formation de l’ASD et de l’initiation à la synapse est également une caractéristique de la méiose masculine chez l’homme, mais pas chez la souris5,6,7,8, suggérant que le poisson zèbre peut servir de modèle pour la spermatogénèse humaine. Il y a également plusieurs avantages pratiques d’étudier la méiose de poisson zèbre. Les mâles et les femelles subissent la gamétogenèse tout au long de l’âge adulte, leurs gonades sont facilement accessibles, et des centaines de descendants sont générés à partir d’une seule croix. En outre, les embryons sont transparents et se développent à l’extérieur, ce qui facilite la détection précoce des aberrations dans le développement embryonnaire en raison de gamètes aneuploides3,9. Les inconvénients de l’utilisation du poisson zèbre sont qu’ils sont lents à atteindre la maturité sexuelle (environ 60 jours) et la quantité de matière nécessaire pour les écarts de surface nucléaire doit être recueillie à partir d’animaux adultes de 10 à 20, selon leur taille.
Les préparations de propagation de chromosome méiotique sont un outil essentiel pour étudier la dynamique de chromosome à travers tous les organismes modèles, puisque les signatures clés de la dynamique méiotique de chromosome peuvent être sondées. Chez le poisson zèbre, les aspects clés de la progression du programme méiotique et de l’organisation nucléaire ont été disséqués par le biais de l’enquête sur les propagations de surface nucléaire, appelées ici les propagations chromosomiques, avec des anticorps pour la détection d’immunofluorescence des protéines et/ou des acides nucléiques par FISH3,4,9,10,11,12. En effet, la localisation polarisée des télomères groupés dans le bouquet peut être préservée dans la préparation de la propagation (Figure 1C). Récemment, nous avons utilisé des propagations du chromosome spermatocyte du poisson zèbre ainsi que des méthodes de détection de fluorescence et de microscopie à super résolution pour élucider la progression détaillée de la dynamique des télomères du poisson zèbre, de l’appariement chromosomique homologue, de la localisation des ruptures à double brin et de la synapse lors des transitions méiotiques clés3. Ici nous présentons des méthodes pour préparer des écarts de chromosome des spermatocytes des testicules de poisson zèbre et par la suite les tacher avec des sondes fluorescentes d’acide nucléique de peptide (PNA) aux séquences répétées de telomere et à la détection d’immunofluorescence des protéines associées de chromosome.
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Protocol
Toutes les méthodes impliquant le poisson zèbre ont été effectuées en utilisant des normes éthiques approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’UC Davis.
1. Procédure d’épandage de chromosome
REMARQUE : Le protocole suivant est conçu pour créer 4-6 diapositives, avec des centaines de noyaux méiotiques de propagation par diapositive. Le nombre de testicules utilisés dépendra de la taille du poisson. Attendez-vous à utiliser 20 animaux à 60 jours après la fécondation (dpf) et 15 animaux à 6 mois après la fécondation (mpf). Pour les gros poissons zèbres (p. ex., 12 mpf), 10 animaux devraient suffire. Soyez conscient que les testicules de certains mutants méiotiques (par exemple, spo11-/)seront un peu plus petits3. Dans ce protocole, un pool de testicules est considéré comme un seul échantillon. Il est recommandé de ne pas préparer plus de 4 échantillons en parallèle.
- Faire les solutions suivantes avant de commencer la procédure de propagation
REMARQUE : Il est pratique de préparer les solutions suivantes dans les quantités spécifiées pour une utilisation dans de futures expériences de diffusion.- Préparer une solution de saccharose de 0,1 M en dissolvant 3,42 g de saccharose dans 100 ml d’eau distillée. Apportez la solution de saccharose au pH 8 en utilisant 1 M Tris-HCl qui est également au pH 8. Puis filtrez stériliser la solution de saccharose. Conserver à température ambiante.
- Faire une solution de stock saline (PBS) tamponnée de phosphate 10x à une concentration finale de 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 et 27,6 mKH2PO4 dans 1,8 L d’eau distillée. Remuer jusqu’à dissolution, puis ajuster le pH à 7,3 à l’aide de NaOH et autoclave. Conserver à température ambiante.
- Faire une solution d’une DNase I de 400 g/mL dans de l’eau distillée stérile. Conserver à -20 oC. Il est recommandé de préparer 5 ml de cette solution, puis de stocker sous forme d’aliquots de 100 l.
- Faire les solutions suivantes le jour du protocole de diffusion
REMARQUE : Pour l’efficacité de temps, il est le meilleur de faire la solution de collagène immédiatement après disséquer tous les testicules et puis faire les solutions d’inhibiteur de trypsine et de trypsine pendant le temps que les échantillons soient traités dans la collagène.- Dissoudre 4 mg de collagène dans 200 l du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) par échantillon (2 % de concentration finale de collagène w/v). Conserver sur la glace jusqu’à ce que nécessaire. La collagène dissociera les testicules.
- Dissoudre 1,4 mg de trypsine dans 200 L de DMEM par échantillon (0,7 % de concentration finale de trypsine w/v). Conserver sur la glace jusqu’à ce que nécessaire. La trypsine aidera à dissocier les cellules.
- Dissoudre 10 mg d’inhibiteur de la trypsine dans 500 L de DMEM par échantillon (2 % de concentration finale de l’inhibiteur de la trypsine w/v). Conserver sur la glace jusqu’à ce que nécessaire. L’inhibiteur de la trypsine empêche la trypsine de dégrader les cellules.
- Préparer une solution de formaldéhyde de 1 % (à partir d’une solution préfabriquée à 16 %) avec 0,15 % de Triton X-100 dans de l’eau distillée stérile. Conserver sur la glace jusqu’à ce que nécessaire. Le formaldéhyde de 1 % peut être préparé pendant que les testicules sont traités avec de la trypsine et du DNase I (c.-à-d. pendant l’étape 1.4.7 de la procédure de propagation).
CAUTION: Le formaldéhyde est dangereux.
- Dissection des testicules du poisson zèbre mâle adulte
- Euthanasiez le poisson zèbre mâle (60 dpf) en les submergeant dans l’eau glacée. Les poissons peuvent être conservés dans l’eau glacée jusqu’à ce qu’ils soient prêts à se disséquer, mais ils doivent être disséqués dès que possible.
REMARQUE : La souche de type sauvage AB est utilisée pour cette procédure, mais d’autres souches de type sauvage devraient également être favorables. Le temps le plus long que nous avons gardé les poissons dans l’eau glacée avant la dissection est de 3 h sans aucun effet notable sur le protocole. - Décapiter un poisson à la fois avec de petits ciseaux, puis utiliser des micro-ciseaux pour couper le long de la ligne médiane ventrale pour exposer la cavité du corps.
- Disséquer les testicules à l’aide de forceps (voir Tableau des matériaux) à 1,65x grossissement au microscope. Effectuez les dissections dans un plat Petri recouvert de silicone avec couvert par une piscine peu profonde de 1x PBS.
REMARQUE : Le testicule est situé entre la vessie natatoire et l’intestin et apparaîtra plus léger que le tissu musculaire(figure 2A). Les testicules doivent avoir 2 lobes lorsqu’ils sont retirés du poisson zèbre (Figure 2B). - Enlever autant de graisse et de tissu environnant du testicule que possible. Ajouter ensuite chaque testicule disséqué directement dans un tube de 5 ml avec 2 ml de DMEM et conserver sur la glace.
REMARQUE : Les étapes 1.3.3 et 1.3.4 doivent être maîtrisées avant de faire des expériences.
- Euthanasiez le poisson zèbre mâle (60 dpf) en les submergeant dans l’eau glacée. Les poissons peuvent être conservés dans l’eau glacée jusqu’à ce qu’ils soient prêts à se disséquer, mais ils doivent être disséqués dès que possible.
- Dissociation des cellules de testicules
- Pré-chauffer 100 ml de solution de saccharose de 0,1 M à 37 oC.
- Ajouter 200 l de solution de collagène au tube de 5 ml avec les testicules. Mélanger la solution en l’inversant plusieurs fois.
- Secouez doucement les testicules dans un shaker horizontal à 100 tr/min à 32 oC pendant 50 min à une heure jusqu’à ce que le DMEM soit trouble et que les testicules soient en petits morceaux. Inversion rapide du tube toutes les 10 minutes pour faciliter la dissociation.
- Pour laver la collagène, ajouter DMEM à un volume final de 5 ml et inverser le tube à quelques reprises. Pelleter les testicules à 200 x g pendant 3 min à température ambiante. Retirer 3 ml du supernatant de sorte qu’il ne reste que 2 mL.
REMARQUE : L’addition, l’enlèvement, et le transfert de DMEM se fait avec des pipettes de transfert en plastique pour l’ensemble de la procédure de propagation de chromosome. - Répétez l’étape 1.4.4 deux fois plus pour un total de 3 lavages DMEM. Ne pas resuspendre la pastille entre les lavages DMEM. Après le dernier lavage DMEM, retirer 4 ml du supernatant de sorte qu’il ne reste que 1 mL.
- Ajouter 1 ml de DMEM pour un volume total de 2 ml et ajouter 200 l de la solution trypsine et 20 l de la solution DNase I. Inverser le tube à quelques reprises pour mélanger la solution.
- Secouez horizontalement le tube à 32 oC pendant 5 à 15 min à 100 tr/min jusqu’à ce que la solution DMEM ne contienne que quelques amas. Inversion rapide du tube toutes les 5 minutes pour faciliter la dissociation.
REMARQUE : Les amas doivent être considérablement plus petits après avoir tremblé. - Ajouter 500 L de la solution d’inhibiteur de la trypsine et 50 l de la solution DNase I. Inverser le tube à quelques reprises pour mélanger, puis tourner brièvement vers le bas à 200 x g pendant 3 min à température ambiante pour enlever le liquide ou les amas qui peuvent adhérer au bouchon du tube ou le côté du tube.
- Placez le tube sur la glace et suspendez la suspension cellulaire en faisant monter et descendre à plusieurs reprises avec une pipette de transfert en plastique pendant 2 min pour faciliter la dissociation des amas restants. Ne laissez pas la suspension de la cellule entrer dans l’ampoule de la pipette de transfert. Après les 2 min, pipette la suspension de nouveau dans le tube de 5 ml.
- Prémouiller une passoire à cellules de 100 m avec DMEM et la placer sur un tube de 50 ml sur la glace.
- Transférer la suspension cellulaire à travers la passoire une goutte à la fois à l’aide d’une pipette de transfert en plastique. Assurez-vous que la suspension de la cellule ne va pas dans l’ampoule de la pipette de transfert.
- Transférer le filtrate à l’aide d’une pipette de transfert en plastique dans un nouveau tube de 5 ml et ajouter le DMEM à un volume final de 5 ml. Assurez-vous de recueillir les cellules mises en commun attachées à la face inférieure du filtre avec une pipette de transfert en plastique propre. Pelleter les cellules à 200 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirer autant de supernatant s’il y a de géant saille sans déranger la pastille.
- Ajouter 5 ll de solution DNase I directement dans le granule. Ensuite, mélanger la pastille avec la solution DNase I en grattant doucement le fond extérieur du tube 4-5 fois le long d’un vide 1,5 mL microcentrifuge tube rack. Le grattage trop sévère peut entraîner une réduction des écarts récupérés.
- Ajouter DMEM à un volume final de 5 ml et mélanger la solution en inversant le tube plusieurs fois. Il est courant que des amas soient toujours présents après le premier traitement DNase I.
- Pelleter la suspension de la cellule à 200 x g pendant 2 min à température ambiante.
- Répétez les étapes 1.4.13-1.4.16 1-3 fois supplémentaires jusqu’à ce que le granule resuspendu ne s’agglutine pas à l’ajout de DMEM. Après le dernier tour, retirer autant de supernatant que possible sans déranger la pastille.
REMARQUE: Attendez-vous à une réduction de la taille des granulés avec chaque traitement DNase I; dépassant 4 dNase total I se lave peut entraîner une perte significative de cellules. Si aucune pastille n’est visible après les étapes des traitements DNase I, ne pas procéder à la procédure. Jetez tout DNase inutilisé I. - Ajouter 1 ml de 1x PBS et resuspendre la pastille en grattant doucement le fond extérieur du tube le long d’une grille à tube vide de 1,5 ml.
- Pelleter la suspension de la cellule à 200 x g pendant 5 min, puis enlever autant de supernatant que possible sans déranger la pastille.
- Couper 3 mm à partir de l’extrémité d’une pointe de pipette de 200 l pour élargir l’ouverture et resuspendre la pastille dans une solution de saccharose de 0,1 M de 0,1 M en faisant monter et descendre avec la pointe de la pipette coupée. Laisser la suspension de la cellule s’asseoir à température ambiante pendant 3 min.
- Étendre les chromosomes sur des lames de verre
- Enrober une diapositive de 100 oL de formaldéhyde de 1 % avec 0,15 % de Triton X-100 avec le côté d’une pointe de pipette. Ensuite, ajoutez 18 L de la suspension de la cellule de saccharose sur le centre de la glissière dans une ligne droite perpendiculaire au bord long. Inclinez la glissière d’avant en arrière (60 degrés) pour faciliter la propagation de la suspension cellulaire à tous les coins.
- Placez les glissières à plat dans une chambre d’humidité ouverte légèrement fissurée (figure 3) pour empêcher la solution de formaldéhyde de sécher. Placez la chambre d’humidité dans un tiroir sombre pendant la nuit.
- Retirez le couvercle de la chambre d’humidité et laissez les glissières sécher complètement.
- Placer les lames dans un bocal Coplin puis remplir le pot Coplin avec de l’eau distillée et incuber pendant 5 min avec des secousses douces à température ambiante.
REMARQUE : Les diapositives peuvent être placées dans le bocal De Coplin en zigzag pour maximiser le nombre de diapositives par pot Coplin. Assurez-vous qu’il y a de l’espace pour que le liquide passe entre toutes les diapositives. - Verser l’eau et remplir le pot avec 1:250 agent mouillant (voir Tableau des matériaux). Laver 2 fois pendant 5 min chacun e en secouant doucement à température ambiante.
- Laisser les lames sécher complètement et les conserver à -20 oC jusqu’à ce qu’elles soient tachées.
REMARQUE : Le plus long que nous avons stocké des diapositives sans aucune dégradation notable des chromosomes est de '2 mois.
2. Télomere PNA sonde coloration
REMARQUE : Les répétitions de télomères peuvent être tachées à l’aide de sondes de télomère PNA conjuguées au fluorophore qui s’hybrident aux répétitions de télomères de brin de premier plan (CCCTAA). Les sondes PNA ont une colonne vertébrale neutre, ce qui augmente l’affinité d’hybridation à l’ADN chargé négativement, ayant pour résultat peu ou pas de fond. L’étape de sondage des télomères est facultative. Pour procéder à la coloration des anticorps, réhydratez les diapositives en 1x PBS comme indiqué à l’étape 2.2.2., puis passez directement à la « coloration primaire de l’anticorps ».
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Faire la sonde PNA réagents avant de commencer la coloration télomère
REMARQUE : Il est pratique de préparer les solutions suivantes dans les quantités spécifiées pour une utilisation dans de futures expériences. Les conditions d’entreposage sont indiquées ci-dessous.- Préparer 2 L de 20x de citrate saline-sodium (SSC) avec une concentration finale de 3 M NaCl et 0,3 M de citrate de sodium. Autoclave et conserver à température ambiante.
- Faire 50 ml de solution de pré-hybridation contenant de l’ARN de transfert à une concentration finale de 50% de formamide, 5x SSC, 50 'g/mL d’héparine, 500 'g/mL d’ARN de transfert, 0.1% Tween 20 et ajouter 460 'L de 1 M d’acide citrique pour apporter la solution au pH 6. Conserver à -20 oC.
CAUTION: Formamide est dangereux. Préparer la solution dans un capot de fumée. - Faire 50 ml de solution de pré-hybridation préparé de la même manière que dans l’étape 2.1.2 sans ajouter l’ARN de transfert. Conserver à -20 oC.
- Les sondes de télomères DeNA TelC-Cy3 et TelC-Alexa647 sont préparées sous forme de stocks de 50 M sous forme de formamide, conformément aux instructions du fabricant. Entreposez les sondes PNA sous forme d’aliquots de 8 l à -80 oC.
- Faire au moins 1 ml de 100 mg/mL de solution de bouillon d’albumine de sérum bovin (BSA) dans de l’eau distillée stérile. Conserver à -20 oC. Si vous préparez plus de 1 ml de stock BSA, stocker la solution comme 1 mL aliquots.
- À l’aide d’un tube de 2 ml, préparer 2 ml de solution d’hybridation en ajoutant 27 L de BSA de 100 mg/mL et 8 l de sonde PNA de 50 M à 1,965 mL de solution de pré-hybridation contenant de l’ARN de transfert. Conserver dans l’obscurité à -20 oC.
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Coloration de sonde de télomère de PNA
- Préchauffer le four d’hybridation à 82 oC.
- Réhydratez les toboggans avec 500 oL de 1x PBS par toboggan pendant 5 min dans une chambre d’humidité à température ambiante. Retirez le PBS en tapant sur le côté de la glissière sur un essuie-tout.
- Chauffer les toboggans et le tube de 2 ml contenant la solution d’hybridation directement sur une surface métallique dans le four d’hybridation chauffée pendant 2 min.
- Tout en gardant les glissières sur la surface métallique, ajouter 100 l de la solution d’hybridation par toboggan, puis recouvrir les glissières de couvercles en plastique (25 mm x 75 mm) taillées dans un sac autoclave. Laisser les toboggans s’asseoir à 82 oC pendant 10-12 min.
- Placer les toboggans dans une chambre d’humidité dans l’obscurité à 37 oC pendant 16-24 h. À partir de ce moment-là et pour la coloration des anticorps primaires et secondaires, les diapositives doivent être gardées dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment du signal de fluorescence. Après la période d’incubation, les réactifs pour la coloration des anticorps peuvent être préparés au cours de l’étape 2.2.9.
- Retirez les couvercles à l’aide d’une pointe de pipette.
REMARQUE : Pour faciliter l’enlèvement de la glissière de couverture, 50 à 100 livres de la solution d’hybridation sans ARN de transfert peuvent être délicatement distribués entre la glissière et la glissière pendant que le bordereau est soulevé. - Pipette 500 l de solution de pré-hybridation sans ARN de transfert sur chaque toboggan et placer les glissières dans la chambre d’humidité pendant 15 min à température ambiante. Retirez la solution en tapant sur le côté de la glissière sur un essuie-tout.
REMARQUE : La solution de pré-hybridation sans ARN de transfert n’est pas préchauffée avant d’être ajoutée sur chaque diapositive. - Pipette 500 'L de solution de pré-hybridation de 50% sans ARN de transfert dans 1x PBS à chaque diapositive et placez les glissières dans la chambre d’humidité pendant 15 min à température ambiante. Retirez la solution en tapant sur le côté de la glissière sur un essuie-tout.
- Transférer les lames dans un bocal Coplin et laver 3 fois en 1x PBS en secouant doucement pendant 15 min par lavage à température ambiante.
- Retirez les diapositives du pot Coplin et retirez l’excès de PBS en tapant sur le côté de la glissière sur un essuie-tout. Ensuite, passez à l’étape 3.2 "coloration des anticorps primaires".
3. Coloration d’anticorps
REMARQUE : Les anticorps élevés aux protéines méiotiques connues peuvent être employés pour la détection d’immunofluorescence dans les préparations de chromosome de propagation. Les anticorps secondaires conjugués à différents fluorophores permettent de s’agripper simultanément à plusieurs protéines, si les anticorps primaires ont été élevés chez différents animaux.
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Faire les solutions suivantes le jour de la coloration des anticorps primaires et secondaires
- Faire 1 L de PBT avec 1x PBS et 0,1% Triton X-100 dilué dans de l’eau distillée. Conserver à température ambiante. Cela peut être préparé à l’avance et en grande quantité pour de futures expériences de diffusion.
- Préparer 500 l de bloc d’anticorps par diapositive à une concentration finale de 2 mg/mL de BSA et de sérum de chèvre de 2 % en PBT.
- Pour faire 100 L de mélange d’anticorps primaires ou secondaires par diapositive, ajouter les anticorps appropriés à la bonne concentration (voir Tableau des matériaux) dans le bloc d’anticorps.
REMARQUE : La concentration d’anticorps peut devoir être déterminée empiriquement. Dans la discussion, nous incluons une liste d’anticorps que nous avons essayé avec succès (avec dilution/concentrations) et ceux que nous avons essayés sans succès.
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Coloration primaire d’anticorps
REMARQUE : Le lapin anti-humain SCP3 et le poulet anti-zèbre Sycp1 sont généralement utilisés pour la coloration des anticorps primaires.- Après avoir retiré l’excès de PBS des glissières, ajouter 500 l de bloc d’anticorps par diapositive et placer les glissières dans une chambre d’humidité à température ambiante pendant un minimum de 20 min.
- Retirez le bloc d’anticorps en tapant sur le côté de la glissière sur un essuie-tout.
- Ajouter 100 l de mélange d’anticorps primaires dans un bloc d’anticorps par diapositive et recouvrir les lames d’une feuille de couverture en plastique fabriquée à partir d’un sac autoclave. Placer les toboggans dans une chambre d’humidité pendant la nuit à 4 oC.
- Retirez les couvercles à l’aide d’une pointe de pipette et lavez les glissières 2 fois pendant un minimum de 5 minutes chacune avec 1x PBS dans un bocal Coplin avec des secousses douces à température ambiante.
- Retirez le PBS en tapant sur le côté de la glissière sur un essuie-tout.
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Coloration secondaire d’anticorps
REMARQUE : Des anticorps anti-lapin et anti-poulet conjugués contre les différents fluorophores sont utilisés pour la coloration à une concentration de 1:1000.- Ajouter 500 l de bloc d’anticorps par toboggan et placer les glissières dans la chambre d’humidité à température ambiante pendant un minimum de 5 min.
- Retirez le bloc d’anticorps en tapant sur le côté de la glissière sur un essuie-tout.
- Ajouter 100 l de mélange d’anticorps secondaires dans un bloc d’anticorps par diapositive et recouvrir les lames d’une feuille de couverture en plastique fabriquée à partir d’un sac autoclave. Placer les toboggans dans une chambre d’humidité pendant 1 h à 37 oC.
- Retirer les couvercles avec une pointe de pipette et laver les diapositives 3 fois pendant un minimum de 5 min chacun avec 1x PBS dans un bocal Coplin avec des secousses douces à température ambiante.
- Rincer les lames une fois pendant un minimum de 2 min avec de l’eau distillée dans un bocal Coplin avec des secousses douces à température ambiante.
- Sécher à l’air les glissières inclinées, pour faciliter le séchage.
- Placez 20 l de moniant anti-fade avec ou sans DAPI (voir Tableau des matériaux) sous forme de 3 points espacés uniformément sur des couvercles en verre (24 mm x 60 mm).
- Placez les diapositives face vers le bas sur les couvercles en verre, puis scellez les couvertures avec du vernis à ongles sur le bord qui chevauche l’extrémité givrée de la glissière.
- Conserver les glissières préparées à 4 oC jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être en imagerie.
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Representative Results
Nous avons décrit une méthode pour préparer et visualiser les préparations de propagation de spermatocyte salèbre. Lorsqu’elle est exécutée correctement, notre procédure donne des noyaux bien répartis et non superposés. Pour récupérer de tels noyaux, il est important d’avoir la quantité appropriée de matériel de démarrage (c.-à-d. les testicules), traiter les testicules pour une durée suffisante dans la trypsine et un nombre suffisant de traitements DNase I. Ces tartinades peuvent ensuite être tachées pour les télomères et les protéines méiotiques pour étudier la progression méiotique au cours de la prophase I. La figure 1 illustre des exemples de préparations de propagation tachées pour des caractéristiques chromosomiques à différents stades de la prophase I. Figure 4 illustre un exemple de noyaux mal répandus.
Figure 1 : Images représentatives en super résolution des préparations de propagation chromosomiquetachées de sondes PNA et d’anticorps. (A) Schéma du complexe synaptonemal. (B) Une paire synapsée d’homologs montrant la protéine de l’axe chromosomique Sycp3 (vert), la protéine filament transversale Sycp1 (rouge) et l’ADN (bleu) représentés par microscopie d’éclairage structurel (SIM) à l’aide d’un objectif 100x. La barre d’échelle de 1 m. (C) Les panneaux de gauche montrent trois étapes de prophase méiotique : leptotene (en haut), le zygotène précoce (milieu) et la pachytene (en bas). La barre d’échelle de 5 m. Droite : images représentatives contenant des télomères (magenta) pour chaque étape. La barre d’échelle de 1 m. Les figurines sont adaptées de Blokhina et coll.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Exemple de testicules de poisson zèbre (7 mois après la fécondation). (A) L’image montre l’emplacement relatif des testicules dans le poisson zèbre. Le testicule se situe entre la vessie natatoire et l’intestin. (B) La longueur d’un testicule. Les poissons zèbres plus jeunes auront de plus petits testicules. Pour les propagations chromosomiques, retirer autant de graisse et de tissu environnant que possible du testicule. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Chambre d’humidité pour les diapositives. Notre chambre d’humidité est faite à l’aide d’une boîte en mousse de polystyrène (21 cm x 19 cm x 6 cm) conçue pour expédier des cuvettes d’électroporation. Nous avons inséré des lingettes de tissu mince humide (voir Tableau des matériaux) dans toutes les autres rainures. Les toboggans sont placés à plat sur les crêtes sans toucher les lingettes humides. Une chambre d’humidité commerciale est également disponible (voir Tableau des matériaux). Nous envisageons que n’importe quelle boîte en mousse de polystyrène équipée de crêtes et de rainures (par exemple, à l’aide de pipettes en verre13) peut être utilisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Exemples de propagations de mauvaise qualité dues à l’insuffisance des traitements DNase I. Chromosomes méiotiques tachés pour Sycp3 image par SIM à l’aide d’un objectif 20x. Les traitements insuffisants de DNase I mènent aux noyaux se chevauchant dûs à une suspension visqueuse de cellules de saccharose qui empêche des cellules de se propager correctement sur la glissière. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Exemples de propagations chromosomiques à l’aide d’une méthode alternative11. Chromosomes méiotiques tachés pour Sycp3 (vert) et Sycp1 (rouge). Les écarts chromosomiques ont été préparés comme décrit par Sansam et Pezza11. Cette méthode peut être effectuée en utilisant le poisson zèbre individuel plutôt que les plusieurs poissons zèbres requis pour notre protocole. Dans nos mains, il est fréquent de voir des chromosomes qui ne sont pas bien répandus. Il y a également une augmentation notable de la coloration de fond qui résulte des débris qui sont laissés sur les glissières pendant la procédure de diffusion de chromosome. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici nous décrivons des méthodes pour sonder l’emplacement des télomères et des protéines chromosome-associées dans les écarts de surface nucléaire des spermatocytes isolés des testicules de poisson zèbre. Nous nous attendons à ce que ces méthodes soient applicables pour l’analyse des spermatozoïdes chez d’autres espèces de téléostéos avec ajustement à la taille du testicule.
Alors que seulement quelques anticorps ont été élevés aux protéines méiotiques de poisson zèbre, nous avons eu du succès en utilisant les anticorps suivants élevés aux protéines humaines (h) ou de souris (m). Notre laboratoire a élevé des anticorps à la protéine Sycp1 de poisson-zèbre (zfSycp1) dans le poulet qui a servi de marqueur fiable pour le complexe synaptonemal (SC), cependant, cette protéine est présente seulement du zygotène tôt au pachytene tardif, quand les chromosomes sont entièrement synapsed. L’anticorps anti-hSYCP3 de lapin a été très fiable pour détecter des axes de chromosome méiotique du leptotene jusqu’à la dissolution du SC en début de pachytene(figure 1B,C). Notamment, nous n’avons pas observé une scène classique diplotene avec des axes pleine longueur définis par Sycp3 et l’absence de Sycp1, ce qui suggère que, contrairement à la souris, les axes peuvent être dégradés après la sortie de pachytene3. D’autres anticorps disponibles dans le commerce aux protéines méiotiques de m, h ou de zf qui ont donné des résultats positifs incluent également la recombinaison/réplication d’ADN lapin anti-hRAD51 et l’anti-hRPA de lapin. La source de chaque anticorps et la dilution utilisée sont répertoriées dans le Tableau des matériaux. Ceux que nous avons essayé sans succès en utilisant au moins trois dilutions différentes comprennent chèvre anti-hDMC1, souris anti-hMlh1, souris anti-hamster Sycp3, souris anti-hRPA.
Il y a trois étapes critiques de la procédure de propagation de chromosome. La première consiste à recueillir la quantité correcte de matériel. Quinze testicules intacts devraient être suffisants pour le protocole de propagation pour les mâles de 6 mpfs, et ce nombre peut être ajusté vers le haut ou vers le bas en fonction de la taille des animaux. Gardez à l’esprit que certains mutants méiotiques auront des testicules plus petits, de sorte que 2 animaux supplémentaires devraient être utilisés. La deuxième étape importante est la dissociation des cellules. Pendant la digestion de trypsine, si les testicules ne se dissocient pas en petits touffes, il est probable que trop peu de cellules seront récupérées de la procédure de propagation. Une troisième étape clé est la présence d’une pastille visible après les traitements DNase I. Si une pastille n’est pas visible, il est probable que la procédure de propagation donnera peu ou pas de noyaux. La perte d’une pastille peut survenir si trop peu d’animaux sont utilisés ou si trop de lavages DNase i sont effectués. D’autre part, trop peu de traitements DNase I peuvent entraîner une suspension viscée des cellules de saccharose, ce qui empêchera les cellules de se propager sur la diapositive (Figure 4). Il est important de continuer à effectuer des traitements DNase I (pour un maximum de 4 traitements) jusqu’à ce que des amas ne soient plus présents à l’ajout de DMEM.
La technique de propagation de chromosome présentée donne des centaines de noyaux bien répandus par diapositive. En utilisant cette procédure, nous avons été en mesure de fournir une analyse détaillée des événements clés pendant la spermatogénèse du poisson zèbre à l’aide de la microscopie de super-résolution3. Dans nos mains, ce protocole a généré une meilleure propagation des chromosomes, avec moins de débris sur la diapositive, et moins de coloration de fond par rapport à des méthodes plus rapides utilisant des animaux simples décrits par Moens14 et Sansam et Pezza11 (Figure 5). Ces différences sont probablement dues à l’utilisation de la collagène, la trypsine, et les traitements de DNase dans notre protocole. Deux limites de notre technique sont l’exigence d’utiliser 10-20 mâles adultes de poisson zèbre et les traitements enzymatiques plus laborieux et les étapes de lavage. Si la détection de la super-résolution n’est pas nécessaire, si le matériau du poisson zèbre est limité, ou si plus de deux conditions sont testées en parallèle, les méthodes plus rapides peuvent être des alternatives plus appropriées14,15,16.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Trent Newman et Masuda Sharifi pour leurs commentaires sur le manuscrit et An Nguyen pour avoir aidé à optimiser les méthodes de propagation et de coloration des chromosomes des méiocytes de poissons zèbres. Ce travail a été soutenu par NIH R01 GM079115 attribué à S.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
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