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Genetics

从斑马鱼精子细胞中培养染色体传播

doi: 10.3791/60671 Published: March 3, 2020

Summary

核表面扩散是研究染色体事件的重要工具。在这里,我们演示了一种在斑马鱼精子细胞的前期I期间制备和可视化的中端染色体的方法。

Abstract

肌病是制造性生殖单倍体配子所需的关键细胞过程。模型生物体在理解在中位前相期间发生的染色体事件,包括配对、突触和重组事件,以确保正确的染色体分离。虽然小鼠是理解这些过程背后的分子机制的重要模型,但并不是这个系统中的所有中态事件都类似于人类的美氏症。我们最近展示了斑马鱼作为人类精子生成模型的令人振奋的潜力。在这里,我们详细描述了我们的方法,可视化染色体和相关蛋白质在染色体传播制剂。这些制剂的优点是允许对染色体结构进行高分辨率分析。首先,我们描述了从成年斑马鱼中解剖睾丸的过程,然后是细胞分离、解压和染色体扩散。接下来,我们描述了通过免疫荧光检测和核酸序列,通过荧光原位杂交(FISH)检测中值染色体蛋白定位的过程。这些技术为斑马鱼系统中的中色质结构的细胞学分析提供了一套有用的工具。斑马鱼群落的研究人员应该能够迅速掌握这些技术,并将其纳入其生殖功能的标准分析中。

Introduction

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性生殖通过两个单倍体配子的组合进行,每个配子携带一半体细胞的染色体补充。美西斯是一种专门的细胞分裂,通过一轮DNA复制和连续两轮染色体分离产生单倍体配子。在前期I中,同源染色体(同源性)必须经过配对、重组和突触,后者的特点是形成由横丝桥接的两个同源轴组成的突触复合体(图1A,B)。未能正确执行这些过程可能导致非倍体配子的产生,这是导致人类流产的主要原因1。我们对配对、重组和突触之间协调的知识,已经通过研究广泛的生物,如酵母,C.elegans,小鼠和果蝇,等等促进了我们的认识。虽然同源染色体配对和分离的一般过程得到了很好的保存,但其对重组和突触的依赖程度以及这些事件的顺序各不相同。

在leptotene和突触发生后不久,在麻风素和突触发生后不久,在花束中聚集的端粒附近发生,启动同源重组的美因双链断裂(DSB)形成。DSB形成和突触启动的这种配置也是人类雄性梅氏菌病的特征,但不是在小鼠5,6,7,8,表明斑马鱼可以作为人类精子的模型。研究斑马鱼美虫病也有若干实际优点。男性和女性在整个成年期间都经历游戏生成,他们的性腺很容易获得,并且数百个后代是由一个单一的十字架产生的。此外,胚胎是透明的,并在外部发育,这有利于早期发现胚胎发育中的畸变,由于非倍体配子3,9。使用斑马鱼的缺点是,它们缓慢地达到性成熟(约60天),核表面传播所需的材料量必须从10-20只成年动物身上收集,这取决于它们的大小。

由于可以探测染色体动力学的关键特征,因此染色体传播制剂是研究所有模型生物体染色体动力学的重要工具。在斑马鱼中,通过探测核表面扩散(这里称为染色体传播)对中显方案和核组织进展的关键方面进行了剖析,通过FISH3、4、9、10、11、12检测蛋白质和/或核酸的抗体。事实上,在花束中聚集端粒的极化定位可以在传播准备中保留(图1C)。最近,我们使用斑马鱼精子细胞染色体扩散与荧光检测方法和超分辨率显微镜一起,阐明斑马鱼端粒动力学、同源染色体配对、双链断裂定位和关键美感过渡3的突触的详细进展。在这里,我们介绍从斑马鱼睾丸的精子细胞制备染色体扩散的方法,然后用荧光肽核酸(PNA)探针将其染色,以重复端粒序列和染色体相关蛋白质的免疫荧光检测。

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Protocol

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所有涉及斑马鱼的方法都是使用加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会批准的伦理标准进行的。

1. 染色体传播程序

注: 以下协议旨在创建 4-6 张幻灯片,每张幻灯片有数百张扩散的中导核。使用的睾丸数量取决于鱼的大小。预计在受精后60天使用20只动物,在受精后6个月使用15只动物(mpf)。对于大型斑马鱼(例如,12 mpf)10只动物应该足够。请注意,一些中位突变体(例如,spo11-/-)的睾号会稍小一些3。在此协议中,一个测试池被视为单个示例。建议同时制备不超过4个样品。

  1. 在开始传播过程之前,请提出以下解决方案
    注:以指定的数量准备以下溶液,以便在未来进行传播实验时使用,这很方便。
    1. 通过在100 mL蒸馏水中溶解3.42克蔗糖,制备0.1M蔗糖溶液。使用 1 M Tris-HCl 将蔗糖溶液带到 pH 8,该溶液的 pH 为 pH 8。然后过滤灭菌蔗糖溶液。在室温下储存。
    2. 将 10 倍磷酸盐缓冲盐 (PBS) 库存溶液最终浓度为 1.37 M NaCl、27 mM KCl、73 mM Na2HPO4和 27.6 mM KH2PO4,在 1.8 L 蒸馏水中。搅拌至溶解,然后用NaOH和高压灭菌器将pH-7.3调节至7.3。在室温下储存。
    3. 在无菌蒸馏水中制作400μg/mL DNase I溶液。储存在-20°C。建议制备此溶液的 5 mL,然后存储为 100 μL 等分量。
  2. 在传播协议当天提出以下解决方案
    注:为了节省时间,最好在解剖所有睾品后立即制作胶原酶溶液,然后在样品在胶原酶中处理期间制作胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂溶液。
    1. 在 Dulbecco 的改性 Eagle 介质 (DMEM) 中,每样品溶解 4 mg 胶原酶 (DMEM)(2% w/v 胶原酶最终浓度)。保持冰上,直到需要。胶原酶会分离睾剂。
    2. 每样品在200μL的DMEM中溶解1.4毫克胰蛋白酶(0.7%(0.7%w/v胰蛋白酶最终浓度)。保持冰上,直到需要。胰蛋白酶将有助于分离细胞。
    3. 将10mg的胰蛋白酶抑制剂溶解于每个样品的500μL DMEM中(2%为2%的胰蛋白酶抑制剂最终浓度)。保持冰上,直到需要。胰蛋白酶抑制剂防止胰蛋白酶降解细胞。
    4. 在无菌蒸馏水中制备 1% 甲醛溶液(从 16% 预制溶液中),使用 0.15% Triton X-100。保持冰上,直到需要。1%甲醛可以在睾腺使用胰蛋白酶和DNase I进行治疗时制备的(即,在传播程序的第1.4.7步中)。
      注意:甲醛是危险的。
  3. 从成年雄性斑马鱼中解剖睾丸
    1. 将雄性斑马鱼(> 60 dpf)浸入冰水中,使它们安乐死。鱼可以保存在冰水中,直到准备解剖,但他们应该尽快解剖。
      注:野生型菌株AB用于此过程,但其他野生型菌株也应适合。在解剖之前,我们在冰水中保存鱼的最长时间是3小时,对协议没有任何明显的影响。
    2. 用小剪刀一次斩首一条鱼,然后用微剪刀沿着腹腔中线切开,露出体腔。
    3. 在显微镜下以1.65倍的放大倍率使用钳子(见材料表)对睾物进行解剖。在硅胶涂层的培养皿中进行解剖,并覆盖在 1x PBS 的浅水池中。
      注:睾号位于游泳膀胱和肠道之间,看起来比肌肉组织轻(2A)。从斑马鱼中取出时,睾丸应该有2个叶(2B)。
    4. 从睾片中尽可能多地去除脂肪和周围组织。然后,将每个解剖的睾号直接加入一个5 mL管中,管部为2 mL的DMEM,并保持在冰上。
      注意:在进行任何实验之前,应掌握步骤 1.3.3 和 1.3.4。
  4. 睾细胞分离
    1. 预热100 mL的0.1M蔗糖溶液至37°C。
    2. 将200μL胶原酶溶液加入5 mL管,加入睾剂。通过多次反转来混合解决方案。
    3. 在 32°C 下以 100 rpm 水平摇动培养箱中的睾号,50 分钟到一小时,直到 DMEM 多云且睾器处于小块。每隔 10 分钟快速反转管,以利于分离。
    4. 要洗掉胶原酶,将 DMEM 添加到最后 5 mL 体积,然后反转管数次。在室温下,在 ±200 x g下将睾丸颗粒 3 分钟。拆下 3 mL 的上清液,以便仅保留 2 mL。
      注:DMEM的添加、去除和转移是使用整条染色体传播过程的塑料转移移液器完成的。
    5. 重复步骤 1.4.4 两次,总共 3 次 DMEM 进行。请勿在 DMEM 分压之间重新悬浮颗粒。上次 DMEM 洗涤后,取出 4 mL 的上清液,仅保留 1 mL。
    6. 在总体积为 2 mL 时添加 1 mL 的 DMEM,并添加 200 μL 的胰蛋白酶溶液和 20 μL 的 DNase I 溶液。反转管几次以混合溶液。
    7. 在 32°C 下水平摇动管,在 100 rpm 下摇动管 5-15 分钟,直到 DMEM 溶液仅包含几个块块。每隔 5 分钟快速反转管,以利于分离。
      注:震动后,团块应小得多。
    8. 加入500μL的胰蛋白酶抑制剂溶液和50μL的DNase I溶液。将管倒置几次以混合,然后在室温下以 ±200 x g短暂旋转 3 分钟,以去除可能粘附在管盖或管侧上的液体或团块。
    9. 将管子放在冰上,用塑料转移移液器反复上下移液2分钟,以方便分离任何剩余的团块,从而重新悬挂细胞悬浮液。不要让细胞悬架进入转液器的灯泡。2分钟后,移液器将悬架放回 5 mL 管中。
    10. 用 DMEM 预湿 100 μm 细胞滤网,并将其放在冰上 50 mL 管的顶部。
    11. 使用塑料转移移液器,通过滤网一次一滴地转移细胞悬浮液。确保电池悬架不会进入转液器的灯泡。
    12. 使用塑料转移移液器将滤液转移到新的 5 mL 管中,并将 DMEM 添加到 5 mL 的最终体积中。确保用干净的塑料转移移液器收集连接到过滤器底面的池状电池。在室温下,在±200 x g下将细胞颗粒5分钟。
    13. 尽可能多地去除上清液,而不会干扰颗粒。
    14. 将5μL的DNase I溶液直接加入颗粒中。然后,通过沿着空的 1.5 mL 微离心管机架轻轻刮擦管的外底 4-5 次,将颗粒与 DNase I 溶液混合。刮得太苛刻会导致恢复的点差减少。
    15. 将 DMEM 添加到 5 mL 的最终体积,并通过多次反转管来混合溶液。在第一次DNase I治疗后,团块仍然存在是很常见的。
    16. 在室温下,将细胞悬浮液在+200 x g下进行2分钟。
    17. 重复步骤 1.4.13-1.4.16 再重复 1-3 次,直到添加 DMEM 时重新悬浮的颗粒不会聚集。在最后一次旋转后,尽可能去除上清液,而不会干扰颗粒。
      注:每次DNase I处理,预计颗粒大小会减小;超过4个总DNase I被活,可能会导致细胞的重大损失。如果 DNase I 治疗步骤后看不到颗粒,请勿继续手术。丢弃任何未使用的 DNase I。
    18. 加入 1 mL 的 1x PBS,然后沿着空的 1.5 mL 管架轻轻刮擦管的外底,重新悬浮颗粒。
    19. 将细胞悬浮液在±200 x g下进行5分钟,然后尽可能去除上清液,而不会干扰颗粒。
    20. 从 200 μL 移液器尖端的末端切割 ±3 mm,以扩大孔径,并通过切割移液器尖端上下移液,将颗粒重新悬浮在 ±80 μL 的 0.1 M 蔗糖溶液中。让细胞悬浮液在室温下坐3分钟。
  5. 在玻璃幻灯片上传播染色体
    1. 用 100 μL 的 1% 甲醛涂抹一个滑块,用 0.15% Triton X-100 与移液器尖端的侧面涂抹。然后,在垂直于长边的直线上将18 μL的蔗糖细胞悬浮液添加到幻灯片的中心。前后倾斜滑轨(±60°),便于将细胞悬架扩散到所有角落。
    2. 将幻灯片平放在稍微裂开的开放式湿度室中(图3),以防止甲醛溶液干燥。将湿度室放在黑暗的抽屉中过夜。
    3. 从湿度室中取出盖子,让滑轨完全干燥。
    4. 将滑梯放入科普林罐中,然后用蒸馏水填充科普林罐,并在室温下轻轻摇动5分钟。
      注: 幻灯片可以以锯齿形图案放置在科普林罐中,以最大化每个科普林罐的幻灯片数量。确保液体在所有幻灯片之间都有通过的空间。
    5. 倒出水,用1:250润湿剂填充罐子(见材料表)。在室温下轻轻摇动,洗2次,每次5分钟。
    6. 让幻灯片完全干燥,并储存在 -20°C 下,直到它们被弄脏。
      注:我们存储的幻灯片最长,染色体没有任何明显退化,为+2个月。

2. 端粒PNA探针染色

注: 端粒重复可以使用荧光结合端粒 PNA 探针进行染色,该探针杂交到领先的链端粒重复 (CCCTAA)。PNA 探针具有中性主干,可增加带负电荷的 DNA 的杂交亲和力,导致很少或根本没有背景。端粒探测步骤是可选的。要继续抗体染色,如步骤 2.2.2 所示,在 1x PBS 中补水,然后直接进入"初级抗体染色"。

  1. 在开始端粒染色之前制作 PNA 探针试剂
    注:以指定的数量准备以下解决方案,以便在未来实验中使用,这很方便。存储条件如下所述。
    1. 制备2L的20x盐酸钠(SSC)溶液,最终浓度为3M NaCl和0.3M柠酸钠。高压灭菌器在室温下储存。
    2. 使含有转移RNA的预杂交溶液达到50%形式酰胺、5x SSC、50μg/mL肝素、500μg/mL转移RNA、0.1%补间20,并加入460μL的1M柠檬酸,使溶液达到pH值6。储存在-20°C。
      注意:甲酰胺是危险的。在烟机罩中准备溶液。
    3. 使50 mL的预杂交溶液制备方式与步骤 2.1.2 相同,无需添加转移RNA。储存在-20°C。
    4. PNA 端粒探头 TelC-Cy3 和 TelC-Alexa647 按照制造商的说明制备为 50 μM 库存形式酰胺。将 PNA 探针在-80°C 处存储为 8 μL 等分。
    5. 在无菌蒸馏水中制作至少1mL的100mg/mL牛血清白蛋白(BSA)库存溶液。储存在-20°C。如果制备超过 1 mL 的库存 BSA,则将溶液存储为 1 mL 等分。
    6. 使用2 mL管,通过将含有转移RNA的预杂交溶液加入27 μL的100mg/mL BSA和8μL的50μM PNA探针制备2 mL的杂交溶液。在黑暗中储存在-20°C。
  2. PNA 端粒探针染色
    1. 将杂交炉预热至82°C。
    2. 在室温下,用 500 μL 的 1x PBS 重新滋润幻灯片,在室温下在湿度室中 5 分钟。通过点击纸巾上的幻灯片侧面,拆下 PBS。
    3. 在加热杂交炉的金属表面上直接加热含有杂交溶液的滑片和 2 mL 管 2 分钟。
    4. 在将幻灯片保持在金属表面上的同时,每张幻灯片添加 100 μL 的杂交溶液,然后用塑料盖玻片(±25 mm x 75 mm)盖住幻灯片,从高压灭菌袋中成型。让幻灯片在 82°C 下坐 10-12 分钟。
    5. 将幻灯片置于 37°C 的黑暗中,在 36-24 小时内放置。从此时起,对于初级和二级抗体染色,幻灯片必须保持在黑暗中,以避免荧光信号的光漂白。潜伏期过后,可在步骤2.2.9期间制备抗体染色试剂。
    6. 用移液器尖端拆下盖玻片。
      注:为了便于去除盖玻片,在提升盖玻片时,可在滑轨和盖玻片之间轻轻分配无转移RNA的杂交溶液的±50-100 μL。
    7. 移液器 500 μL 的预杂交溶液,没有将RNA转移到每张幻灯片上,并在室温下将滑片置于湿度室中 15 分钟。在纸巾上敲击幻灯片的侧面,取出溶液。
      注:无转移RNA的预杂交溶液在添加到每张幻灯片之前不会预热。
    8. 移液器 500 μL 的 50% 预杂交溶液,在 1x PBS 中没有转移RNA到每张幻灯片,并在室温下将幻灯片置于湿度室中 15 分钟。在纸巾上敲击幻灯片的侧面,取出溶液。
    9. 将幻灯片转移到 Coplin 罐中,在 1x PBS 中洗 3次,在室温下轻轻摇动 15 分钟。
    10. 从 Coplin jar 上取出幻灯片,通过点击纸巾上的幻灯片侧面来去除多余的 PBS。然后继续步骤3.2"主要抗体染色"。

3. 抗体染色

注:在传播染色体制剂中,升高到已知中蛋白的抗体可用于免疫荧光检测。与不同荧光道结合的二级抗体允许同时染色多个蛋白质,如果主要抗体在不同的动物中产生。

  1. 在初级和二级抗体染色当天提出以下解决方案
    1. 在蒸馏水中稀释 1 L 的 PBT 和 0.1% Triton X-100。在室温下储存。这可以提前准备,并大量为未来的传播实验做准备。
    2. 在PBT中制备每滑500μL的抗体块,最终浓度为2mg/mLBSA和2%山羊血清。
    3. 要使每张幻灯片产生 100 μL 的原发或二级抗体混合物,请将适当浓度(参见材料表)的相应抗体添加到抗体块中。
      注:抗体浓度可能需要根据经验确定。在讨论中,我们列出了我们成功尝试的抗体列表(稀释/浓度)和我们尝试过的抗体,但没有成功。
  2. 初级抗体染色
    注:兔子抗人SCP3和鸡抗斑马鱼Sycp1通常用于原发抗体染色。
    1. 从幻灯片中取出多余的PBS后,每张幻灯片加入500μL的抗体块,并将幻灯片置于室温下,至少20分钟。
    2. 通过敲击纸巾上的滑动侧,取出抗体块。
    3. 每张幻灯片在抗体块中加入100 μL的原抗体混合物,用高压灭菌袋制成的塑料盖玻片覆盖幻灯片。将滑梯置于4°C的湿度室中过夜。
    4. 用移液器尖端取下盖玻片,将幻灯片洗2次,每次至少5分钟,在Coplin罐子中用1x PBS,在室温下轻轻摇动。
    5. 通过点击纸巾上的幻灯片侧面,拆下 PBS。
  3. 二次抗体染色
    注:将不同荧光道的偶联山羊抗兔子和抗鸡抗体用于以1:1000浓度染色。
    1. 每张幻灯片加入 500 μL 的抗体块,并将幻灯片置于室温下,至少 5 分钟。
    2. 通过敲击纸巾上的幻灯片侧面,取出抗体块。
    3. 每张幻灯片在抗体块中加入 100 μL 的二次抗体混合物,用高压灭菌袋制成的塑料盖玻片盖住幻灯片。将幻灯片置于 37°C 的湿度室中 1 小时。
    4. 用移液器尖端取下盖玻片,将幻灯片洗3次,每次至少5分钟,在Coplin罐子中用1x PBS,在室温下轻轻摇动。
    5. 在室温下,用蒸馏水在Coplin罐中轻轻摇动,将滑梯冲洗一次至少2分钟。
    6. 空气干燥滑片倾斜,便于干燥。
    7. 将 20 μL 的防褪色安装器置于带或不带 DAPI(参见材料表)上作为 3 个均匀间隔的点放在玻璃盖玻片上(24 mm x 60 mm)。
    8. 将幻灯片正面朝下放在玻璃盖玻片上,然后用指甲油将盖玻片密封在与幻灯片磨砂端重叠的边缘上。
    9. 将准备好的幻灯片存放在 4°C,直到准备好成像。

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Representative Results

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我们已经概述了一种制备和可视化斑马鱼精子细胞传播制剂的方法。正确执行时,我们的程序产生良好的传播,非重叠的核。为了恢复这种核,重要的是要有适量的起始材料(即睾度),治疗睾度在胰蛋白酶和足够数量的DNase I治疗足够长的时间。然后,这些传播可以染色端粒和中度蛋白,以研究期I期间的间质进展。图1描述了在期前一阶段的不同阶段染色染色体特征的扩散制剂的例子。

Figure 1
图1:染色体传播制剂的代表性超分辨率图像,染色PNA和抗体探针。A) 突触复合物的原理图.(B) 一对突触的同源状,显示染色体轴蛋白 Sycp3(绿色)、横向细丝蛋白 Sycp1(红色)和 DNA(蓝色),使用 100x 物镜结构照明显微镜 (SIM) 成像。刻度杆 = 1 μm. (C) 左侧的面板显示美质前期的三个阶段:瘦素(顶部)、早期酶当(中)和乙苯丙酮(底部)。刻度杆 = 5 μm。右图:每个阶段包含端粒(洋红色)的代表性图像。比例尺 = 1 μm. 数字改编自 Blokhina 等人3请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:斑马鱼睾丸示例(受精后7个月)。A) 图像显示了斑马鱼中睾丸的相对位置.睾号位于游泳膀胱和肠道之间。(B) 睾号的长度。年轻的斑马鱼将有更小的睾丸。对于染色体传播,从睾片中去除尽可能多的脂肪和周围组织。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:幻灯片的湿度室。我们的湿度室采用聚苯乙烯泡沫箱(21 厘米 x 19 厘米 x 6 厘米)制成,用于运送电穿孔比色皿。我们在每一个其他凹槽中插入湿薄纸巾(见材料表)。滑轨平放在山脊顶部,没有接触湿巾。还提供商业湿度室(参见材料表)。我们设想可以使用任何装有山脊和凹槽(例如,使用玻璃移液器13)的聚苯乙烯泡沫箱。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:由于DNase I治疗不足而导致的质量差的点差的例子。使用 20x 物镜为 SIM 成像的 Sycp3 染色染色体。DNase I治疗不足导致核重叠,因为粘性蔗糖细胞悬浮液会阻止细胞在幻灯片上正常扩散。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:使用替代方法11的染色体传播示例。染色染色体为Sycp3(绿色)和Sycp1(红色)。染色体传播是由桑萨姆和佩扎11描述准备的。此方法可以使用单个斑马鱼执行,而不是我们的协议所需的几种斑马鱼。在我们手中,通常可以看到染色体传播不好。在染色体传播过程中,由于幻灯片上留下的碎屑造成的背景染色也明显增加。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

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在这里,我们描述了从斑马鱼睾丸分离的精子细胞中探测核表面端粒和染色体相关蛋白质的位置的方法。我们期望这些方法将适用于分析其他远程物种的精子细胞,并调整睾号的大小。

虽然只有几种抗体被提升到斑马鱼的中度蛋白,但我们已经成功地使用以下抗体,这些抗体被提升到人类(h)或小鼠(m)蛋白质。我们的实验室在鸡体内提出了对斑马鱼Sycp1蛋白(zfSycp1)的抗体,这些抗体是突触复合物(SC)的可靠标记物,然而,当染色体完全突触时,这种蛋白质只存在于早期酶当到晚期的pachytene。兔子抗hSYCP3抗体一直非常可靠,能够检测从乙苯丙酸的中染色体轴,直到SC在晚期溶解(图1B,C)。值得注意的是,我们没有观察到一个经典的二叶乐烯阶段与全长轴由Sycp3定义和Sycp1的不存在,这表明,与鼠标不同,轴可能在退出pachytene3后退化。其他市售的m、h或zf美感蛋白抗体也含有DNA重组/复制兔抗hRAD51和兔抗hRPA。每种抗体的来源和所使用的稀释剂列在材料表中。那些我们尝试没有成功使用至少三种不同的稀释包括山羊抗hDMC1,鼠标抗hMlh1,鼠标抗仓子Sycp3,鼠标抗hRPA。

染色体传播过程有三个关键阶段。第一种是收集正确的材料量。15个完好的睾号应该足以用于6mpf雄性扩张方案,并且这个数字可以根据动物的大小向上或向下调整。请记住,一些中位突变体将有较小的睾体,所以应该使用2个额外的动物。第二个重要步骤是细胞的分离。在胰蛋白酶消化期间,如果睾号不分离成小团块,则很可能从扩散过程中恢复的细胞太少。第三个关键步骤是在DNase I治疗后存在可见颗粒。如果颗粒不可见,则扩散过程很可能产生很少或没有核。如果使用的动物太少,或者进行太多的DNase I的分压,则可能发生颗粒损失。另一方面,太少的DNase I治疗可能导致粘液蔗糖细胞悬浮,这将防止细胞在幻灯片上扩散(图4)。继续执行DNase I治疗(最多4次治疗)非常重要,直到添加DMEM后,团块不再存在。

提出的染色体传播技术产生数百井传播核每滑。利用这个程序,我们已经能够提供详细的分析,在斑马鱼精子发生的关键事件使用超分辨率显微镜3。在我们手中,该协议产生了更好的传播染色体,在幻灯片上的碎片较少,背景染色较少,相比使用Moens14和Sansam和Pezza11描述的单个动物的更快方法(图5)。这些差异可能是由于在我们的协议中使用胶原酶、胰蛋白酶和DNase治疗。我们的技术的两个限制是要求使用10-20成年斑马鱼雄性和更费力的酶处理和洗涤步骤。如果不需要超分辨率检测,如果斑马鱼的材料有限,或者两个以上条件被并行测试,更快的方法可能更合适的替代品14,15,16。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢特伦特·纽曼和马苏达·沙里对手稿和An Nguyen的评论,感谢他们帮助优化了从斑马鱼染色体中传播和染色的方法。这项工作得到了NIH R01 GM079115授予S.M.B.的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free ThermoFisher Scientific 28908
2 mL Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips Corning 2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips VWR International 16004-312
50 mL conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific 363696
Autoclave bag Several commercial brands available Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605-100 Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm Fisher Scientific 08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed Biotium 203775-500uL Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1 Generated by Burgess lab N/A Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-500MG
Coplin jar Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas Roche Diagnostics 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps Fine Science Tools 11252-30 Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL VWR International 89429-308
Formamide Fisher Scientific BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11039 Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11042 Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1 Santa Cruz Biotechnology sc-8973 Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008 Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012 Use at 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10mL
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-100KU
Humidity chamber Fisher Scientific 50-112-3683
Hybridization Oven VWR International 230401V (Model 5420)
Incubator Shaker New Brunswick Scientific Model Classic C25
KCl Fisher Scientific P217-500
Kimwipes Kimerbly-Clark Professional 34155 Used for the humidity chamber
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Microscope Several commercial brands available Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3 Abcam ab97672 Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1 BD Biosciences 550838 Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA Sigma-Alrich MABE285 Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O Fisher Scientific S373-500
NaCl Fisher Scientific S271-3
Photo-Flo 200 solution Electron Microscopy Sciences 74257
Plastic transfer pipettes Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647 PNA Bio Inc F1013 Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3 PNA Bio Inc F1002 Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36971
Rabbit anti-hRPA Bethyl A300-244A Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3 Abcam ab150292 Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51 GeneTex GTX100469 Use at 1:300
Sodium citrate Fisher Scientific S279-500
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm Fisher Scientific 50-822-353 Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit Fisher Scientific NC9897184 Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin Worthington Biochemical LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white Sigma-Aldrich T9253-500MG
Tween 20 Bio-Rad 170-6531 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) Fine Science Tools 15018-10

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References

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从斑马鱼精子细胞中培养染色体传播
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Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).More

Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).

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