Summary
该方案证明了对非人类灵长类胰腺胰岛中耗氧量的准确和可重复的测量。微孔板的压网加载技术和涂层为高效测量其他类型的培养球体中的呼吸提供了一个框架。
Abstract
测量细胞球体簇（如前体胰腺胰岛）的耗氧量历来具有挑战性。我们演示了使用 96 孔微孔板测量小岛耗氧量，该微孔板设计用于测量球体中的耗氧量。在此测定中，球形微孔板在测定前一天涂有细胞和组织粘合剂。我们利用少量的粘合剂溶液，鼓励小岛仅粘附在井底。在测定当天，使用确保胰岛最佳定位和准确测量耗氧量的技术，将15个胰岛直接装入每口井的底座。线粒体呼吸的各个方面在非人类灵长类动物的小岛中具有药理学，包括ATP依赖性呼吸、最大呼吸和质子泄漏。此方法允许使用每个孔仅少量的小岛获得一致、可重现的结果。理论上，它可以应用于任何大小相似的培养球体。
Introduction
为了保持正常的血糖水平，胰腺+细胞必须感知葡萄糖的升高并相应地分泌胰岛素。胰岛素分泌与葡萄糖水平的耦合与葡萄糖代谢和通过线粒体氧化磷酸化的ATP生产直接相关。因此，线粒体在刺激分泌耦合1中起着至关重要的作用。评估β-细胞线粒体功能可以揭示导致胰岛素分泌受损的缺陷。胰腺β细胞分泌胰高血糖素也与线粒体功能2密切相关。虽然不朽的胰岛细胞系已被证明对某些类型的检测有用，但这些细胞的生理学不能准确地重述整个胰岛功能，如胰高血糖素3、4和胰岛素/生菌素5、6在完整胰岛抑制胰岛素分泌的强效。这表明需要使用完整、完整的小岛测量耗氧量。
测量胰岛细胞再测量技术已经随着时间而发展，从使用氧敏荧光染料7到直接测量耗氧量的固态传感器8。最初为单层、粘附细胞设计，常用的细胞培养板系统已被证明对胰腺胰岛无效。由于小岛不自然地附着在井上，它们容易被推到培养井的边缘，导致对耗氧量的测量不准确9。为了解决这个问题，专门开发了24孔板，其中央凹陷，可以包含胰岛9。然而，24孔板系统受到需要大量的胰岛（每口50-80个）和可以同时测试10个条件的限制。最近开发96孔微孔板，专为球体细胞外通量分析设计，克服了这些障碍，使胰岛再测量每井10个或更少胰岛。
在这里，我们演示了使用这个系统来测量来自日本猴（马卡卡福斯卡塔）的小岛的耗氧量，这是一个动物模型，其生物学与人类相似11，12。在此协议中，每孔分析15个猴胰岛。在我们手中，每井15个小岛产生的基线耗氧量高于较少的小岛，具有强大的激活和抑制呼吸，以响应药理学操作。我们重点介绍准备测定的步骤、在每个井中心一致加载胰岛的有效方法，以及执行此测定时的常见挑战。
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Protocol
1. 在运行检测前一天准备微孔板和传感器盒
胰岛是从3岁的日本猴中分离出来的，如前所述13。这种方法与用于从尸体捐赠者中分离人类胰岛的方法非常相似，但与小鼠不同，在动物处于镇液和器官切除之前，胰腺通常用胶原酶溶液膨胀。岛检索是根据俄勒冈州国家灵长类动物研究中心（ONPRC）和俄勒冈健康与科学大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针进行的，并经俄勒冈国家动物保护与科学大学批准。国家卫生研究院根据国家卫生研究院发布的《保护和使用实验室动物指南》，遵守美国农业部（USDA）实施的《动物福利法》和条例以及《关于人道护理和使用实验室动物的公共卫生服务政策》。
- 类球微板的制备
- 制备3 mL的0.1M碳酸氢钠溶液。过滤器对溶液进行消毒。我们使用了0.45 μm过滤器（材料表）。
- 在细胞培养罩中，将200μL的细胞和组织粘合剂（材料表）添加到2.8 mL的0.1M碳酸氢钠中。然后，将20μL的这种溶液添加到96孔球形微孔板（材料表）的每个井的底部。确保从移液头中去除气泡，并且只覆盖板的底部。微孔板的涂层可防止胰岛在测定过程中添加药物并混入井中时向上移动。
注：在进行测定时，只需涂涂尽可能多的孔，就像用于胰岛一样。如果只使用几口孔，细胞粘合剂溶液可以适当缩小。测定中使用的细胞粘合剂是从海贝中提取的配制蛋白质溶液。或者，微孔孔可以涂覆20 μL的100 μg/mL多D-莱辛。 - 在37°C的非CO2培养箱中孵育板一小时。
- 在无菌环境中，从板中吸气细胞粘合剂溶液。使用多通道移液器使用 400 μL 的 37°C 无菌水清洗每口井两次。允许空气干燥。
- 30-40分钟后，盖上盘子，在4°C下储存过夜。
- 传感器盒的补水
- 在无菌环境中，打开传感器盒封装（材料表）并取出内容。将传感器盒倒置放在公用电源板旁边。
- 用 200 μL 无菌水填充公用板的每个孔，并将传感器盒放回公用板。将组装的传感器盒和公用板放在 37°C 的非CO2培养箱中过夜。
- 校准的准备
- 将25 mL的校准 （材料表） 放入 50 mL 锥形管中。将管子放入37°C，非CO2培养箱过夜。
2. 在检测日进行介质准备、装载和加载传感器盒的协议
- 媒体的准备
- 到48.5 mL的基础介质（最小DMEM，见材料表），加入500μL每个1 mM丙酸钠和2mM谷氨酰胺。此外，加入496 μL的200mg/ml葡萄糖（在培养管中葡萄糖的最终浓度为5.5 mM）。
注：这些实验的基线葡萄糖浓度保持不变。然而，葡萄糖也可以用来刺激呼吸，除了药理学操作描述吹10。 - 确认 pH 为 7.4 +/- 0.1，必要时进行调整。
- 到48.5 mL的基础介质（最小DMEM，见材料表），加入500μL每个1 mM丙酸钠和2mM谷氨酰胺。此外，加入496 μL的200mg/ml葡萄糖（在培养管中葡萄糖的最终浓度为5.5 mM）。
- 传感器盒的制备
- 将传感器盒从培养箱中取出，取出传感器盒盖，然后从井中排出水。将 200 mL 的预加热校准放入每个井中，并更换传感器盒盖。
- 将传感器盒放回培养箱中约 1 小时（直到需要为止）。
- 线粒体应力测定药物的制备
- 打开压力测试套件 （材料表） 并删除内容.为奥利戈霉素、碳基氰化物-4-（三氟化酶）苯基拉松（FCCP）和罗泰酮/安提霉素A（AA）制作库存和工作解决方案，如下所示。
- Oligomycin：在管中加入630μL的组装介质，使100μM库存。然后，用介质稀释至45μM，以获得端口浓度（注射后最终井浓度为4.5μM）
- FCCP：将720μL的组装介质加入管中，生产100μM库存。用介质稀释至10μM，以获得端口浓度（最终井浓度为1μM）
注：BSA和/或FBS不应添加到介质中，因为这可能会影响线粒体解耦合器14的作用。 - Rotenone/AA：在管中加入540μL的组装介质，使50μM库存。用介质稀释至25μM，以获得端口浓度（最终井浓度为2.5μM）
注：上述浓度在我们手中产生了一致的结果。额外的FCCP导致呼吸没有进一步增加。然而，药物浓度可能需要根据胰岛大小进行调整，特别是不同物种或非胰岛球体的胰岛。作为参考，非人类灵长类动物小岛的平均直径约为150μm15。
- 打开压力测试套件 （材料表） 并删除内容.为奥利戈霉素、碳基氰化物-4-（三氟化酶）苯基拉松（FCCP）和罗泰酮/安提霉素A（AA）制作库存和工作解决方案，如下所示。
- 球形板的制备和胰岛的转移
- 将胰腺胰岛滴放入含有组装介质的 60 mm x 15 mm 细胞培养盘中，以获得接近 100% 的纯度。
注：胰岛应呈圆形，具有明确定义的外围，并且看起来比外分子组织污染物更密集。避免出现损坏或磨损的小岛。在这个实验中，没有直接测量胰岛大小，尽管我们试图为每个油井和样品选择大小近似相等的小岛。 - 使用多通道移液器使用 175 μL 组装介质加载每个球形微孔板。
- 使用设置为 15 μL 的 P20 移液器，从细胞培养盘中吸出 15 个小岛。在肉眼的移液器尖端中，胰岛应该可见。
- 要将小岛转移到球形微孔板，将下移液器尖端移至井底，勉强抬起，然后缓慢移液出非常小的体积（±5 μL）。确认所有小岛都留下了移液器尖端。每口井应接收15个小岛。偶尔在显微镜下检查球形微孔板，以验证胰岛是否位于每个井的底部，而不是粘在两侧。
注：避免用小岛装载角井。在测定过程中，塑料中的氧气和pH通量可能发生，这在四角井中会加剧。 - 一旦所有胰岛被转移到球形微孔板，在37°C非CO2培养箱中孵育微孔板，同时完成以下步骤。
- 将胰腺胰岛滴放入含有组装介质的 60 mm x 15 mm 细胞培养盘中，以获得接近 100% 的纯度。
- 加载传感器盒并运行检测
- 从培养箱中取出传感器盒。每个井的端口 A-C 必须装载药物或介质。含有小岛和四个角井的井应该装满毒品。没有小岛的非角孔应装有介质。端口 D 可以留空。装载端口 A（每个传感器的左上角），带有 20 μL 的寡霉素或介质。加载端口 B（右上），带 22 μL 的 FCCP 或介质。负载端口 C（左下）与 25 μL 的罗泰酮/AA 或介质。
- 为30分钟的基线呼吸周期（5个周期3分钟混合，3分钟测量），42分钟寡霉素测量周期（7个周期3分钟混合，3分钟测量），30分钟FCCP（5个周期3分钟混合，3分钟测量）和30分钟Rotenone/AA（5个周期3分钟混合，3分钟测量）编程细胞外通量分析仪。
- 运行测定并按照屏幕上的说明校准传感器并插入微孔板。
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Representative Results
要将小岛加载到微孔板中，15个小岛应在15μL的介质中吸气，如图1A所示。水小板会在几秒钟内自然地沉降到移液尖端的底部。然后，移液头降低到井底。尖端非常轻微提升，小体积（约 5 μL）与小岛一起移液。这种技术使小岛在微孔井底部的位置一致（图1B），从而能够进行精确的耗氧量测量。
图2显示了在整个测定过程中，按个别井的含氧量显示的代表性结果。这个特殊的实验演示了当井装得不好时会发生什么，许多小岛都粘在井的两侧，而不是在井底。这可能是由于在小岛从尖端移出后将过多的介质移入井中。额外的介质流将小岛从井底推出。当这种情况发生时，氧气消耗的基线水平将非常低，这口井对 FCCP 几乎没有反应。图 2中的粗线演示了这一现象。
图3显示了一个不同的实验，其中大多数水井确实显示了显著的基线呼吸和对药物的反应。然而，两口井（带粗体线）对罗酮/AA没有反应。这表明药物没有正常释放到井中。在这种情况下，与没有基底耗氧的情况一样，这些油井可以排除在进一步分析之外。
图 4显示了成功测定的结果。在这里，我们展示了一个独立实验中的汇总数据示例，其中井被正确装载了胰岛并正确注射了药物。ATP依赖的线粒体耗氧量通过寡霉素有效抑制，FCCP诱导的最大呼吸-远高于基础水平-和线粒体呼吸被完全关闭低于寡霉素水平-通过抑制电子传输链与罗酮/AA。
图1：将小岛装入微孔板的移液技术。（A） 大约 15 个小岛（红色箭头）用 15 μL 的介质移液。（B） 以球形微板底部为中心的胰岛。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：由于小岛加载的差异，井口可变性。井加载不当（粗体蓝线）显示很少或没有基底氧气消耗和最小的反应细胞压力测试药物。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：药物注射失败。两口井（粗体蓝线）未注射罗酮/AA，且耗氧量无明显下降。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：排除负载不良或注入的井后，实验中所有井的平均数据。在单独的实验中，在整个细胞压力测试测定中平均耗氧量，包括16个技术复制。误差条显示 n = 16 口井的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
胰岛耗氧量的研究以前曾受到胰岛球形、对培养表面缺乏依从性以及每口井所需的胰岛数量的影响。在此协议中，我们重点介绍了 96 孔球形微孔板对测量小岛小岛耗氧量的功效，并演示了一种处理和装载胰岛的技术，该技术在技术上是可行的，并且产生一致的结果。
为了使胰岛粘附在微孔板的底部，在整个测定过程中在混合步骤中不受干扰，96 孔微孔板在测定前一天涂上细胞粘合剂溶液。虽然这通常是有益的，但如果胰岛没有正确加载，它们很容易粘在井的一侧，而不是底部，从而影响或排除准确的测量。为了解决这个问题，我们建议用只有20μL的胶粘剂溶液来涂装孔。 此外，我们展示的移液技术可确保胰岛被加载到井底，而不是被额外的介质的流动推升两侧.
96 孔球形微孔板克服了以前测量胰岛耗氧量的限制，包括所需的大量胰岛和可同时测试的条件数量。事实上，最近的一项研究10表明，该系统使用单一人类小岛每井。然而，使用单个小岛测量耗氧量，导致氧气消耗的基底测量非常低，仅在最大小岛（直径超过 290 μm）中，氧气消耗量明显高于背景值。NHP小岛往往比人类小岛小，平均直径只有150μm15。在我们手中，每口井有15个NHP小岛在细胞压力测试期间比小小岛表现出更高的基线和响应能力。我们还测试了每口井的5个和10个小岛，但发现基底耗氧量和噪声信号显著降低。
除了能够每口井使用少量小岛外，96 孔微孔板还允许同时测试多个不同条件。这在胰岛使用不同的化合物或基因操纵的情况下是有益的。然而，当比较来自不同来源（例如糖尿病和非糖尿病胰岛）的人类或非人类灵长类小岛组时，通常在不同的日期收到样本。因此，在这些情况下，不可能充分利用该系统。
为了量化线粒体耗氧的各个方面，我们从药理学上操纵了呼吸的不同方面。使用的药物浓度是基于对人类小岛10的渗透研究。FCCP的剂量经过优化，可诱导我们手中最大的线粒体呼吸。具体来说，寡霉素的浓度为4.5μM，FCCP为1μM，罗酮/AA为2.5μM。然而，这些浓度可能需要针对该协议的不同应用进行校准。
可以使用多种方法直接分析或规范化生成的数据。在此实验中，每个样本都使用了大小相似的小岛数量相等，并且数据没有按细胞数或胰岛大小进行归一化，很难直接量化。另一种规范化方法是通过总细胞蛋白，包括执行测定后对细胞进行莱化并量化蛋白质水平。数据也可以归一化为基础呼吸水平。在某些情况下，这可能内容丰富，例如将储备能力量化为基底水平的百分比。但是，使用这些规范化方法和其他方法，信息可能会在规范化期间丢失，如前面所述16。
此处描述的系统提供了一个独特的工具，以更好地了解小岛生理学。事实上，在小岛健康中耗氧的重要性，从观察中说明了小岛耗氧率与小岛健康密切相关，以及成功移植小岛的可能性17。该系统为一致定量小岛耗氧量提供了一个极好的平台，理论上，该系统也适用于任何类似大小的培养球体。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢范德比尔特高通量筛查核心使用他们的设施，安捷伦生物技术，保罗基辅博士（俄勒冈健康和科学大学）非人类灵长类动物小岛隔离，和埃里克多纳休（范德比尔特大学）协助图1。J.M.E.获得国家卫生研究院NIGMS的支持，奖励号为T32GM007347。M.G. 得到了 NIH/NIDDK （R24DK090964-06） 和退伍军人事务部 （BX003744） 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
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