Summary
Questo protocollo dimostra la misurazione accurata e riproducibile del consumo di ossigeno nelle isole pancreatiche dei primati non umani. Le tecniche di caricamento dell'isolotto e il rivestimento della micropiastra forniscono un quadro per la misurazione efficiente della respirazione in altri tipi di sferoidi coltivati.
Abstract
La misurazione del consumo di ossigeno in gruppi di sferoidi di cellule, come le isole pancreatiche ex vivo, è stata storicamente impegnativa. Dimostriamo la misurazione del consumo di ossigeno alle irate utilizzando una micropiastra da 96 pozzetto progettata per la misurazione del consumo di ossigeno negli sferoidi. In questo analisi, le microplacche sferoidi sono rivestite con un adesivo per cellule e tessuti il giorno prima del saggio. Utilizziamo un piccolo volume di soluzione adesiva per incoraggiare l'aderenza alle alteienze solo sul fondo del pozzo. Il giorno del saggio, 15 isolotti vengono caricati direttamente nella base di ogni pozzo utilizzando una tecnica che garantisce un posizionamento ottimale delle isole e una misurazione accurata del consumo di ossigeno. Vari aspetti della respirazione mitocondriale sono sondati farmacologicamente in isolotti di primati non umani, tra cui la respirazione dipendente dall'ATP, la respirazione massima e la perdita di protoni. Questo metodo consente risultati coerenti e riproducibili utilizzando solo un piccolo numero di isolotti per pozzo. Teoricamente può essere applicato a qualsiasi sferoide coltivato di dimensioni simili.
Introduction
Al fine di mantenere i normali livelli di glucosio nel sangue, la cellula pancreatica deve rilevare le elevazioni nel glucosio e secernere insulina di conseguenza. L'accoppiamento della secrezione di insulina con i livelli di glucosio è direttamente collegato al metabolismo del glucosio e alla produzione di ATP attraverso il fosforonte ossidativo mitocondriale. Così, i mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nell'accoppiamento stimolo-secrezione1. La valutazione della funzione mitocondriale a cellule z può rivelare difetti che portano a una compromissione della secrezione di insulina. Anche la secrezione di cellule glucagoniche è strettamente legata alla funzione mitocondriale2. Anche se le linee cellulari isolate immortalate si sono dimostrate utili per alcuni tipi di saggi, la fisiologia di queste cellule non riassume con precisione la funzione dell'isolotto intero, come dimostra la potenziazione della secrezione di insulina da glucagon3,4 e l'inibizione della secrezione glucagona da parte di insulina / somatostatina5,6 in isolotti intatti. Questo dimostra la necessità di misurare il consumo di ossigeno utilizzando isolotti interi e intatti.
Le tecniche per la misurazione della respirometria delle cellule isolli si sono evolute nel tempo, dall'uso di coloranti fluorescenti sensibili all'ossigeno7 ai sensori allo stato solido che misurano direttamente il consumo di ossigeno8. Inizialmente progettati per monostrato, cellule aderenti, sistemi di piastra di coltura cellulare comunemente utilizzati hanno dimostrato di essere inefficaci per le isole pancreatiche. Poiché le isolotti non aderiscono naturalmente ai pozzi, sono inclini ad essere spinti alla periferia della coltura e con conseguente misurazione imprecisa del consumo di ossigeno9. Per combattere questo problema, sono state sviluppate piastre specializzate a 24 pozzetti con una depressione centrale che potrebbe contenere isolotti9. Tuttavia, il sistema a piastre 24 pozzi era limitato dal gran numero di isolotti richiesti (50-80 per pozzo) e dal numero di condizioni che potevano essere testate contemporaneamente10. Il recente sviluppo di microplacche da 96 pozzetti progettate specificamente per l'analisi del flusso extracellulare negli sferoidi ha superato queste barriere, consentendo la misurazione dell'iletmetria con 20 o meno isolotti per pozzo10.
Qui, dimostriamo l'uso di questo sistema per misurare il consumo di ossigeno in isolotti dal macaco giapponese (Macaca fuscata), un modello animale con biologia simile isolotto agli esseri umani11,12. In questo protocollo vengono analizzate 15 isole di macachi per pozzo. Nelle nostre mani, 15 isole per bene prodotto un maggiore consumo di ossigeno di base rispetto a meno isole, con robusta attivazione e repressione della respirazione in risposta alla manipolazione farmacologica. Mettiamo in evidenza i passaggi per preparare il saggio, un metodo efficace per un carico coerente di isolotti al centro di ogni pozzo e sfide comuni quando si esegue questo saggio.
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Protocol
1. Preparazione della cartuccia di micropiastra e sensore il giorno prima dell'esecuzione del saggio
Le isole sono state isolate dai macachi giapponesi di tre anni, come descritto in precedenza13. Questo metodo è molto simile a quello utilizzato per isolare le isole umane dai donatori di cadaveri, ma differisce dai topi, in cui la pancreata è spesso gonfiata con soluzione di collagenasi mentre l'animale è sotto sedazione e prima della rimozione dell'organo. Il recupero dell'Islet è stato condotto in conformità con le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Oregon National Primate Research Center (ONPRC) e dell'Oregon Health and Science University e sono stati approvati dall'ONPRC IACUC. L'ONPRC rispetta l'Animal Welfare Act e i regolamenti applicati dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) e dalla politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dai National Institutes of Health.
- Preparazione della microplacca Spheroid
- Preparare 3 mL di una soluzione di 0,1 M di bicarbonato di sodio. Filtro sterilizzare la soluzione. Abbiamo utilizzato un filtro da 0,45 m (Tabella dei Materiali).
- In una cappa cellulare, aggiungere 200 - L di adesivo per cellule e tessuti (Tabella dei materiali) a 2,8 mL di bicarbonato di sodio 0,1M. Quindi, aggiungere 20 l di questa soluzione sul fondo di ogni pozzetto della micropiastra sferoide 96-well (Tabella dei materiali). Assicurarsi che le bolle d'aria vengano rimosse dalla punta del tubo e che solo il fondo della piastra sia coperto. Il rivestimento della micropiastra impedisce alle isole di spostarsi verso l'alto sui lati dei pozzetti quando i farmaci vengono aggiunti e mescolati nel pozzo durante il saggio.
NOTA: È necessario rivestire solo come molti pozzi come verrà utilizzato per le isolotti quando il saggio è eseguito. Se verranno utilizzati solo pochi pozzi, la soluzione adesiva cellulare può essere ridimensionata in modo appropriato. L'adesivo cellulare utilizzato nel saggio è una soluzione proteica formulata estratta dalla cozza marina. In alternativa, i pozze a micropiastra possono essere rivestiti con 20 .L di 100 g/mL poli-D-lisina. - Incubare la piastra in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, nonCO2, per un'ora.
- In un ambiente sterile, la soluzione adesiva a cellule aspirati dalla piastra. Lavare ogni pozzo due volte con 400 gradi l di 37 gradi centigradi di acqua sterile utilizzando un pipet multicanale. Lasciare asciugare all'aria.
- Dopo 30-40 minuti, coprire la piastra e conservare pernottamento a 4 gradi centigradi.
- Idratazione della cartuccia sensore
- In un ambiente sterile, aprire il pacchetto cartuccia sensore (Tabella dei materiali) e rimuovere il contenuto. Posizionare la cartuccia del sensore a testa in giù accanto alla piastra di utilità.
- Riempire ogni pozzetto della piastra di utilità con acqua sterile di 200 gradi e abbassare la cartuccia del sensore nella piastra di utilità. Posizionare la cartuccia e la piastra di utilità del sensore assemblate in un'incubatrice di 37 gradi centigradi e non CO2 durante la notte.
- Preparazione di Calibrant
- Aliquota 25 mL di calibro (Tabella dei Materiali) in un tubo conico da 50 mL. Mettere il tubo in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, non CO2 durante la notte.
2. Protocollo per la preparazione dei supporti, il caricamento delle isole e il caricamento della cartuccia sensore il giorno del saggio
- Preparazione dei mezzi di comunicazione
- A 48,5 mL di supporti di base (DMEM minimo, vedere Tabella dei materiali),aggiungere 500 litri ciascuno di 1 mM di piradino di sodio e 2 mM di glutammina. Inoltre, aggiungere 496 l di 200 mg/ml di glucosio (concentrazione finale di glucosio nei media è 5,5 mM).
NOTA: La concentrazione di glucosio al basale è stata mantenuta costante per questi esperimenti. Tuttavia, il glucosio può anche essere utilizzato per stimolare la respirazione in aggiunta alle manipolazioni farmacologiche descritte colpo10. - Confermare che il pH è 7,4 s/- 0,1, regolando se necessario.
- A 48,5 mL di supporti di base (DMEM minimo, vedere Tabella dei materiali),aggiungere 500 litri ciascuno di 1 mM di piradino di sodio e 2 mM di glutammina. Inoltre, aggiungere 496 l di 200 mg/ml di glucosio (concentrazione finale di glucosio nei media è 5,5 mM).
- Preparazione della cartuccia del sensore
- Estrarre la cartuccia del sensore dall'incubatrice, rimuovere il coperchio della cartuccia del sensore e scaricare l'acqua dai pozzetti. Inserire 200 mL di calibro preriscaldato in ogni pozzo e sostituire il coperchio della cartuccia del sensore.
- Posizionare la cartuccia del sensore nell'incubatrice per circa 1 ora (fino a quando necessario).
- Preparazione di farmaci per il saggio sullo stress mitocondriale
- Aprire il kit di stress test (Sommario dei materiali) e rimuovere il contenuto. Make up stock e soluzioni di lavoro per Oligomycin, Carboniyl cianide-4(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), e Rotenone/Antimycin A (AA) come segue.
- Oligomicina: aggiungere 630 l di supporti assemblati al tubo per fare un brodo di 100 M. Quindi, diluire a 45 M con i supporti per ottenere la concentrazione del porto (la concentrazione finale del pozzo dopo l'iniezione sarà 4,5 M)
- FCCP: aggiungere 720 l di supporti assemblati al tubo per fare un brodo di 100 M. Diluire a 10 M con supporti per ottenere la concentrazione del porto (la concentrazione finale del pozzo sarà di 1 M)
NOTA: BSA e/o FBS non devono essere aggiunti ai supporti, in quanto ciò può influire sull'azione delle disaccoppiatori mitocondriali14. - Rotenone/AA: aggiungere 540 -L di supporti assemblati al tubo per fare un brodo 50 M. Diluire a 25 M con supporti per ottenere la concentrazione del porto (la concentrazione finale del pozzo sarà di 2,5 M)
NOTA: Le concentrazioni di cui sopra hanno prodotto risultati coerenti nelle nostre mani. Ulteriori FCCP non hanno portato a un ulteriore aumento della respirazione. Tuttavia, le concentrazioni di droga possono essere regolate a seconda delle dimensioni dell'isolotto, e soprattutto con isolotti di specie diverse o sferoidi non isolottidi. Per riferimento, il diametro medio di un'isolota di primati non umani è di circa 150 m15.
- Aprire il kit di stress test (Sommario dei materiali) e rimuovere il contenuto. Make up stock e soluzioni di lavoro per Oligomycin, Carboniyl cianide-4(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), e Rotenone/Antimycin A (AA) come segue.
- Preparazione della piastra sferoide e trasferimento di isse
- Isolottie pancreatici a selezione a mano in un piatto di coltura cellulare da 60 mm x 15 mm contenente supporti assemblati per ottenere una purezza vicina al 100%.
NOTA: Le isole dovrebbero apparire arrotondate, con una periferia chiaramente definita, e apparire più dense dei contaminanti del tessuto esocrino. Evitare isolotti che appaiono danneggiati o sfilacciati. In questo esperimento, le dimensioni dell'isolotto non sono state misurate direttamente, anche se abbiamo tentato di raccogliere isole di dimensioni approssimativamente equivalenti per ogni pozzo e campione. - Caricare ogni pozzetto di microplacca sferoide con 175 litri di supporti assemblati utilizzando una pipetta multicanale.
- Utilizzando una pipetta P20 impostata su 15 l, aspirare 15 isolotti da piatto di coltura cellulare. Le isolotti devono essere visibili nella punta della pipetta ad occhio nudo.
- Trasferire le isoc in micropiastra sferoide, abbassare la punta della pipetta sul fondo del pozzo, sollevare a malapena e lentamente pipetta fuori un volume molto piccolo (5 dollari l). Verificare che tutti gli isolotti abbiano lasciato la punta della pipetta. Ogni pozzo dovrebbe ricevere 15 isolotti. Occasionalmente controllare la microplacca sferoide al microscopio per verificare che le isolette si trovino nella parte inferiore di ogni pozzo piuttosto che attaccate ai lati.
NOTA: Evitare di caricare i pozzi d'angolo con isolotti. Il flusso di ossigeno e pH fuori dalla plastica può verificarsi durante il saggio, e questo è esacerbato nei quattro pozzi d'angolo. - Una volta che tutte le isole sono state trasferite alla microplacca sferoide, incubare la microplacca in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, non CO2, mentre si completano le fasi riportate di seguito.
- Isolottie pancreatici a selezione a mano in un piatto di coltura cellulare da 60 mm x 15 mm contenente supporti assemblati per ottenere una purezza vicina al 100%.
- Caricare la cartuccia del sensore ed eseguire il saggio
- Rimuovere la cartuccia del sensore dall'incubatrice. Le porte A-C per ogni pozzo devono essere caricate con farmaci o supporti. Pozzi contenenti isolotti e i quattro pozzi d'angolo dovrebbero essere caricati con droga. I pozzi non angolari senza isolotti devono essere caricati con supporti. La porta D può essere lasciata vuota. Porta di carico A (in alto a sinistra di ogni sensore) con 20 l di oligomycin o supporto. Porta di carico B (in alto a destra) con 22 - L di FCCP o supporto. Porta di carico C (in basso a sinistra) con 25 - L di Rotenone/AA o supporto.
- Programmare un test dell'analizzatore di flusso extracellulare per un periodo di respirazione di base di 30 minuti (5 cicli di mix 3 minuti, misura 3 minuti), 42 minuti di misurazione dell'oligomicina (7 cicli di mix di 3 minuti, misura 3 minuti), 30 minuti FCCP (5 cicli di mix 3 minuti, misura 3 minuti) e 30 minuti Rotenone/AA (5 cicli di mix 3 minuti, 3 minuti di misura).
- Eseguire il saggio e seguire le istruzioni sullo schermo per calibrare il sensore e inserire la micropiastra.
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Representative Results
Per caricare le isole in microplacca, 15 isolotti devono essere aspirati in 15 - L di supporto, come mostrato Figura 1A. Le isole si stabiliranno naturalmente verso il fondo della punta del tubo in pochi secondi. Quindi, la punta del pipet viene abbassata sul fondo del pozzo. La punta è molto leggermente sollevata, e un piccolo volume (circa 5 ) viene convogliato insieme alle isole. Questa tecnica si traduce in un posizionamento coerente dell'isolotto nella parte inferiore del pozzo della micropiastra (Figura 1B) consentendo misurazioni accurate del consumo di ossigeno.
La figura 2 mostra i risultati rappresentativi per pozzo individuale per il consumo di ossigeno in tutto il test. Questo particolare esperimento dimostra cosa può accadere quando i pozzi vengono caricati male, con molte isole bloccate sui lati del pozzo piuttosto che sul fondo del pozzo. Questo può essere causato dal pipettaggio troppo media nel pozzo dopo che le isole sono già state pipetted fuori dalla punta. Il flusso di supporti aggiuntivi spinge le isole dal fondo del pozzo. Quando questo accade, il livello di base del consumo di ossigeno sarà molto basso, e questo pozzo mostrerà poca o nessuna risposta a FCCP. La linea in grassetto in Figura 2 dimostra questo fenomeno.
La figura 3 mostra un esperimento diverso in cui la maggior parte dei pozzi mostra una respirazione e una risposta significative alla base di base. Tuttavia, due pozze (con linee in grassetto) non hanno mostrato alcuna risposta a rotenone/AA. Questo suggerisce che il farmaco non è stato rilasciato correttamente nel pozzo. In questo caso, come per i casi di non consumo basale di ossigeno, questi pozzi possono essere esclusi da ulteriori analisi.
Figura 4 Mostra i risultati di un test di successo. Qui mostriamo un esempio di dati di riepilogo da un esperimento separato in cui i pozzi sono stati caricati correttamente con isolotti e iniettati correttamente con farmaci. Il consumo di ossigeno mitocondriale dipendente dall'ATP è stato effettivamente inibito dall'oligomicina, dal massimo respirazione al di sopra dei livelli basali, e la respirazione mitocondriale è stata completamente arrestata al di sotto dei livelli di oligomicina- inibizione della catena di trasporto degli elettroni con rotenone/AA.
Figura 1: Tecnica di tubazione per il caricamento di isolotti in microplacca. (A) Circa 15 isolotti (freccia rossa) convogliati con 15 - L di supporti. (B) Isole centrate nella parte inferiore della micropiastra sferoide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: variabilità ben a pozzo a causa della differenza nel carico dell'isolotto. Pozzi caricati impropriamente (linea blu audace) mostrano poco o nessun consumo di ossigeno basale e minima risposta ai farmaci di stress cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Guasto dell'iniezione di droga. Due pozze (linee blu grassetto) non sono stati iniettati con rotenone/AA e non mostrano una diminuzione significativa del consumo di ossigeno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Media dei dati in tutti i pozzi di un esperimento dopo l'esclusione di pozzi scaricati o iniettati in modo inadeguato. Consumo medio di ossigeno durante l'analisi della prova di stress cellulare in un esperimento separato che include 16 repliche tecniche. Le barre di errore mostrano la deviazione standard per n - 16 pozze. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Lo studio del consumo di ossigeno alle isole è stato in precedenza ostacolato dalla forma sferica delle isole, dalla loro mancanza di aderenza alle superfici di coltura e dal numero di isolotti necessari per ogni pozzo. In questo protocollo, mettiamo in evidenza l'efficacia della micropiastra sferoide da 96 pozzetto per misurare il consumo di ossigeno nelle isole su un piccolo numero di isolotti e dimostriamo una tecnica per la movimentazione e il caricamento delle isole tecnicamente fattibile e che produce Risultati.
Affinché le isole aderiscano al fondo della micropiastra ed essere imperturbabili durante le fasi di miscelazione durante tutto il saggio, la micropiastra a 96 pozzetti viene rivestita con una soluzione adesiva cellulare il giorno prima del saggio. Mentre questo è generalmente vantaggioso, se le isole non vengono caricate correttamente sono suscettibili di attaccare al lato del pozzo piuttosto che al fondo, influenzando o precludendo la misurazione accurata. Per combattere questo, si consiglia di rivestimento pozzi con un volume molto piccolo di soluzione adesiva-solo 20 -L. Inoltre, la tecnica di pipettaggio dimostriamo assicura che le isole vengono caricate sul fondo del pozzo e non spinte verso l'alto i lati dal flusso di supporti aggiuntivi .
La micropiastra sferoide da 96 pozzetti ha superato i precedenti limiti di misurazione del consumo di ossigeno alle isole, tra cui l'elevato numero di isolotti necessari e il numero di condizioni che possono essere testate contemporaneamente. Infatti, un recente studio10 ha dimostrato l'uso di questo sistema con una singola isolotto umano per pozzo. Tuttavia, la misurazione del consumo di ossigeno mediante singoli isolotti ha comportato misurazioni basali molto basse del consumo di ossigeno, che erano significativamente al di sopra dello sfondo solo nelle isole più grandi (diametro superiore a 290 m). Gli isolotti nHP tendono ad essere più piccoli degli isolotti umani, con un diametro medio di soli 150 m15. Nelle nostre mani, 15 isolotti NHP per pozzo hanno mostrato una linea di base più alta e un profilo più reattivo durante la prova di stress cellulare rispetto a un minor numero di isolotti. Abbiamo anche testato cinque e dieci isolotti per pozzo, ma abbiamo scoperto che il consumo di ossigeno basale e il segnale al rumore sono stati significativamente ridotti.
Oltre alla possibilità di utilizzare un basso numero di isolotti per pozzo, la micropiastra da 96 pozzetti consente il test di più condizioni diverse contemporaneamente. Questo è utile nei casi in cui le isole sono trattate con diversi composti o geneticamente manipolate. Tuttavia, quando si confrontano gruppi di isole di primati umani o non umani che provengono da fonti diverse (ad esempio, ilesti diabetici rispetto ai lestioni non diabetici), i campioni vengono spesso ricevuti in giorni diversi. Pertanto, in questi casi non è possibile sfruttare appieno questo sistema.
Al fine di quantificare vari aspetti del consumo di ossigeno mitocondriale, abbiamo manipolato diversi aspetti della respirazione farmacologicamente. Le concentrazioni di farmaci utilizzati si basavano su uno studio pervioso nelle isole umane10. La dose di FCCP è stata ottimizzata per indurre la respirazione mitocondriale massima nelle nostre mani. In particolare, la concentrazione di oligomicina era di 4,5 m, fcCP di 1 M, e rotenone/AA era di 2,5 m. Tuttavia, queste concentrazioni probabilmente devono essere calibrate per diverse applicazioni di questo protocollo.
I dati prodotti possono essere analizzati direttamente o normalizzati utilizzando una serie di metodi. In questo esperimento, per ogni campione è stato utilizzato un numero uguale di isole di dimensioni simili e i dati non sono stati normalizzati dal numero di cellulare o dalla dimensione dell'isolotto, il che può essere difficile da quantificare direttamente. Un metodo alternativo di normalizzazione è la proteina cellulare totale, che comporta lising delle cellule dopo l'esecuzione dell'analisi e la quantificazione dei livelli proteici. I dati possono anche essere normalizzati a livelli di respirazione basale. Ciò può essere informativo in alcuni casi, come la quantificazione della capacità di riserva come percentuale dei livelli basali. Tuttavia, con questi metodi di normalizzazione e altri, le informazioni possono andare perse durante la normalizzazione come descritto in precedenza16.
Il sistema qui descritto fornisce uno strumento unico per comprendere meglio la fisiologia delle isleterie. Infatti, l'importanza del consumo di ossigeno nella salute delle isolote è dimostrata dall'osservazione che i tassi di consumo di ossigeno nelle isolote sono strettamente legati alla salute dell'isolotto e alla probabilità di successo del trapianto di isolotto17. Questo sistema fornisce un'eccellente piattaforma per una quantificazione coerente del consumo di ossigeno alle isoloti che, in teoria, può essere applicata anche a sferoidi coltivati di dimensioni simili.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere il Vanderbilt High Throughput Screening Core per l'uso delle loro strutture, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) per isolazioni di isolotti di primati non umani, e Eric Donahue (Vanderbilt University) per l'assistenza con Figura 1. J.M.E. è stato sostenuto dal NIGMS del National Institutes of Health con il numero di premio T32GM007347. M.G. è stato supportato dal NIH/NIDDK (R24DK090964-06) e dal Department of Veterans Affairs (BX003744).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
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