Summary
Denne protokoll demonstrerer nøyaktig og reproduserbar måling av oksygen forbruket i ikke-menneskelige primater bukspyttkjertelen holmer. Holmen lasting teknikker og belegg av mikroplate gir et rammeverk for effektiv måling av åndedrett i andre typer kultivert spheroids.
Abstract
Måling av oksygen forbruket i spheroid klynger av celler, slik som ex vivo bukspyttkjertelen holmer, har historisk vært utfordrende. Vi viser måling av Holme oksygenforbruk ved hjelp av en 96-brønn mikroplate designet for måling av oksygen forbruket i spheroids. I denne analysen, spheroid mikroplater er belagt med en celle og vev lim på dagen før analysen. Vi bruker et lite volum av selvklebende løsning for å oppmuntre Holme tilslutning til bare bunnen av brønnen. På dagen for analysen, er 15 holmer lastet direkte inn i bunnen av hver brønn ved hjelp av en teknikk som sikrer optimal posisjonering av holmer og nøyaktig måling av oksygenforbruk. Ulike aspekter ved mitokondrie åndedrett er analysert farmakologisk i ikke-menneskelige primater holmer, inkludert ATP-avhengig åndedrett, maksimal åndedrett, og Proton lekkasje. Denne metoden gir konsistente, reproduserbar resultater med bare et lite antall holmer per brønn. Det kan teoretisk brukes til enhver kultivert spheroids av tilsvarende størrelse.
Introduction
For å opprettholde normale blodsukker nivåer må celle i bukspyttkjertelen føle økning i glukose og skille insulin tilsvarende. Koplingen av insulin sekresjon med glukose nivåer er direkte knyttet til glukose metabolisme og produksjonen av ATP gjennom mitokondrie oksidativt fosforylering. Dermed mitokondrier spille en avgjørende rolle i stimulans-sekresjon kopling1. Vurdering av β-celle mitokondrie funksjon kan avdekke defekter som fører til nedsatt insulin sekresjon. Utskillelsen av glukagon av bukspyttkjertelen α-celler er også nært knyttet til mitokondrie funksjon2. Selv om udødeliggjort Holme Cell Lines har vist seg nyttig for enkelte typer analyser, fysiologi av disse cellene ikke nøyaktig recapitulate hele Holme funksjon, som illustrert av potensiering av insulin sekresjon av glukagon3,4 og hemming av glukagon sekresjon av insulin/somatostatin5,6 i intakt holmer. Dette demonstrerer behovet for måling av oksygenforbruk ved bruk av hele, intakte holmer.
Teknikker for måling av holmen celle respirometry har utviklet seg over tid, fra bruk av oksygen-sensitive fluorescerende fargestoffer7 til solid-state sensorer som direkte måler oksygenforbruk8. Opprinnelig utviklet for monolag, tilhenger celler, brukte cellekultur plate systemer har vist seg å være ineffektiv for bukspyttkjertelen holmer. Som holmer ikke naturlig holder seg til brønnene, er de tilbøyelige til å bli skjøvet til periferien av kulturen godt resulterer i unøyaktig måling av oksygenforbruk9. For å bekjempe dette problemet, spesialiserte 24-brønn plater med en sentral depresjon som kan inneholde holmer ble utviklet9. Men 24-brønn plate systemet var begrenset av det store antallet holmer som kreves (50-80 per brønn) og antall forhold som kan testes samtidig10. Den nylige utviklingen av 96-brønn mikroplater utformet spesielt for ekstracellulære Flux analyse i spheroids har overvunnet disse barrierene, slik at måling av Holmen respirometry med 20 eller færre holmer per brønn10.
Her viser vi bruken av dette systemet til å måle oksygen forbruket i holmer fra den japanske macaque (Macaca fuscata), en dyremodell med lignende Holme Biology til mennesker11,12. I denne protokollen analyseres 15 macaque holmer per brønn. I våre hender, 15 holmer per brønn produserte høyere Baseline oksygenforbruk enn færre holmer, med robust aktivering og undertrykkelse av åndedrett som svar på Pharmacologic manipulasjon. Vi fremhever fremgangsmåten for å forberede analysen, en effektiv metode for konsekvent lasting av holmer i sentrum av hver brønn, og felles utfordringer når du utfører denne analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av Mikroplate og sensor patron på dagen før du kjører analysen
Holmer ble isolert fra tre år gamle japanske aper som tidligere beskrevet13. Denne metoden er svært lik den som brukes til å isolere menneskelige holmer fra Cadaver donorer, men skiller seg fra mus, der pancreata er ofte oppblåst med kollagenase løsning mens dyret er under sedasjon og før organ fjerning. Islet henting ble gjennomført i samsvar med retningslinjene i den institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Oregon National primater Research Center (ONPRC) og Oregon Health and Science University og ble godkjent av ONPRC IACUC. Den ONPRC retter seg etter Animal Welfare Act og forskrift håndheves av USA Department of Agriculture (USDA) og Public Health Service policy på Human Care og bruk av laboratorium dyr i samsvar med guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr publisert av National Institutes of Health.
- Utarbeidelse av spheroid Mikroplate
- Forbered 3 mL av en 0,1 M løsning av natrium bikarbonat. Filteret sterilisere løsningen. Vi benyttet en 0,45 μm filter (tabell av materialer).
- I en cellekultur hette, tilsett 200 μL av celle og vev klebemiddel (tabell av materialer) til 2,8 ml på 0,1 m natrium bikarbonat. Deretter tilsett 20 μL av denne løsningen til bunnen av hver brønn av 96-brønnen spheroid mikroplate (tabell av materialer). Sørg for at luftbobler er fjernet fra Pipet spissen og bare bunnen av platen er dekket. Coating av mikroplate hindrer holmer fra å flytte opp på sidene av brønnene når narkotika tilsettes og blandes inn i brønnen under analysen.
Merk: det er bare nødvendig å belegge så mange brønner som vil bli brukt for holmer når analysen er kjørt. Hvis bare noen få brønner vil bli brukt, kan cellen limet løsningen skaleres ned på riktig måte. Cellen limet som brukes i analysen er en formulert protein løsning utvunnet fra det marine blåskjell. Alternativt kan mikroplate brønner være belagt med 20 μL av 100 μg/mL Poly-D-lysin. - Ruge platen i en 37 ° c, non-CO2 inkubator i en time.
- I et sterilt miljø, aspirer celle lim løsning fra platen. Vask hver brønn to ganger med 400 μL av 37 ° c sterilt vann med en flerkanals Pipet. La det lufttørke.
- Etter 30-40 minutter, dekkplaten og oppbevar over natten ved 4 ° c.
- Hydrering av sensor kassetten
- Åpne sensor patron pakken (tabell over materialer) i et sterilt miljø, og Fjern innholdet. Plasser sensor patronen opp-ned ved siden av verktøy platen.
- Fyll hver brønn av verktøy platen med 200 μL sterilt vann og senk sensor patronen tilbake i verktøy platen. Plasser montert sensor patron og verktøy plate i en 37 ° c, ikke-CO2 inkubator over natten.
- Utarbeidelse av Calibrant
- Alikvot 25 mL calibrant (materialfortegnelsen) til et 50 ml konisk rør. Plasser rør i en 37 ° c, non-CO2 inkubator over natten.
2. protokoll for Media forberedelse, lasting av holmer og lasting av sensor patron på dagen for analysen
- Utarbeidelse av medier
- Til 48,5 mL Base media (minimal DMEM, se tabell av materialer), tilsett 500 μL hver av 1 mm natrium pyruvat og 2 mm glutamin. I tillegg, tilsett 496 μL av 200 mg/ml glukose (endelig konsentrasjon av glukose i Media er 5,5 mM).
Merk: Baseline glukose konsentrasjon ble holdt konstant for disse eksperimentene. Men, glukose kan også brukes til å stimulere åndedrett i tillegg til Pharmacologic manipulasjoner beskrevet blåse10. - Bekreft at pH-verdien er 7,4 +/-0,1, og Juster om nødvendig.
- Til 48,5 mL Base media (minimal DMEM, se tabell av materialer), tilsett 500 μL hver av 1 mm natrium pyruvat og 2 mm glutamin. I tillegg, tilsett 496 μL av 200 mg/ml glukose (endelig konsentrasjon av glukose i Media er 5,5 mM).
- Fremstilling av sensor patron
- Ta sensor patronen ut av inkubator, fjernsensor patron lokket, og dumpe ut vann fra brønner. Plasser 200 mL pre-varmet calibrant i hver brønn og erstatte sensor patron lokket.
- Plasser sensor patronen tilbake i inkubator i ca 1 time (inntil nødvendig).
- Utarbeidelse av medikamenter for mitokondrie stress analysen
- Åpne stress testsettet (tabell over materialer) og Fjern innholdet. Utgjør lager og arbeider løsninger for Oligomycin, karbonyl cyanid-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), og rotenon/Antimycin A (AA) som følger.
- Oligomycin: tilsett 630 μL av monterte medier til rør for å gjøre 100 μM-lager. Deretter fortynnes til 45 μM med Media for å oppnå port konsentrasjon (endelig brønn konsentrasjon etter injeksjon vil være 4,5 μM)
- FCCP: tilsett 720 μL av monterte medier til rør for å gjøre 100 μM-lager. Fortynne til 10 μM med Media for å oppnå port konsentrasjon (endelig brønn konsentrasjon vil være 1 μM)
Merk: BSA og/eller FBS bør ikke legges til i Media, da dette kan påvirke virkningen av mitokondrie uncouplers14. - Rotenon/AA: tilsett 540 μL av monterte medier til rør for å gjøre 50 μM-lager. Fortynne til 25 μM med Media for å oppnå port konsentrasjon (endelig brønn konsentrasjon vil være 2,5 μM)
Merk: ovenstående konsentrasjoner har produsert konsistente resultater i våre hender. Ytterligere FCCP førte til ingen ytterligere økning i respirasjon. Det kan imidlertid hende at konsentrasjonen av legemidlet må justeres avhengig av Holme størrelse, og spesielt med holmer fra forskjellige arter eller ikke-Holme spheroids. For referanse, gjennomsnittlig diameter på en ikke-menneskelig primater Holme er ca 150 μm15.
- Åpne stress testsettet (tabell over materialer) og Fjern innholdet. Utgjør lager og arbeider løsninger for Oligomycin, karbonyl cyanid-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), og rotenon/Antimycin A (AA) som følger.
- Fremstilling av spheroid plate og overføring av holmer
- Plukk bukspyttkjertelen holmer i en 60 mm x 15 mm cellekultur parabolen inneholder monterte medier for å oppnå nær 100% renhet.
Merk: holmer skal vises avrundet, med en klart definert periferi, og vises tettere enn eksokrin vev forurensninger. Unngå holmer som virker skadet eller slitt. I dette eksperimentet ble Holme størrelse ikke direkte målt, selv om vi forsøkte å plukke holmer på omtrent samme størrelse for hver brønn og prøve. - Legg hver brønn av spheroid mikroplate med 175 μL av monterte medier med en flerkanals pipette.
- Ved bruk av en P20 pipette satt til 15 μL, aspirer 15 holmer fra cellekultur parabolen. Holmer skal være synlig i pipette spissen til det blotte øye.
- For å overføre holmer til spheroid mikroplate, Senk pipette spissen til bunnen av brønnen, så vidt Løft opp, og sakte pipette ut et svært lite volum (~ 5 μL). Kontroller at alle holmer har forlatt pipette spissen. Hver brønn skal motta 15 holmer. Noen ganger sjekk spheroid mikroplate under mikroskopet for å verifisere at holmer er på bunnen av hver brønn i stedet stakk til sidene.
Merk: unngå å laste hjørne brønner med holmer. Oksygen og pH Flux ut av plast kan oppstå under analysen, og dette er forverret i de fire hjørne brønner. - Når alle holmer er blitt overført til spheroid mikroplate, ruge mikroplate i en 37 ° c, ikke-CO2 inkubator mens du fullfører trinnene nedenfor.
- Plukk bukspyttkjertelen holmer i en 60 mm x 15 mm cellekultur parabolen inneholder monterte medier for å oppnå nær 100% renhet.
- Legge i sensor patronen og kjøre analysen
- Fjernsensor patronen fra inkubator. Porter A-C for hver brønn må være lastet med enten narkotika eller Media. Brønner som inneholder holmer og de fire hjørne brønnene skal være lastet med narkotika. Ikke-Corner brønner uten holmer skal være lastet med Media. Port D kan stå tomt. Last port A (øverst til venstre for hver sensor) med 20 μL oligomycin eller medium. Last port B (øverst til høyre) med 22 μL av FCCP eller medier. Last port C (nederst til venstre) med 25 μL av rotenon/AA eller medier.
- Program en ekstracellulære Flux analysator analysen for en 30 minutters Baseline åndedrett periode (5 sykluser av 3 minutters mix, 3 minutters mål), 42 minutters oligomycin måleperiode (7 sykluser av 3 minutters mix, 3 minutters mål), 30 minutter FCCP (5 sykluser av 3 minutters mix, 3 minutters mål), og 30 minutter rotenon/AA (5 sykluser av 3 minutters mix, 3 minutters mål).
- Kjør analysen og følg instruksjonene på skjermen for kalibrering av sensoren og innsetting av mikroplate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å legge holmer i mikroplate bør 15 holmer pustende i 15 μL av medier, som vist i figur 1A. Holmer vil naturlig bosette seg mot bunnen av Pipet spissen i løpet av få sekunder. Deretter senkes Pipet spissen til bunnen av brønnen. Spissen er litt løftet, og et lite volum (ca. 5 μL) er Pipet tert ut sammen med holmer. Denne teknikken resulterer i konsekvent plassering av Holmen i bunnen av mikroplate brønn (figur 1B) tillater for nøyaktige oksygenforbruk målinger.
Figur 2 viser representative resultater etter individuell brønn for oksygenforbruk gjennom analysen. Dette bestemte eksperimentet demonstrerer hva som kan skje når brønnene er lastet dårlig, med mange holmer stakk opp på sidene av brønnen i stedet for på bunnen av brønnen. Dette kan forårsakes av pipettering for mye Media inn i brønnen etter at holmer allerede er Pipet tert ut av spissen. Flyten av flere medier presser holmer ut av bunnen av brønnen. Når dette skjer, Baseline nivået av oksygenforbruk vil være svært lav, og denne brønnen vil vise liten eller ingen respons på FCCP. Den uthevede linjen i figur 2 demonstrerer dette fenomenet.
Figur 3 viser et annet eksperiment der de fleste brønnene viste signifikant grunnlinje respirasjon og respons på rusmidler. Men to brønner (med uthevet linjer) viste ingen respons på rotenon/AA. Dette tyder på at stoffet ikke ble skikkelig sluppet inn i brønnen. I dette tilfellet, som med tilfeller av ingen basal oksygenforbruk, kan disse brønnene utelukkes fra videre analyse.
Figur 4 viser resultatene av en vellykket analyse. Her viser vi et eksempel på sammendragsdata fra et eget eksperiment der brønnene ble riktig lastet med holmer og korrekt injisert med narkotika. ATP-avhengige mitokondrie oksygenforbruk ble effektivt hemmet av oligomycin, maksimal åndedrett-godt over basal nivåer-ble indusert av FCCP, og mitokondrie åndedrett ble fullstendig stengt ned-under oligomycin nivåer-ved hemming av elektron transport kjeden med rotenon/AA.
Figur 1: pipettering teknikk for lasting av holmer i mikroplate. (A) ca. 15 holmer (rød pil) Pipet tert med 15 μL av medier. (B) holmer sentrert på bunnen av spheroid mikroplate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: brønn-til-brønn variasjon på grunn av forskjell i Holme lasting. Wells lastet feil (fet blå linje) viser liten eller ingen basal oksygenforbruk og minimal respons på celle stress test narkotika. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: svikt i sprøytenarkoman. To brønner (dristige blå linjer) ble ikke injisert med rotenon/AA og viser ingen signifikant reduksjon i oksygenforbruk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: gjennomsnittsdata på tvers av alle brønner i et eksperiment etter utelukkelse av dårlig belastede eller injisert brønner. Gjennomsnittlig oksygenforbruk gjennom hele cellen stress test analysen i et eget eksperiment, inkludert 16 tekniske replikerer. Feilfelt viser standardavvik for n = 16 brønner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet av Holmen oksygenforbruk har tidligere blitt hemmet av sfærisk form av holmer, deres mangel på overholdelse av kultur overflater, og antall holmer kreves per brønn. I denne protokollen fremhever vi effekten av 96-brønnen spheroid mikroplate for å måle Holme oksygenforbruk på et lite antall holmer og demonstrere en teknikk for håndtering og lasting av holmer som er teknisk gjennomførbart og gir konsistent Resultater.
For at holmer skal holde seg til bunnen av mikroplate og være Uaffisert under blandings trinn gjennom hele analysen, er 96-brønnen mikroplate belagt med en celle selvklebende løsning dagen før analysen. Selv om dette er generelt gunstig, hvis holmer ikke er lagt riktig de er egnet til å holde seg til siden av brønnen i stedet for bunnen, og dermed påvirker eller utelukker nøyaktig måling. For å bekjempe dette, anbefaler vi belegg brønner med et svært lite volum av selvklebende løsning-bare 20 μL. i tillegg, pipettering teknikken vi viser sikrer at holmer er lastet til bunnen av brønnen og ikke skjøvet opp på sidene av flyten av ekstra Media .
96-brønnen spheroid mikroplate har overvunnet tidligere begrensninger for å måle Holme oksygenforbruk, inkludert det høye antallet holmer og antall tilstander som kan testes samtidig. Faktisk, en fersk studie10 demonstrerte bruken av dette systemet med en enkelt menneske Holme per brønn. Men måling av oksygenforbruk ved hjelp av enkelt holmer resulterte i svært lave basal målinger av oksygen forbruket, som var betydelig over bakgrunnen i bare de største holmer (diameter over 290 μm). NHP holmer har en tendens til å være mindre enn menneskelige holmer, med en gjennomsnittlig diameter på bare 150 μm15. I våre hender, 15 NHP holmer per brønn viste høyere Baseline og en mer responsiv profil under celle stress test enn færre holmer. Vi testet også fem og ti holmer per brønn, men fant at basal oksygenforbruk og signal til støy ble betydelig redusert.
I tillegg til muligheten til å bruke et lavt antall holmer per brønn, gir 96-brønnen mikroplate for testing av flere ulike tilstander samtidig. Dette er nyttig i tilfeller der holmer behandles med ulike forbindelser eller genetisk manipulert. Men når man sammenligner grupper av menneskelige eller ikke-menneskelige primater holmer som kommer fra ulike kilder (f. eks, diabetiker versus ikke-diabetiker holmer), er prøvene ofte mottatt på forskjellige dager. Derfor, i disse tilfellene er det ikke mulig å dra full nytte av dette systemet.
For å kvantifisere ulike aspekter ved mitokondrie oksygenforbruk, manipulert vi ulike aspekter av åndedrett farmakologisk. Narkotika konsentrasjonene som ble brukt var basert på en pervious studie i humane holmer10. Dosen av FCCP ble optimalisert for å indusere maksimal mitokondrie åndedrett i våre hender. Nærmere bestemt var konsentrasjonen av oligomycin 4,5 μM, FCCP var 1 μM, og rotenon/AA var 2,5 μM. Disse konsentrasjonene må imidlertid sannsynligvis kalibreres for ulike anvendelser av denne protokollen.
Dataene som produseres kan enten analyseres direkte eller normalisert ved hjelp av en rekke metoder. I dette eksperimentet ble like mange holmer av lignende størrelser brukt for hver prøve, og data ble ikke normalisert etter celle nummer eller Holme størrelse, som kan være vanskelig å direkte kvantifisere. En alternativ metode for normalisering er av total Cellular protein, som innebærer lysering celler etter at analysen er utført og kvantifisere proteinnivåer. Data kan også bli normalisert til basal åndedrett nivåer. Dette kan være informativ i visse tilfeller, for eksempel kvantifisering av reservekapasitet som en prosent av basal nivåer. Men med disse normalisering metoder og andre, informasjon kan gå tapt under normalisering som tidligere beskrevet16.
Systemet er beskrevet her gir et unikt verktøy for å bedre forstå Holme fysiologi. Faktisk er betydningen av oksygen forbruket i Holme helse illustrert ved observasjon at Holme oksygenforbruk priser er nært knyttet til Holme helse og sannsynligheten for vellykket Holme transplantasjon17. Dette systemet gir en utmerket plattform for konsistent kvantifisering av Holme oksygenforbruk som kan, i teorien, også brukes på alle tilsvarende størrelse kultivert spheroids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Vanderbilt High gjennomstrømming screening Core for bruk av deres anlegg, Agilent bioteknologi, Dr. Paul kievit (Oregon Health and Science University) for ikke-menneskelige primater Holme isolasjoner, og Eric Donahue (Vanderbilt University) for å få hjelp med figur 1. J.M.E. ble støttet av NIGMS av National Institutes of Health under tildeling nummer T32GM007347. M.G. ble støttet av NIH/NIDDK (R24DK090964-06) og Department of Veterans Affairs (BX003744).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).
