Summary
Este método descreve a avaliação das mudanças globais na topologia da cadeia de ubiquitina. A avaliação é realizada pela aplicação de uma abordagem de proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa.
Abstract
A avaliação do perfil global das topologias da cadeia de ubiquidades dentro de um proteome é de interesse para responder a uma ampla gama de perguntas biológicas. O protocolo aqui delineado aproveita a modificação di-glicina (-GG) deixada após a digestão tripptic da ubiquitina incorporada em uma cadeia. Ao quantificar esses peptídeos característicos da topologia, a abundância relativa de cada topologia da cadeia de ubiquitina pode ser determinada. As etapas necessárias para quantificar esses peptídeos por um experimento paralelo de monitoramento de reação são relatadas levando em consideração a estabilização das cadeias de ubiquitina. A preparação de controles pesados, lise celular e digestão são descritas juntamente com a configuração adequada do espectrômetro de massa e o fluxo de trabalho de análise de dados. Um exemplo de dados com perturbações na topologia da ubiquitina é apresentado, acompanhado de exemplos de como a otimização do protocolo pode afetar os resultados. Seguindo as etapas traçadas, o usuário poderá realizar uma avaliação global do cenário de topologia da ubiquitina dentro de seu contexto biológico.
Introduction
A regulação estreita da função proteica e da estabilidade é de suma importância, pois são os principais impulsionadores do controle fenotípico da biologia. A função de uma proteína é construída a partir de dois componentes: sua sequência intrínseca de polipeptídeos e quaisquer modificações pós-transicionais (PTMs). Vários PTMs químicos foram identificados, incluindo glicosilação, fosforilação, acetilação e metilação1. Em 1975, Goldstein et al.2 identificaram uma pequena proteína e a chamaram de ubiquitina devido à sua natureza onipresente. A ubiquitina foi considerada importante na degradação da proteína3. No entanto, desde então, foi estabelecido que a função da ubiquitina como molécula de sinalização vai muito além da regulação da estabilidade proteica. A sinalização da ubiquitina está envolvida em uma ampla gama de outras funções biológicas, como estabilização de proteínas, autofagia, controle de ciclo celular e tráfico de proteínas4.
Enquanto outros PTMs são geralmente binários (ou seja, a proteína é modificada ou deixada não modificada) para um determinado local, a ubiquitina pode modificar uma proteína tanto como monômero ou como uma cadeia polimérica, com a própria ubiquitina ligada. Além disso, esta cadeia de poliugenência pode desenvolver-se em várias topologias com a ubiquização da ubiquitina anterior anexando-se a um dos oito locais de ligação5,6. A ubiquitina é transferida por um processo enzimático multipreitado (Figura 1)onde o C-terminus da ubiquitina está ligado a um de seus sete resíduos de liseina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 ou K63) ou o terminal N da ubiquitina anterior (referido como ubiquização M1 ou linear)5,6. Esta topologia de cadeia é a chave para o destino da proteína sob modificação. Por exemplo, a modificação com uma cadeia ligada a K48 ou K11 leva à degradação da proteína modificada no proteasome, enquanto uma cadeia linear é necessária para a ativação da sinalização NF-kB. Assim, a distribuição relativa dessas topologias em cadeia é relevante para uma ampla variedade de questões biológicas.
O uso da espectrometria de massa (MS) é de particular benefício para a análise topologia da cadeia de ubiquitina, pois não depende de interações baseadas em anticorpos ou à afinidade7,8, muitas das quais têm especificidade limitada e não diferenciam entre os vários tipos de cadeia. Uma possibilidade diferente de detecção é usar mutantes de ubiquitina geneticamente modificados. Aqui, uma lise específica é trocada por arginina, que não pode suportar a modificação por ubiquitina. A falta de formação da cadeia de ubiquitina na proteína do substrato é então interpretada como evidência para uma topologia específica9.
A identificação baseada em MS de proteínasubiquitinadas baseia-se no fato de que o C-terminus de ubiquitina contém um resíduo de arginina na posição 74 que é reconhecido pela trippsina durante a preparação proteolítica das amostras para análise de MS, separando a glicina dupla terminal C. Este GlyGly (-GG) permanece ligado ao grupo ε-amino do resíduo de liseina da proteína do substrato. Para a análise de topologia da ubiquitina, a modificação ocorre em um dos sete resíduos de ubiqutina. Isso cria um conjunto de sete peptídeos-chave que carregam um resíduo de liseina que é modificado por GG, específico para cada uma das topologias(Figura 2). Por exemplo, com a topologia K06, a lisina na posição 6 na sequência de aminoácidos será protegida da digestão tripptica com uma modificação de -GG de 114 Da adicionada a esta lisina.
A identificação de peptídeos pré-determinados específicos por MS é referida como proteômica direcionada, ou, mais especificamente, aquisição de peptídeos direcionados10. Dois métodos foram desenvolvidos dependendo do desempenho do espectrômetro de massa que está sendo utilizado. São selecionados monitoramento de reação (SRM), também chamado de monitoramento de reação múltipla (MRM) e monitoramento de reação paralela (PRM). O SRM envolve a seleção de transições constituída pelo precursor m/z e pelo produto íon m/z. Por outro lado, o PRM requer apenas o precursor m/z. Seleção de postes, é realizada uma pesquisa completa dos íons do produto. Isso tem a vantagem de que não é necessária seleção de íons de produtos apropriados para quantitação no espectrômetro de massa específico antes da medição11. Tanto o SRM quanto o PRM podem, dependendo do instrumento, ser agendados. O agendamento é a prática de atribuir uma janela de tempo durante a qual um determinado íon será incluído para análise, pois os peptídeos estão eluvando em tempos de retenção definidos do sistema cromatográfico. Reduzir o número de íons sendo interrogados a qualquer momento aumenta a frequência de interrogatório desses íons programados naquele momento, melhorando assim a precisão dos dados.
Em geral, a aplicação de proteômica direcionada para topologia de ubiquína é a mesma de qualquer outro experimento de proteômica direcionado. No entanto, duas diferenças fundamentais são importantes: primeiro, deve-se considerar a estabilidade das cadeias de ubiquitina. Existem múltiplas enzimas debiquitinadas potentes (DUBs) que rapidamente degradam cadeias sobre a lise celular. As proteases específicas da ubiquitina se enquadram em duas categorias, as tioesterases e metaloproteases. A maioria das hidrolases da ubiquiquitina são tiaesterases e carregam um resíduo de cisteína em seu centro ativo. Ao alquilar este resíduo de cisteína, eles podem ser inativados. Como tal, o uso de tampões de estabilização de ubiquitina contendo agentes alquilantes, como n-ethylmaleimida (NEM), e produtos químicos altamente desnaturados, e manter amostras refrigeradas é vital para uma análise bem sucedida. Em segundo lugar, ao contrário de outros experimentos direcionados, a escolha do peptídeo é fixa. Em um experimento típico direcionado, um peptídeo proteotipado pode ser selecionado para um bom desempenho cromatógrafo e ionização. Para alguns peptídeos característicos da topologia, como o K48, essas propriedades são boas, enquanto para outros, são menos desejáveis. Por exemplo, a cromatografia K33 em uma configuração típica de fase inversa é ruim devido à formação de um perfil de elução esticada, e as propriedades de ionização precárias do peptídeo K27 reduzem sua visibilidade pela MS12.
Neste protocolo, descrevemos como realizar a avaliação topologia da ubiquitina de uma amostra biológica por PRM. Exemplos de dados para o procedimento são apresentados utilizando uma perturbação do proteasome utilizando tratamento inibidor MG-132 em vários tipos de células diferentes.
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Protocol
1. Preparação de um padrão de peptídeo pesado
- Dependendo do fornecedor e da qualidade dos peptídeos pesados comprados, os peptídeos pesados precisarão ser diluídos. Este protocolo utilizou as sequências de peptídeos relatadas na Tabela 1, com o aminoácido terminal C modificado para lisina (13C615N2-lysine) ou Arginina (13C615N4-arginina).
- Misture os peptídeos pesados, diluindo a mistura com 50% de acetonitrila (ACN) para criar uma mistura de peptídeos com cada peptídeo a 10 μM.
- Crie alíquotas da mistura de peptídeos e armazene a -80 °C.
2. Preparação da amostra
- Lise amostral
NOTA: A estabilidade das cadeias de ubiquitina deve ser considerada durante a preparação da amostra. Mantenha amostras biológicas e tampões refrigerados a 4 °C e adicione amostras ao tampão de estabilização da ubiquitina o mais rápido possível.- Prepare uma solução de 1 M NH4HCO3 (bicarbonato de amônio) na água e ajuste o pH para 8 usando 1 M NaOH.
- Prepare uma solução de 200 mM N-ethylmaleimida (NEM) na água.
- Prepare o tampão de estabilização da ubiquitina usando 8 M de ureia em 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. O tampão de estabilização da ubiquitina deve ser preparado fresco a cada vez.
NOTA: Uma solução de 5 mL de 8 M de ureia exigirá consideravelmente menos de 5 mL de água dada a expansão da água quando em uma solução saturada com ureia.
ATENÇÃO: Não prepare o tampão acima de 50 °C devido à tendência da ureia de formar poliureia a altas temperaturas. - Resuspenque a amostra biológica a ser investigada no tampão de estabilização da ubiquitina visando 0,5 μg/μL de proteína e lise as células com um método apropriado para a amostra. Um método de sonicação composto por três pulsos de 10 s com um sonifier SFX 150 Branson definido com 70% de intensidade com quebras de 10 s no gelo entre cada pulso, foi usado para as linhas celulares neste protocolo.
- Amostra de centrífuga a 18.000 x g por 10 min a 4 °C em uma centrífuga de mesa.
- Transfira supernante para um tubo de microcentrifuge de baixa proteína fresco. As amostras podem ser armazenadas a -20 °C neste ponto, se necessário.
- Preparação de amostras e controles
- Se as amostras estiverem congeladas, misture (por exemplo, com um termomixer) enquanto elas são descongeladas para dissolver rapidamente a ureia.
ATENÇÃO: Não utilize temperaturas acima de 50 °C devido à tendência da ureia de formar poliureia a altas temperaturas. - Amostra de centrífuga a 18.000 x g por 10 min a 4 °C em uma centrífuga de mesa.
- Transfira 20 μg de amostra para um tubo de microcentrifusidade de baixa ligação fresco e ajuste o volume para 50 μL com tampão de estabilização da ubiquitina.
- Crie um controle negativo usando um volume normalizado de tampão de estabilização da ubiquitina (50 μL). Nesta amostra, nenhuma versão leve de cada peptídeo deve estar presente, permitindo a observação de qualquer contaminação leve decorrente dos peptídeos pesados. Este controle negativo também foi utilizado para o agendamento do tempo de retenção do PRM descrito na seção 3.1.
- Também foi criado um controle positivo com o tampão de estabilização da ubiquitina e a adição de tipos de cadeia comercialmente disponíveis ao volume normalizado de tampão de estabilização da ubiquitina (50 μL). Comumente, K63, K48 e M1 estão disponíveis. Nos resultados representativos foram utilizados 20 ng de K48, K63 e M1.
- Se as amostras estiverem congeladas, misture (por exemplo, com um termomixer) enquanto elas são descongeladas para dissolver rapidamente a ureia.
- Redução, alquilação e digestão
- Prepare uma solução de 50 mM de bicarbonato de amônio (NH4HCO3) na água e ajuste a amostra para pH = 8 com 1 M NaOH.
- Uma cultura de E. coli cultivada em caldo LB foi centrifugada 5.000 x g por 5 min para formar uma pelota, que foi então lavada 2x com PBS antes da resuspensão no tampão de estabilização da ubiquitina a 5 μg/μL.
- Adicione 1 μg de E. coli lysate a cada amostra e controle. Este protocolo usa E. coli (DH10B), mas qualquer lise complexa sem ubiquitina pode ser usada. Note que a ubiquitina é comum a todos os eucariotes.
NOTA: O uso de uma matriz de e. coli lysate reduz a perda de peptídeos devido à adesão inespecífica ao plasticware. Isso é particularmente perceptível no controle negativo ou amostras com um teor proteico limitado e tem um forte impacto na observação de K6312. - Prepare uma solução de 500 mM tris (2-carboxyethyl)fosphine (TCEP) em água de grau MS (DTT pode ser usado como alternativa).
- Reduza as amostras e controles pela adição de TCEP a uma concentração final de 50 mM. Vórtice brevemente antes de incubar por 30 minutos à temperatura ambiente (RT). Se o DTT for usado, a temperatura deve ser elevada para 50 °C.
ATENÇÃO: Não utilize temperaturas acima de 50 °C devido à tendência da ureia de formar poliureia a altas temperaturas. - Prepare uma solução de 550 mM de cloroacetamida (CAA) em NH4HCO3. Guarde no escuro.
- Aquilosar as amostras e controles adicionando CAA a uma concentração final de 55 mM. Vórtice brevemente antes de incubar por 20 minutos no RT no escuro.
NOTA: O CAA é usado em vez de iodoacetamida como agente de redução para diminuir a chance de uma modificação dupla carbamidometila (114.0429) em um resíduo de liseina sendo confundido com uma modificação de -GG (114.0429)13. - Adicione endopeptidase LysC às amostras a 1:25 (w/w) razão ao teor de proteína. Incubar por 3h a 37 °C.
- Diluir as amostras e controles com 200 μL de 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).
- Adicione trippsina às amostras na proporção de 1:25 w/w com o teor de proteína. Incubar por 12 h a 37 °C.
- Adicione 10% de solução de ácido fórmico (FA) na água de grau MS a uma razão de 1:10 v/v para cada amostra de amostra e controle. Verifique se o pH é <3) antes da limpeza C18 e adicione mais ácido fórmico, se necessário.
- A cada amostra e controle adicione 0,5 μL do padrão de peptídeo pesado criado na seção 1.
- Limpeza de peptídeos
- Vários fabricantes oferecem c18 dicas de limpeza ou placas. Siga as instruções do fabricante para o produto utilizado, e peptídeos elucidos secos em uma centrífuga a vácuo, pronta para análise em MS.
3. Análise por LC-MS/MS
- Execute a análise inicial de PRM sobre o padrão de peptídeo pesado de forma não programada.
- Resuspenque as amostras secas em 10 μL de tampão de carga de MS 2% ACN/0,05% ácido trifluoroacético (TFA).
- Equipar um HPLC com uma coluna analítica de fase inversa C18 (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 contas) projetado para nanofluxo MS. Formar gradientes lineares trocando água de grau MS complementada com FA de 0,1% com ACN contendo 0,1% fa. Uma coluna de armadilha sacrificial (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 Å C18 contas) para preservar a vida da coluna analítica foi usada aqui, mas não é necessária.
- Junte a saída da coluna analítica a uma fonte nano-ESI em um espectrômetro de massa de alta resolução.
- Utilize um método de proteômica direcionado adequado para o espectrômetro de massa. Por exemplo, em um Q-Exactive mais um método de dois experimentos, ciclo entre um Full MS e um experimento PRM. Para o experimento Full MS, foi utilizada uma resolução de 120.000 com uma meta AGC de 1e6 e 240 ms como TI Máxima. Para o experimento PRM, o mesmo alvo AGC e TI máxima foi utilizado com uma resolução menor de 60.000 e uma janela de isolamento de 1,2 m/z.
- Injete 200 ng do controle negativo na coluna analítica usando o painel automático HPLC. Aplique um gradiente linear à amostra na coluna analítica aumentando a concentração de ACN de 2-25% durante um período de ~45 min.
NOTA: A concentração de 25% de ACN é menor do que o habitual para proteômica devido à baixa natureza hidrofílica dos peptídeos típicos característicos da ubiqutina. Se outros peptídeos forem quantificados, uma maior concentração de ACN pode ser desejada para alcançar uma boa separação de alvos. - Analise os resultados da execução de agendamento conforme descrito na seção 4.2 para criar uma lista de inclusão programada.
- Análise das amostras
- Execute as amostras restantes conforme descrito para o agendamento em 3.1, além do uso da lista de inclusão programada criada na seção 4.2.
NOTA: Um branco deve ser executado após o controle positivo para garantir que nenhuma transferência da execução anterior esteja sendo detectada em amostras subsequentes.
- Execute as amostras restantes conforme descrito para o agendamento em 3.1, além do uso da lista de inclusão programada criada na seção 4.2.
4. Análise de software
- Crie uma lista de inclusão de formatação adequada para o MS utilizado. Este protocolo utilizou o software de código aberto Skyline (versão 19.1.0.193) (https://skyline.ms), que oferece suporte e ajuda bem documentados. Uma lista de inclusão pode ser criada para vários espectrômetros de massa usando a instalação da lista de isolamento de exportação.
- Abra um novo documento do Skyline.
- Selecione modificações de isótopos pesados conforme apropriado para peptídeos pesados característicos da topologia. Em Configurações| Configurações de peptídeos na guia Modificação, clique no campo de nome para ver a modificação potencial. A seleção é baseada no estado isotópico dos peptídeos pesados comprados. Neste exemplo, peptídeos sintéticos transportando uma Lysine pesada (13C615N2-lysine) ou uma Arginina pesada (13C615N4-arginina) no C-terminus foram usados. Os rótulos apropriados seriam: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" e "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".
- Selecione Configurações| Transição. Na guia Filtro incluem Cargas precursoras 2, 3, 4.
- Insira peptídeos selecionando Editar| Insira| Peptídeos.
- Preencha os campos relevantes, incluindo a sequência de peptídeos características da topologia e um nome de proteína (por exemplo, "Chain–K63").
- Expanda cada peptídeo agora mostrado no painel Targets. Exclua estados de cobrança indesejados. O estado de carga preferencial e a energia de colisão, que podem diferir com base no espectrômetro de massa utilizado, para cada peptídeo característico da topologia é mostrado na Tabela 1.
- Para cada peptídeo característico da topologia (exceto para M1 onde o GG está incluído na sequência) clique com o botão direito do mouse na sequência e selecione Modificar. Adicione um GG como uma modificação estrutural clicando no campo de nome e selecionando <Mostre tudo... > antes de selecionar "GlyGly (K)".
- Exportar a lista de isolamento Arquivo| Exportação| Lista de isolamento,selecione o tipo de instrumento e defina o tipo de método como Padrão. A seleção ok abrirá um prompt para salvar um arquivo *.csv que pode ser usado para criar um método PRM.
- Crie uma lista de inclusão programada com base em uma execução de agendamento de peptídeos pesados explicada aqui usando o software Skyline de código aberto.
- Crie uma lista de destinos descrita na seção 4.1.
- Importe o agendamento executado em 3.1 selecionando Arquivo| Importação| Resultados.
- Revise as identificações. O sinal pesado para cada peptídeo é observável clicando na massa para cada entrada de peptídeo pesado. O reconhecimento correto do pico é frequentemente determinado automaticamente, mas o software pode exigir curadoria manual selecionando o pico usando clique e arraste sob o eixo x.
- Os tempos de retenção selecionados para as variantes pesadas também são aplicados às versões leves, criando assim um cronograma para o PRM. A janela de agendamento pode ser modificada em Configurações| Configurações de peptídeos usando a guia Previsão, alterando a janela de tempo.
- Uma lista de inclusão programada agora pode ser exportada usando File| Exportação| Lista de isolamento e seleção do tipo de instrumento e tipo de método de configuração apropriados para agendado.
- Analise os dados.
- Importe as amostras da mesma forma que para a análise de agendamento na seção 4.2.
- Após a importação completa de todas as amostras, recomenda-se a curadoria das transições. Este é o processo pelo qual as transições com a interferência ou as más relações sinal-ruído são removidas. Um exemplo de cromatograma antes e depois da curadoria é mostrado na Figura 4.
- Os dados agora podem ser exportados com o botão direito do mouse em gráficos relevantes e selecionando dados de cópia ou selecionando Arquivo| Exportação| Resultados.
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Representative Results
Para demonstrar o uso de uma análise da cadeia de ubiquitina pela PRM, foram selecionadas três linhas celulares: uma linha celular de melanoma de camundongos B16, e as duas linhas celulares humanas comuns A549 (células epitriliais basoeliares adenocarcinômicas) e HeLa (células cancerígenas cervicais). Essas culturas cresceram para a fase média em mídia adequada antes de serem tratadas com 0, 10 ou 100 mM MG-132 por 4h antes da colheita. MG-132 é um inibidor proteasome que previne a degradação de proteínas conjugadas pela ubiquína pelo proteasome14. Dado isso, é uma condição de teste adequada para demonstrar a análise da cadeia de ubiquitina. O aumento resultante da cadeia K48 pode ser visto na Figura 3. O tratamento inibidor proteasome induziu um aumento nas cadeias K4815.
Conforme descrito na introdução, ao contrário do SRM ou MRM, a PRM realiza uma varredura completa de íons de produto após a seleção do íon precursor. Embora isso signifique que os íons do produto não precisam ser especificados antes da execução, eles ainda devem ser curados após a execução. A curadoria é o processo pelo qual são selecionadas transições verdadeiramente representativas do peptídeo pretendido. A Figura 4 mostra o cromatograma de íon do produto para K48 antes e depois da curadoria. Íons de produtos que têm um sinal com um perfil de elução inconsistente provavelmente devido à interferência foram removidos. Os íons do produto de baixa intensidade foram então removidos, dado que a relação sinal-ruído é menos favorável para tais transições. As transições ideais selecionadas durante a curadoria serão comumente consistentes entre os experimentos, podendo diferir dependendo do espectrômetro de massa utilizado, condições cromatográficas, configurações de análise e o fundo biológico da amostra. Assim, para cada investigação é necessária a curadoria adequada das transições. Também é necessário um equilíbrio entre a inclusão de mais transições e, portanto, réplicas técnicas e dados mais limpos para quantificação.
Cromatografias típicas de íons de produto para cada uma das topologias identificadas da cadeia de ubiquência neste experimento são mostrados na Figura 5. K27 e K29 são omitidos aqui porque sob estas condições biológicas o sinal estava abaixo da detecção. O perfil de elução do K33, como mostrado aqui, foi consideravelmente mais amplo do que seria comumente aceito para análise prm. No entanto, a seleção alternativa de peptídeos com melhores perfis de elução não é possível na análise da cadeia de ubiquitina e uma interpretação deve ser feita com base nesse perfil. Se o K33 é de interesse particular, as condições cromatográficas alteradas podem melhorar a quantificação desse tipo de cadeia, mas provavelmente em detrimento de outros tipos de cadeia.
Ao projetar um experimento PRM, é preferível maximizar o sinal dos íons do produto usados para quantificação aumentando o sinal-ruído. A otimização da energia de colisão (ou seja, a energia utilizada pelo espectrômetro de massa para fragmentar íons peptídeos precursores aos íons do produto) é um dos meios pelos quais o sinal pode ser melhorado16. Uma faixa de energia de colisão de 14 a 28 foi aplicada a injeções repetidas de uma única amostra com as áreas de pico observadas resultantes de K63 e M1 mostradas na Figura 6. Como se pode ver, para K63 uma maior energia de colisão de 26 foi ótima, enquanto para M1 uma energia menor de 18 era ideal. A energia de colisão para cada peptídeo característico da topologia e uma seleção de fragmentos de ubiquitina não modificadas é mostrada na Tabela 1. Essas energias de colisão podem precisar ser otimizadas com base no espectrômetro de massa e no método de fragmentação utilizado.
Figura 1: Representação esquemática da cascata conjugal da ubiquitina. A ubiquitina é primeiramente vinculada por uma enzima E1 de uma maneira dependente de ATP. A ubiquitina ativada é então transferida para uma enzima E2 que é então acompanhada por um E3-ligase para transferir a ubiquitina para a proteína do substrato. Este processo é repetido várias vezes até que uma cadeia de ubiquitina é formada na proteína do substrato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diagrama mostrando a derivação do peptídeo característico da topologia da ubiquitina. Digestão pós-tripptica o local de ligação a montante é derivado do terminal C -GG da ubiquitina a jusante anexada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação da cadeia K48 sob tratamento MG-132 para uma linha de células de camundongos B16 e as duas linhas celulares humanas A459 e HeLa. No A459, o aumento das concentrações de MG-132 levou à estabilização das cadeias K48. Com as células B16 e HeLa, foi observado um aumento em tratamento com 10 mM ou 100 mM MG-132. A diminuição observada de 10 mM para 100 mM pode ser explicada pelo aumento da sensibilidade das células B16 e HeLa para MG-132, levando à morte celular. As barras de erro mostram o desvio padrão das transições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Cromatografias de íons de produto do peptídeo característico da topologia M1 antes e depois da curadoria de transições para interferência ou baixa intensidade. O tempo de retenção no eixo x é mostrado em minutos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Cromatografia típica do produto de vários peptídeos característicos da topologia, bem como dois peptídeos de ubiquitina não modificados. O tempo de eluição em minutos e o erro de massa observado para cada peptídeo é relatado acima do ápice do pico relevante. Linhas pontilhadas também mostram a janela para determinação da área de pico. O tempo de retenção no eixo x é mostrado em minutos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Área de pico observada para K63 e M1 sobre uma série de energias de colisão normalizadas. As cores diferentes representam a intensidade de íons contribuída por cada transição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tipo de cadeia | Peptídeo característico da topologia | Estado de carga | Energia de colisão normalizada |
| K06 | MQIFVK[GG]TLTGK | 3 | 18 |
| K11 | TLTGK[GG]TITLEVEPSDTIENVK | 3 | 18 |
| K27 | TÍTULOVEPSDTIENVK[GG]AK | 3 | 18 |
| K29 | AK[GG]IQDK | 2 | 22 |
| K33 | IQDK[GG]EGIPPDQQR | 3 | 18 |
| K48 | LIFAGK[GG]QLEDGR | 3 | 24 |
| K63 | TLSDYNIQK[GG]ESTLHLVLR | 4 | 26 |
| M1 (linear) | GGMQIFVK | 2 | 18 |
| Ubqiuitin não modificado | ESTLHLVLR | 2 | 26 |
| Ubqiuitin não modificado | TÍTULOVEPSDTIENVK | 2 | 18 |
| Ubqiuitin não modificado | TLSDYNIQK | 2 | 18 |
Tabela 1: Sequências para os peptídeos característicos da ubiquologia humana, o estado de carga mais observável e energia de colisão normalizada favorável.
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Discussion
A análise do estado de oniquitina dentro de um proteome é de crescente importância para uma ampla variedade de questões biológicas. A descrição do estado de ubiquiinação de uma amostra deve focar não apenas no perfil das proteínas que estão sendoubiquitinadas, mas também na topologia de tal ubiquiinação. A avaliação dessa topologia por MS direcionada, como descrito aqui, tem um papel em uma ampla gama de investigações biológicas.
Deve-se entender que o protocolo aqui descrito fornece um perfil de topologia global. O uso de uma abordagem proteômica de baixo para cima permite a determinação de peptídeos que foramubiquitinados, incluindo peptídeos de ubiquitina. A observação da ubiquização dos peptídeos de ubiquitina permite a determinação da topologia da cadeia, mas o vínculo com o alvo da ubiquitina está perdido. Assim, a topologia de cadeia particular em qualquer proteína não pode ser determinada, mas um perfil de topologia global é derivado. O método também pode ser combinado com uma estratégia de enriquecimento para fornecer resultados mais direcionados. Tal enriquecimento deve considerar a estabilidade da cadeia e a abundância de cadeias pós enriquecimento. A detecção da topologia da cadeia é limitada pela pureza que a estratégia de enriquecimento proporciona, pois não é possível distinguir uma topologia de ubiquitina ligada a uma proteína contaminante das ligadas à proteína de interesse. O passo crítico neste protocolo, facilitando uma análise bem sucedida, é o equilíbrio da preservação da cadeia de ubiquitina ao digerir a proteína da ubiquitina. Isso é desafiador devido à propensão da quebra da cadeia acoplado à resistência da própria ubiquitina à digestão enzimática. Além disso, a adição de uma matriz de apoio e uma consideração cuidadosa das condições de ESM são necessárias dada a natureza menos favorável de alguns dos peptídeos característicos da topologia à análise espectrométrica de massa cromatográfica líquida.
Embora tenhamos delineado neste protocolo um meio pelo qual todos os tipos de cadeia de ubiquitina podem ser avaliados simultaneamente, também é possível ajustar vários aspectos do protocolo com base na topologia de cadeia particular de interesse. Manipular as condições cromatográficas ou variar as concentrações pesadas de peptídeos pode aumentar a precisão de uma investigação, melhorando os resultados para uma topologia de cadeia específica e adaptando a investigação à questão biológica proposta.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Céline Jeanty por sua ajuda na criação de pelotas celulares com tratamento da MG-132, conforme descrito nos resultados representativos e Elise Mommaerts por sua provisão de pelotas E. coli utilizadas no protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
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