Summary
이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.
Abstract
프로테오메 내의 유비퀴틴 사슬 토폴로지의 글로벌 프로필에 대한 평가는 광범위한 생물학적 질문에 답하는 데 관심이 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 사슬에 통합된 유비퀴틴의 트립틱 소화 후 남은 디 글리신(-GG) 수정을 활용합니다. 이러한 토폴로지 특성 펩티드를 정량화함으로써 각 유비퀴틴 사슬 토폴로지의 상대적 풍부를 결정할 수 있다. 병렬 반응 모니터링 실험에 의해 이러한 펩티드를 정량화하는 데 필요한 단계는 유비퀴틴 사슬의 안정화를 고려하여 보고된다. 무거운 컨트롤, 세포 리시스 및 소화의 준비는 적절한 질량 분광계 설정 및 데이터 분석 워크플로우와 함께 설명됩니다. 유비퀴틴 토폴로지에 대한 혼란을 가진 예제 데이터 세트가 제공되며 프로토콜의 최적화가 결과에 미치는 영향에 대한 예제가 함께 제공됩니다. 설명된 단계를 수행함으로써 사용자는 생물학적 맥락에서 유비퀴틴 토폴로지 환경에 대한 글로벌 평가를 수행할 수 있습니다.
Introduction
단백질 기능 과 안정성의 가까운 조절은 가장 중요 한 중요 한, 그들은 생물학의 phenotypic 제어의 주요 드라이버로. 단백질의 기능은 두 가지 구성 요소로 구성됩니다: 본질적인 폴리펩티드 서열 및 번역 후 변형(PTM). 글리코실화, 인산화, 아세틸화 및 메틸화1을포함한 다양한 화학적 PTM이 확인되었다. 1975년, Goldstein외. 2는 작은 단백질을 확인하고 유비쿼터스 특성으로 인해 유비퀴틴이라고 명명했습니다. 유비퀴틴은 단백질 분해3에서중요한 것으로 나타났다. 그러나, 그 이후로 신호 분자로서의 유비퀴틴의 기능이 단백질 안정성조절을 훨씬 뛰어넘는 것으로 확립되었다. 유비퀴틴 시그널링은 단백질 안정화, 자가식, 세포 주기 제어 및 단백질 인신 매매4와같은 광범위한 다른 생물학적 기능에 관여한다.
다른 PtM은 일반적으로 이진 (즉, 단백질은 변형되거나 수정되지 않은 상태로 방치됨)이지만, 유비퀴틴은 단량제 또는 폴리머 체인으로 단백질을 수정할 수 있으며, 부착된 유비퀴틴 자체가 유비퀴티드화된다. 또한, 이러한 폴리비비퀴티닝 체인은 8개의 연계부위5,6중 하나에 부착된 이전 유비퀴틴의 유비퀴티닝을 통해 여러 토폴로지에서 개발할 수 있다. 유비퀴틴은 유비퀴틴의 C-terminus가 7개의 리신 잔기(K06, K11, K27, K29, K33, K48, K48, K63) 또는 이전 유비퀴틴(Mquitin, U63)의 N-터미널(Mquitin) 또는 이전 유비퀴틴(Mquitin) 또는 N-터미널(Mquitin)에 의해 전달된다. 이 사슬 토폴로지는 수정 하에 단백질의 운명에 열쇠입니다. 예를 들어, K48 또는 K11 연결 체인을 사용하여 수정하면 프로테솜에서 변형된 단백질의 분해를 초래하며, NF-kB 시그널링의 활성화를 위해 선형 체인이 필요하다. 따라서, 이러한 사슬 토폴로지의 상대적 분포는 다양한 생물학적 질문과 관련이 있다.
질량 분광법(MS)의 사용은 항체 기반 또는 친화성 기반 상호 작용7,8에의존하지 않기 때문에 유비퀴틴 사슬 토폴로지 분석에 특히 유익하며, 그 중 상당수는 특이성이 제한되어 있으며 다양한 사슬 유형 사이에서 분화하지 않는다. 다른 검출 가능성은 유전자 변형 유비퀴틴 돌연변이를 사용하고 있습니다. 여기서, 특정 리신은 유비퀴틴에 의한 수정을 지원할 수 없는 아르기닌으로 교환된다. 기판 단백질에 유비퀴틴 사슬 형성의 부족은 다음 특정 토폴로지9에대한 증거로 해석된다.
유비퀴티드 단백질의 MS 기반 식별은 유비퀴틴의 C-종물이 MS 분석을 위한 시료의 프로테오리틱 준비 중에 트립신에 의해 인식되는 위치(74)에 아르기닌 잔류물을 함유하고 있으며, C-말단 이중 글리신을 분리한다는 사실에 근거한다. 이 글리글리(-GG)는 기판 단백질의 리신 잔류물의 ε 아미노 그룹에 부착된 채로 남아 있다. 유비퀴틴 토폴로지 분석을 위해, 유비퀴틴의 7개의 리신 잔류물 중 하나에서 수정이 발생합니다. 이것은 GG에 의해 변형되는 리신 잔류물을 운반하는 7개의 키 펩티드 세트를 생성하며, 각 토폴로지(그림2)에특이적으로 변형된다. 예를 들어, K06 토폴로지를 사용하면 아미노산 서열의 위치 6의 리신은 이 리신에 첨가된 114Da의 -GG 변형으로 트립틱 소화로부터 보호됩니다.
MS에 의한 특정 소정의 펩타이드의 식별은 표적 프로테오믹스, 또는 보다 구체적으로, 표적 펩티드획득(10)이라고한다. 사용되는 질량 분광계의 성능에 따라 두 가지 방법이 개발되었습니다. 이들은 선택된 반응 모니터링(SRM), 또한 다중 반응 모니터링(MRM) 및 병렬 반응 모니터링(PRM)이다. SRM은 전구체 m/z 및 제품 이온 m/z로 구성된 전환 선택을 포함합니다. 반대로 PRM은 전구체 m/z만 필요합니다. 포스트 선택, 제품 이온의 전체 측량 스캔이 수행됩니다. 이는측정(11)에앞서 특정 질량 분광계에 대한 수량에 적합한 제품 이온을 선택하지 않는다는 장점이 있다. SRM과 PRM 은 기기에 따라 예약할 수 있습니다. 스케줄링은 펩타이드가 크로마토그래피 시스템에서 정의된 보존 시간에 용례하기 때문에 분석에 특정 이온이 포함되는 시간 창을 할당하는 관행이다. 지정된 시간에 심문되는 이온 수를 줄이면 해당 이온의 심문 빈도가 증가하여 데이터 정확도를 향상시킵니다.
일반적으로, 유비퀴틴 토폴로지대상표적프로테오믹스의 적용은 다른 표적 프로테오믹스 실험과 동일하다. 그러나 두 가지 주요 차이점이 중요합니다: 첫째, 유비퀴틴 체인의 안정성을 고려해야 합니다. 세포 리시스시 사슬을 빠르게 저하시키는 여러 가지 강력한 비쿼터팅 효소(DUBs)가 있습니다. 유비퀴틴 특이적 프로테아제는 티오에스테르아제와 메탈로로테아제의 두 가지 범주로 나뉩니다. 유비퀴틴 하이드로라제의 대부분은 티오스테라아제이며 활성 센터에서 시스테인 잔류물을 운반합니다. 이 시스테인 잔류물을 알킬 수 에 의해, 그들은 비활성화 될 수 있습니다. 이와 같이, N-ethylmaleimide (NEM)와 같은 알킬라팅 에이전트를 포함하는 유비퀴틴 안정화 버퍼의 사용, 고도로 데스팅 화학 물질, 냉각 샘플을 유지하는 것은 성공적인 분석에 필수적이다. 둘째, 다른 표적 실험과 달리 펩타이드 선택은 고정된다. 일반적인 표적 실험에서, 좋은 크로마토그래피 및 이온화 성능을 위해 프로테오티픽 펩티드를 선택할 수 있다. K48과 같은 일부 토폴로지 특성 펩티드의 경우 이러한 특성은 좋으며 다른 제품은 덜 바람직합니다. 예를 들어, 전형적인 역상 설정에서 K33 크로마토그래피는 확장된 용출 프로파일의 형성으로 인해 불량하며, K27 펩티드의 열악한 이온화 특성으로 인해 MS12에의한 가시성을 감소시킵니다.
이 프로토콜에서, 우리는 PRM에 의하여 생물학 견본의 유비퀴틴 토폴로지 평가를 능력을 발휘하는 방법을 기술합니다. 절차에 대한 예 데이터는 여러 상이한 세포 유형에서 MG-132 억제제 치료를 사용하여 프로테좀의 교란을 사용하여 제시된다.
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Protocol
1. 무거운 펩타이드 표준의 준비
- 공급 업체및 구입 한 무거운 펩 티드의 품질에 따라, 무거운 펩 티드 희석 될 필요가 있을 것 이다. 이 프로토콜은 표 1에서보고된 펩티드 서열을 사용했으며, C-말단 아미노산은 리신(13 C615N2-lysine)또는 아르기닌(13 C615N4-아르기닌)으로변형되었다.
- 무거운 펩티드를 혼합하여 50% 아세토닐릴(ACN)으로 혼합하여 10μM에서 각 펩타이드와 펩타이드 믹스를 만듭니다.
- 펩티드 믹스의 알리쿼트를 만들고 -80°C에 보관하십시오.
2. 샘플 준비
- 샘플 리시스
참고: 유비퀴틴 체인의 안정성은 시료 준비 중에 고려해야 합니다. 생물학적 샘플과 버퍼를 4°C에서 냉각시키고 가능한 한 빨리 유비퀴틴 안정화 버퍼에 샘플을 추가합니다.- 1M NH4HCO3(중탄산암암염) 용액을 물에 준비하고 1M NaOH를 사용하여 pH를 8로 조정한다.
- 물에 200mM N-ethylmaleimide (NEM)의 솔루션을 준비합니다.
- 50mM NH4HCO 3/10m NEM에서 8M 우레아를 이용한 유비퀴틴 안정화 버퍼를 준비하십시오.
참고: 8M 우레아의 5mL 용액은 우레아가 있는 포화 용액에서 물의 팽창을 감안할 때 5mL 미만의 물이 상당히 필요합니다.
주의: 고온에서 폴리우레아를 형성하는 우레아의 경향으로 인해 50°C 이상의 버퍼를 준비하지 마십시오. - 단백질의 0.5 μg/μL을 목표로 하는 유비퀴틴 안정화 완충제에서 조사되는 생물학적 샘플을 재중단하고 시료에 적합한 방법으로 세포를 용인한다. SFX 150 브랜슨 소니피어가 70% 강도로 설정된 3개의 10s 펄스로 구성된 초음파 처리 방법은 각 펄스 사이의 얼음에 10초의 브레이크를 사용하여, 이 프로토콜의 세포주에 사용되었다.
- 원심분리기 샘플은 탁상 원심분리기에서 4°C에서 10분 동안 18,000 x g에서 샘플링합니다.
- 상신단백질을 신선한 저단백질 결합 마이크로센심분리기 튜브로 전달합니다. 필요한 경우 이 시점에서 샘플을 -20°C로 저장할 수 있습니다.
- 샘플 및 제어 준비
- 시료가 동결되면, 우레아를 빠르게 용해하기 위해 해동하는 동안(예: 열믹서와)를 혼합합니다.
주의: 고온에서 폴리우레아를 형성하는 우레아의 경향으로 인해 50°C 이상의 온도를 사용하지 마십시오. - 원심분리기 샘플은 탁상 원심분리기에서 4°C에서 10분 동안 18,000 x g에서 샘플링합니다.
- 20 μg의 시료를 신선한 저결합 마이크로센심분리기 튜브로 옮기고 유비퀴틴 안정화 버퍼로 부피를 50 μL로 조정합니다.
- 유비퀴틴 안정화 버퍼(50 μL)의 정규화된 부피를 사용하여 음수 컨트롤을 만듭니다. 이 샘플에서는 각 펩타이드의 가벼운 버전이 없어야 하므로 스파이크인 무거운 펩타이드에서 발생하는 빛 오염을 관찰할 수 있습니다. 이러한 음수 제어는 섹션 3.1에 설명된 PRM의 보존 시간 스케줄링에도 사용되었습니다.
- 유비퀴틴 안정화 버퍼와 유비퀴틴 안정화 버퍼(50 μL)의 정규화된 부피에 상용 체인 유형을 추가하여 양수 제어를 만들었습니다. 일반적으로 K63, K48 및 M1을 사용할 수 있습니다. 대표적인 결과 K48, K63, M1의 20ng가 활용되었다.
- 시료가 동결되면, 우레아를 빠르게 용해하기 위해 해동하는 동안(예: 열믹서와)를 혼합합니다.
- 감소, 알킬레이션 및 소화
- 물에 50mM 암모늄 중탄산염(NH4HCO3)의용액을 준비하고 1M NaOH로 pH = 8로 샘플을 조정한다.
- LB 국물에서 자란 대장균의 배양은 5분 동안 5,000 x g의 원심분리되어 펠릿을 형성했으며, 그 후 PBS로 2배 세척한 후 유비퀴틴 안정화 버퍼에서 5μg/μL로 재서스펜션을 했다.
- 각 샘플 및 제어에 대장균 리세이트 1 μg를 추가합니다. 이 프로토콜은 대장균(DH10B)을 사용하지만 유비퀴틴이 없는 복잡한 용해재를 사용할 수 있습니다. 유비퀴틴은 모든 진핵생물에게 일반적입니다.
참고: 대장균 용해 매트릭스를 사용하면 플라스틱 제품에 대한 비특이적 접착으로 인한 펩티드의 손실이 줄어듭니다. 이는 단백질 함량이 제한된 음수 조절 또는 샘플에서 특히 두드러지며 K6312의관측에 강한 영향을 미친다. - MS 급수에서 500mM 트리스(2-carboxyethyl)의 포스핀(TCEP)의 용액을 준비한다(DTT는 대안으로 사용될 수 있음).
- TCEP를 최종 농도 50mM에 추가하여 샘플 및 컨트롤을 줄입니다. 소용돌이는 실온 (RT)에서 30 분 동안 배양하기 전에 잠시 배양합니다. DTT를 사용하는 경우 온도는 50 °C로 상승해야합니다.
주의: 고온에서 폴리우레아를 형성하는 우레아의 경향으로 인해 50°C 이상의 온도를 사용하지 마십시오. - NH4HCO3에서550mM 클로로아세타미드(CAA)의 용액을 준비한다. 어둠 속에서 보관하십시오.
- 55mMM의 최종 농도에 CAA를 추가하여 샘플 및 컨트롤을 알킬레이트합니다. 소용돌이는 어둠 속에서 RT에서 20 분 동안 배양하기 전에 잠시 배양했습니다.
참고: CAA는 -GG 수정(114.0429)13으로오인되는 리신 잔류물에서 이중 카르바미도메틸 수정(114.0429)의 가능성을 감소시키는 환원제로 요오도아세타미드 대신 사용된다. - 단백질 함량에 대한 1:25 (w/w) 비율로 샘플에 내분펩티다아제 LysC를 추가합니다. 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.
- 50mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v)의 200 μL로 샘플 및 컨트롤을 희석시 희석시.
- 단백질 함량에 대한 비율1:25에서 샘플에 트립신을 추가합니다. 37°C에서 12시간 동안 배양합니다.
- 각 시료및 대조군 시료에 1:10 비율 v/v로 MS 등급 물에 10% 포름산(FA) 용액을 추가합니다. C18 정리 전에 pH가 & 3) 있는지 확인하고 필요한 경우 포믹산을 더 추가하십시오.
- 각 샘플 및 제어에 섹션 1에서 생성된 무거운 펩타이드 표준의 0.5 μL을 추가합니다.
- 펩타이드 정리
- 몇몇 제조업체는 C18 정리 팁 또는 플레이트를 제공합니다. 사용 된 제품에 대한 제조업체의 지침을 따르고, 진공 원심 분리기에서 건조 에로티드 펩티드를 따르십시오.
3. LC-MS/MS에 의한 분석
- 예정되지 않은 방식으로 무거운 펩타이드 표준에 대한 초기 PRM 분석을 실행합니다.
- 말린 시료를 MS 로딩 버퍼 2% ACN/0.05% 트리플루오로아세산(TFA)의 10μL로 재연한다.
- HPLC에 역상 C18 분석 컬럼(75 μm x 15cm, 2 μm 100 Å C18 구슬)을 장착하여 나노플로우 MS를 위해 설계되었습니다. 분석 컬럼의 수명을 보존하기 위해 희생 트랩 컬럼(75 μm x 2cm, 3 μm, 100 Å C18 구슬)이 여기에 사용되었지만 필요하지 는 않다.
- 고해상도 질량 분광계에 있는 나노 ESI 소스에 분석 컬럼의 출력을 결합합니다.
- 질량 분광계에 적합한 표적 프로테오믹스 방법을 활용한다. 예를 들어 Q-Exactive 플러스 2실험 방법에서 Full MS와 PRM 실험 간에 순환합니다. Full MS 실험의 경우 최대 IT로 AGC 목표 1e6 및 240ms를 사용한 120,000개의 해상도가 사용되었습니다. PRM 실험의 경우 동일한 AGC 목표와 최대 IT가 60,000의 낮은 해상도와 1.2 m/z의 격리 창으로 사용되었습니다.
- HPLC 자동 샘플러를 사용하여 음수 제어의 200 ng를 분석 열에 삽입합니다. 분석 컬럼의 샘플에 선형 그라데이션을 적용하여 ACN 농도를 ~45분 동안 2~25%에서 증가시합니다.
참고: 25% ACN 농도는 일반적인 유비퀴틴 토폴로지 특성 펩타이드의 낮은 친성 특성으로 인해 프로테오믹스에 대해 평소보다 낮습니다. 다른 펩티드가 정량화될 경우, 더 높은 ACN 농도가 양호한 표적 분리를 달성하기를 원할 수 있다. - 섹션 4.2에 설명된 대로 일정 실행 결과를 분석하여 예약된 포함 목록을 만듭니다.
- 샘플 분석
- 섹션 4.2에서 작성된 예약된 포함 목록의 사용과 별도로 3.1에서 일정에 대해 설명된 나머지 샘플을 실행합니다.
참고: 후속 샘플에서 이전 실행에서 이월이 감지되지 않도록 양수 제어 후 공백을 실행해야 합니다.
- 섹션 4.2에서 작성된 예약된 포함 목록의 사용과 별도로 3.1에서 일정에 대해 설명된 나머지 샘플을 실행합니다.
4. 소프트웨어 분석
- 활용된 MS에 적합한 서식 포함 목록을 만듭니다. 이 프로토콜은 잘 문서화 된 지원과 도움을 제공하는 오픈 소스 소프트웨어 스카이 라인 (버전 19.1.0.193)(https://skyline.ms)을 사용했다. 내보내기 격리 목록 기능을 사용하여 여러 질량 분광기에 대해 포함 목록을 만들 수 있습니다.
- 새 스카이라인 문서를 엽니다.
- 무거운 토폴로지 특성 펩티드에 적합한 무거운 동위원소 변형을 선택합니다. 설정에서| 수정 탭 에서 펩티드 설정, 잠재적인 수정을 보려면 이름 필드를 클릭합니다. 선택은 구입 한 무거운 펩티드의 동위원소 상태를 기반으로합니다. 이 예에서, 중류리신(13C615N 2-lysine) 또는 C-종산시 중형아르기닌(13C615N4-아르기닌)을운반하는 합성 펩티드가 사용되었다. 적절한 레이블은 "라벨:13C(6)15N(2) (C-term K)" 및 "라벨:13C(6)15N(4) (C-term R)"입니다.
- 설정을 선택합니다| 전환. 필터 탭에는 전구체 요금 2, 3, 4가포함됩니다.
- 편집을 선택하여 펩티드를 삽입합니다| 삽입| 펩타이드.
- 토폴로지 특성 펩티드 서열 및 단백질 이름(예: "Chain-K63")을 포함한 관련 분야를 채우는 다.
- 이제 대상 패널에 표시된 각 펩티드를 확장합니다. 원치 않는 충전 상태를 삭제합니다. 사용되는 질량 분광계에 따라 다를 수 있는 바람직한 전하 상태 및 충돌 에너지는 각 토폴로지 특성 펩타이드에 대해 표 1에도시된다.
- 각 토폴로지 특성 펩티드(GG가 서열에 포함된 M1 제외)에 대해 시퀀스를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 수정을 선택합니다. 이름 필드를 클릭하고 모든것을 표시하여구조 수정으로 GG를 추가 ... > 선택하기 전에 "글리글리 (K)".
- 격리 목록 파일 내보내기| 수출| 격리 목록,계측기 유형을 선택하고 메서드 유형을 표준으로 설정합니다. 확인을 선택하면 PRM 메서드를 만드는 데 사용할 수 있는 *.csv 파일을 저장하는 프롬프트가 열립니다.
- 오픈 소스 스카이라인 소프트웨어를 사용하여 여기에 설명된 무거운 펩타이드 스케줄링 실행에 따라 예약된 포함 목록을 만듭니다.
- 섹션 4.1에 설명된 대로 대상 목록을 만듭니다.
- 파일을 선택하여 예약 실행을 3.1로 가져옵니다| 가져오기| 결과.
- 신분증을 검토합니다. 각 펩티드에 대한 무거운 신호는 각 무거운 펩티드 항목에 대한 질량을 클릭하여 관찰할 수 있습니다. 피크의 올바른 인식은 종종 자동으로 결정되지만 x 축 아래에서 클릭 및 드래그를 사용하여 피크를 선택하여 소프트웨어에 수동 큐레이션이 필요할 수 있습니다.
- 무거운 변형에 대해 선택된 보존 시간도 라이트 버전에 적용되므로 PRM에 대한 일정이 생성됩니다. 설정에서 일정 창을 수정할 수 있습니다| 시간 창을변경하여 예측 탭을 사용하여 펩타이드 설정.
- 이제 File을 사용하여 예약된 포함 목록을 내보낼 수 있습니다| 수출| 격리 목록 및 예약된 대로 적절한 계측기 유형 및 설정 방법 유형을 선택합니다.
- 데이터를 분석합니다.
- 섹션 4.2에서 일정 실행 분석과 동일한 방식으로 샘플을 가져옵니다.
- 모든 샘플을 완전히 가져온 후에는 전환큐레이션을 하는 것이 좋습니다. 간섭또는 신호 대 잡음 비율이 불량하여 전환되는 프로세스입니다. 큐레이션 전후의 크로마토그램의 예가 도 4에도시된다.
- 이제 관련 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 복사 데이터를 선택하거나 파일을 선택하여 데이터를 내보낼 수 있습니다| 수출| 결과.
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Representative Results
PRM에 의한 유비퀴틴 사슬 분석의 사용을 입증하기 위해 마우스 흑색종 세포주 B16, 및 2개의 일반적인 인간 세포주 A549(아데노카르시노믹 폐포기 기저 상피세포) 및 HeLa(자궁 경부암세포)를 3개의 세포주를 선택하였다. 이러한 배양은 수확 하기 전에 4 시간 동안 0, 10, 또는 100 mM MG-132로 처리되기 전에 적절한 매체에서 중간 기하 단계로 성장했다. MG-132는프로테좀(14)에의한 유비퀴틴-컨쥬게이트 단백질의 분해를 방지하는 프로테좀 억제제이다. 이러한 점을 감안할 때, 유비퀴틴 연쇄 분석을 입증하는 적절한 테스트 조건입니다. K48 체인의 증가는 그림 3에서볼 수 있다. 프로테모솜 억제제 치료는 K48사슬(15)의증가를 유도했다.
소개에 설명된 바와 같이, SRM 또는 MRM과 달리, PRM은 전구체 이온을 선택한 후 전체 제품 이온 스캔을 수행한다. 즉, 제품 이온을 실행 하기 전에 지정 할 필요가 없습니다 하지만, 그들은 여전히 사후 실행 큐레이터 해야. 큐레이션은 의도된 펩티드를 진정으로 대표하는 전이가 선택되는 과정입니다. 도 4는 큐레이션 전후K48용 제품 이온 크로마토그램을 나타낸다. 간섭으로 인해 일치하지 않는 용출 프로파일이 있는 신호가 있는 제품 이온이 제거되었습니다. 그런 전환에 신호 대 잡음 비율이 덜 유리하다는 점을 감안할 때 저강도 제품 이온이 제거되었습니다. 큐레이션 중에 선택된 최적의 전환은 일반적으로 실험 간에 일치하며 사용되는 질량 분광계, 크로마토그래피 조건, 분석 설정 및 샘플의 생물학적 배경에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 각 조사에 대해 전환의 적절한 큐레이션이 필요합니다. 또한 더 많은 전환을 포함하기 때문에 기술 복제 및 정량화를 위한 더 깨끗한 데이터 간에 균형이 필요합니다.
본 실험에서 확인된 유비퀴틴 사슬 토폴로지에 대한 일반적인 제품 이온 크로마토그램은 도 5에도시된다. 이러한 생물학적 조건하에서 신호가 검출 이하이기 때문에 K27 및 K29는 여기서 생략된다. 여기에 표시된 K33의 용출 프로파일은 PRM 분석에 일반적으로 허용되는 것보다 상당히 광범위했습니다. 그러나, 더 나은 용출 프로파일을 가진 펩티드의 대체 선택은 유비퀴틴 사슬 분석에서 불가능하고 해석은 이 단면도에 근거하여 이루어져야 합니다. K33이 특히 관심이 있는 경우, 변경된 크로마토그래피 조건은 이 체인 유형의 정량화를 향상시킬 수 있지만 다른 체인 유형의 손해가 발생할 가능성이 있다.
PRM 실험을 설계할 때, 신호 대 노이즈를 증가시킴으로써 정량화에 사용되는 제품 이온의 신호를 최대화하는 것이 바람직하다. 충돌 에너지의 최적화(즉, 질량 분광계에서 제품 이온에 전구체 펩티드 이온을 단편화하는 데 사용되는 에너지)는 신호가16개향상될 수 있는 하나의 수단이다. 14-28로부터의 충돌 에너지 범위는 도 6에도시된 K63 및 M1의 결과 관찰피크 영역을 가진 단일 시료의 반복주입에 적용되었다. 볼 수 있듯이, K63의 경우 26의 높은 충돌 에너지가 최적이었고, M1의 경우 18의 낮은 에너지가 이상적입니다. 각 토폴로지 특성 펩티드와 수정되지 않은 유비퀴틴 단편의 선택에 대한 충돌 에너지가 표 1에도시된다. 이러한 충돌 에너지는 사용되는 질량 분광계 및 단편화 방법에 따라 최적화되어야 할 수 있습니다.
그림 1: 유비퀴틴-컨쥬게이팅 캐스케이드의 회로도 표현. 유비퀴틴은 ATP 의존식 방식으로 E1 효소에 먼저 구속됩니다. 활성화된 유비퀴틴은 유비퀴틴을 기질 단백질로 이송하기 위해 E3-ligase에 의해 결합된 E2 효소로 이송된다. 이 과정은 기판 단백질에 유비퀴틴 사슬이 형성될 때까지 여러 번 반복된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 유비퀴틴 토폴로지-특성 펩타이드의 파생을 보여주는 다이어그램. 업스트림 결합 부위의 포스트 트립틱 소화부위는 부착된 다운스트림 유비퀴틴의 -GG C 단말과 함께 파생된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 마우스 세포주 B16 및 2개의 인간 세포주 A459 및 HeLa에 대한 MG-132 치료 하에서 K48 사슬의 비교. A459에서 MG-132의 농도가 증가하여 K48 체인의 안정화를 주도했습니다. B16 및 HeLa 세포로 10mM MM 또는 100 mM MG-132로 치료하에 증가가 보였다. 10mM에서 100mMMMMMMM로 관찰된 감소는 B16 및 HeLa 세포의 증가감에 의해 MG-132로, 세포사멸을 초래하여 설명할 수 있다. 오류 막대는 전환의 표준 편차를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: M1 토폴로지 특성 펩타이드의 제품 이온 크로마토그램은 간섭 또는 저강도에 대한 전이의 큐레이션 전후에. x축의 보존 시간이 몇 분 단위로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 다양한 토폴로지 특성 펩타이드의 대표적인 제품 이온 크로마토그램과 2개의 비변형 유비퀴틴 펩타이드. 각 펩티드에 대한 수분 내용 및 관찰된 질량 오차는 관련 피크의 정점 위에 보고된다. 점선은 또한 피크 영역의 측정을위한 창을 표시합니다. x축의 보존 시간이 몇 분 단위로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 일련의 정규화된 충돌 에너지를 통해 K63 및 M1의 관찰된 피크 영역입니다. 다른 색상은 각 전환에 의해 기여된 이온 강도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 체인 유형 | 토폴로지 특성 펩타이드 | 충전 상태 | 정규화된 충돌 에너지 |
| K06 | MQIFVK[GG]TLTGK | 3 | 18 |
| K11 | TLTGK[GG]타이틀벡스티엔VK | 3 | 18 |
| K27 | 타이틀벡스티엔VK[GG]AK | 3 | 18 |
| K29 | AK[GG]IQDK | 2 | 22 |
| K33 | IQDK[GG]EGIPPDQQR | 3 | 18 |
| K48 | LIFAGK[GG] QLEDGR | 3 | 24 |
| K63 | TLSDYNIQK[GG]ESTLHLR | 4 | 26 |
| M1(선형) | GGMQIFVK | 2 | 18 |
| 수정되지 않은 우치이틴 | ESTLHLVLR | 2 | 26 |
| 수정되지 않은 우치이틴 | 타이틀벡스티엔VK | 2 | 18 |
| 수정되지 않은 우치이틴 | TLSDYNIQK | 2 | 18 |
표 1: 인간 유비퀴틴 토폴로지 특성 펩타이드, 가장 관찰 가능한 충전 상태 및 유리한 정규화 된 충돌 에너지에 대한 서열.
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Discussion
프로테오메 내의 유비퀴틴 상태의 분석은 다양한 생물학적 질문에 대한 중요성을 증가시고 있다. 샘플의 유비쿼터티션 상태에 대한 설명은 단백질의 프로파일뿐만 아니라 이러한 유비쿼터티화의 토폴로지에도 초점을 맞추어야 합니다. 여기에 설명된 바와 같이 표적 MS에 의한 이 토폴로지의 평가는, 생물학 조사의 넓은 범위에 있는 역할이 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜이 전역 토폴로지 프로필을 제공한다는 것을 이해해야 합니다. 상향식 프로테오믹스 접근법을 사용하면 유비퀴틴 펩타이드를 포함하여 유비퀴티나이드된 펩타이드의 판정을 가능하게 한다. 유비퀴틴 펩티드의 유비퀴티옹의 관찰은 사슬 토폴로지의 결정을 허용하지만, 유비퀴틴의 표적에 대한 링크는 손실된다. 따라서, 주어진 단백질에 대한 특정 사슬 토폴로지는 결정할 수 없지만 글로벌 토폴로지 프로파일이 도출된다. 이 방법을 더 많은 표적 결과를 제공하기 위해 농축 전략과 결합될 수도 있습니다. 이러한 농축은 체인 안정성과 체인 포스트 농축의 풍요로움을 고려해야합니다. 체인 토폴로지의 검출은 농축 전략이 제공하는 순도에 의해 제한되며, 관심 있는 단백질과 연결된 단백질과 오염된 단백질에 연결된 유비퀴틴 토폴로지구별할 수 없다. 성공적인 분석을 촉진하는 이 프로토콜의 중요한 단계는 유비퀴틴 단백질을 소화하면서 유비퀴틴 사슬을 보존하는 균형입니다. 이것은 효소 소화에 유비퀴틴 자체의 저항에 결합 된 연쇄 고장의 성향으로 인해 도전적이다. 또한, 기립 매트릭스의 첨가 및 MS 조건의 주의 깊은 고려는 액체 크로마토그래피 결합 질량 분광 분석에 일부 토폴로지 특성 펩티드의 덜 유리한 특성을 감안할 때 요구된다.
우리는 이 프로토콜에 모든 유비퀴틴 체인 유형을 동시에 평가할 수 있는 수단을 설명했지만, 관심있는 특정 체인 토폴로지에 따라 프로토콜의 여러 측면을 조정할 수도 있습니다. 크로마토그래피 조건을 조작하거나 무거운 펩티드 농도를 변화시키는 것은 조사의 정확성을 높이고 특정 연쇄 토폴로지에 대한 결과를 개선하고 제안된 생물학적 질문에 대한 조사를 조정할 수 있다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 대표 결과에 설명된 대로 MG-132의 처리를 가진 세포 펠릿의 창조에 있는 그녀의 도움에 대한 셀린 지티를 감사하고 싶습니다 및 프로토콜에 사용된 E. coli 펠릿의 그녀의 제공을 위한 Elise Mommaerts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
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