Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Убиквитин Цепной Анализ параллельным мониторингом реакции

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/60702
Automatic Translation
1, 1, 1
1Quantitative Biology Unit, Luxembourg Institute of Health

Summary

Этот метод описывает оценку глобальных изменений в топологии цепи убиквитина. Оценка проводится с помощью подхода, основанного на масс-спектрометрии, целенаправленной протеомики.

Abstract

Оценка глобального профиля топологий убиквитиных цепочек в протеоме представляет интерес для ответа на широкий спектр биологических вопросов. Протокол, изложенный здесь, использует модификацию диглицина (-GG), оставленную после триптического пищеварения убиквитина, включенного в цепочку. Путем количественной оценки этих топологически-характерных пептидов можно определить относительное изобилие каждой топологии цепи убиквитина. Сообщается о шагах, необходимых для количественной оценки этих пептидов путем параллельного мониторинга реакции с учетом стабилизации убиквитиных цепей. Подготовка тяжелых элементов управления, клеточный лиз и пищеварение описаны вместе с соответствующей установкой масс-спектрометра и рабочим процессом анализа данных. Представлен пример набора данных с возмущениями в топологии убиквитина, сопровождаемый примерами того, как оптимизация протокола может повлиять на результаты. Следуя изложенным шагам, пользователь сможет провести глобальную оценку ландшафта топологии убиквитина в их биологическом контексте.

Introduction

Тесная регуляции белковой функции и стабильности имеет первостепенное значение, поскольку они являются основными факторами фенотипического контроля биологии. Функция белка построена из двух компонентов: его внутренней полипептидной последовательности и любых посттрансляционных модификаций (ПТМ). Были выявлены различные химические ПТС, включая гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование и метилирование1. В 1975 году Гольдштейн и др.2 определили небольшой белок и назвали его убиквитином из-за его вездесущей природы. Убиквитин оказался важным в деградации белка3. Однако с тех пор было установлено, что функция убиквитина как сигнальной молекулы выходит далеко за рамки регуляции белковой стабильности. Убиквитин сигнализации участвует в широком спектре других биологических функций, таких как стабилизация белка, аутофагия, контроль клеточного цикла, и торговлябелками 4.

В то время как другие ПТМ, как правило, двоичные (т.е. белок изменяется или остается неизмененным) для данного сайта, убиквитин может модифицировать белок как мономер, так и как полимерную цепь, при этом сам убиквитин прикрепляется. Кроме того, эта цепочка полиубикитинации может развиваться в нескольких топологиях с убиквититацией предыдущего убиквитина, прикрепляемого к одному извосьми мест связи 5,6. Убиквитин передается многоступенчатым энзиматический процесс (Рисунок 1), где C-терминус убиквитина связан с одним из семи остатков лизина (K06, K11, K27, K29, K33, K48, или K63) или N-терминал предыдущего убиквитина (называется M1 или линейной убиквитина)5. Эта топология цепи является ключом к судьбе белка в модификации. Например, модификация с цепочкой K48 или K11 приводит к деградации модифицированного белка у протеасомы, в то время как линейная цепь необходима для активации сигнализации NF-kB. Таким образом, относительное распределение этих цепных топологий имеет отношение к широкому кругу биологических вопросов.

Использование масс-спектрометрии (MS) имеет особое значение для анализа топологии цепи убиквитина, поскольку она не зависит от антител на основе или сродства наоснове взаимодействий 7,8, многие из которых имеют ограниченную специфичность и не различают различные типы цепи. Другая возможность обнаружения использует генетически модифицированных мутантов убиквитина. Здесь на аргинин обменивается специфический лизин, который не может поддерживать модификацию убиквитином. Отсутствие образования цепи убиквитина на субстратовый белок затем интерпретируется как доказательство для конкретной топологии9.

MS-идентификация убиквитинированных белков основана на том факте, что C-терминус убиквитина содержит остатки аргинина в положении 74, который распознается трипсином во время протеолитического приготовления образцов для анализа MS, отделяя C-терминальный двойной глицин. Этот GlyGly (-GG) остается ε к группе аминокислот лизина остатков субстрата белка. Для анализа топологии убиквитина, модификация происходит на одном из семи остатков лизина убиквитина. Это создает набор из семи ключевых пептидов, которые несут остатки лизина, который изменяется GG, специфичный для каждой из топологий(рисунок 2). Например, с K06 топологии, лизин на позиции 6 на аминокислотной последовательности будут защищены от триптического пищеварения с -GG модификации 114 Da добавил к этому лизин.

Идентификация конкретных предопределенных пептидов MS называется целевой протеомией, или, более конкретно, целевым приобретением пептида10. В зависимости от производительности используемого масс-спектрометра разработаны два метода. Это отдельный мониторинг реакции (SRM), также называемый множественным мониторингом реакции (MRM), и параллельный мониторинг реакции (PRM). SRM включает в себя выбор переходов, состоящий из прекурсора m/z и продукта ион m/z. И наоборот, PRM требует только прекурсора m/z. После выбора выполняется полное обследование ионов продукта. Это имеет то преимущество, что никакой выбор соответствующих ионов продукта для количественной оценки на конкретный масс-спектрометр не требуется доизмерения 11. И SRM, и PRM могут, в зависимости от инструмента, быть запланированы. Планирование – это практика присвоения тайм-окну, в течение которого определенный ион будет включен для анализа, так как пептиды eluting в определенное время удержания из хроматографической системы. Сокращение числа ионов, допрашиваемых в любой момент времени, увеличивает частоту допросов тех ионов, которые были запланированы в то время, тем самым повышая точность данных.

В целом, применение целевой протеомики для убиквитин топологии такой же, как и любой другой целенаправленный эксперимент протеомика. Однако важны два ключевых отличия: во-первых, необходимо учитывать стабильность убиквитиных цепей. Существует несколько мощных деубикитинирующих ферментов (ДУБ), которые быстро деградируют цепи при клеточномлизе. Протеазы, специфичные для убиквитина, подразнятся на две категории: тиоэстеразы и металлопротеазы. Большинство убиквитин-гидролазы являются тиоэстеразы и нести остатки цистеина в их активном центре. Путем alkylating этот остаток цистеин, они могут быть инактивированы. Таким образом, использование буферов стабилизации убиквитина, содержащих алкилатные агенты, такие как N-этилмалеимид (NEM), и высоко денатурированных химических веществ, и сохранение образцов охлажденными имеет жизненно важное значение для успешного анализа. Во-вторых, в отличие от других целевых экспериментов, выбор пептида фиксируется. В типичном целевом эксперименте протеотипический пептид может быть выбран для хорошей хроматографической и ионизации. Для некоторых топологически-характерных пептидов, таких как K48 эти свойства хороши, в то время как для других, они менее желательны. Например, хроматография K33 в типичной установке обратной фазы плоха из-за формирования растянутого профиля элюции, а плохие свойства ионизации пептида K27 снижают его видимость на MS12.

В этом протоколе мы описываем, как выполнить туплологическую оценку убиквитина биологического образца PRM. Примерные данные для процедуры представлены с использованием возмущения протеасомы с помощью ингибитора MG-132 лечения в нескольких различных типов клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка тяжелого пептидного стандарта

  1. В зависимости от поставщика и качества закупаемых тяжелых пептидов, тяжелые пептиды необходимо будет разбавить. Этот протокол использовал пептидные последовательности, о которые сообщалось в таблице 1,с аминокислотой C-терминала, модифицированной в лизин (13C615N2-lysine) или аргинином (13C615N4-аргинин).
    1. Смешайте тяжелые пептиды, разбавляя смесь 50% ацетонитрилом (ACN), чтобы создать пептидную смесь с каждым пептидом при 10 МКМ.
    2. Создайте алициты пептидной смеси и храните при -80 градусов по Цельсию.

2. Пример подготовки

  1. Образец лиза
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильность убиквитин цепи должны быть рассмотрены во время подготовки образца. Храните биологические образцы и буферы охлажденными при 4 градусах Цельсия и добавляйте образцы в буфер стабилизации убиквитина как можно быстрее.
    1. Приготовьте раствор 1 M NH4HCO3 (бикарбонат аммония) в воде и отрегулируйте рН до 8 с помощью 1 M NaOH.
    2. Приготовьте раствор 200 мМ Н-этилмалимид (NEM) в воде.
    3. Подготовка буфера стабилизации убиквитина с использованием 8 М мочевины в 50 мМ NH4HCO3/10 мМ. Буфер стабилизации убиквитина должен быть подготовлен только что каждый раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 5 мл раствор 8 М мочевины потребует значительно меньше, чем 5 мл воды, учитывая расширение воды, когда в насыщенном растворе с мочевиной.
      ВНИМАНИЕ: Не подготовь буфер выше 50 градусов по Цельсию из-за тенденции мочевины к формированию полиуреи при высоких температурах.
    4. Повторное распространение биологического образца для исследования в буфере стабилизации убиквитина, направленном на 0,5 мкг/ОЛ белка и обледенеть клетки с помощью соответствующего метода для образца. Метод sonication consist of 3 10 s ИМПы ульс с sonifier SFX 150 Branson установленный на интенсивности 70% с 10 s проломами на льду между каждым ИМПом ульс, был использован для линий клетки в этом протоколе.
    5. Образец центрифуги при 18 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия в центрифуге столешницы.
    6. Передача супернатанта в свежую низко белку связывания микроцентрифуг трубки. Образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в этот момент, если это необходимо.
  2. Подготовка образцов и элементов управления
    1. Если образцы заморожены, перемешайте (например, с термомиксером), пока они разморожены, чтобы быстро растворить мочевину.
      ВНИМАНИЕ: Не используйте температуру выше 50 градусов по Цельсию из-за тенденции мочевины к формированию полиуреи при высоких температурах.
    2. Образец центрифуги при 18 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия в центрифуге столешницы.
    3. Перенесите 20 мкг образца в свежую низкообязательную микроцентрифугную трубку и отрегулируйте объем до 50 мкл с буфером стабилизации убиквитина.
    4. Создайте отрицательный контроль с использованием нормализованного объема буфера стабилизации убиквитина (50 МКЛ). В этом образце не должно присутствовать светлая версия каждого пептида, позволяющая засовывь любое световое загрязнение, возникающее в результате шипа в тяжелых пептидов. Этот отрицательный контроль был также использован для планирования времени удержания PRM, описанного в разделе 3.1.
    5. Был также создан положительный контроль с буфером стабилизации убиквитина и добавлением коммерчески доступных типов цепочек к нормализованного объема буфера стабилизации убиквитина (50 МЛ). Обычно доступны K63, K48 и M1. В репрезентативных результатах было использовано 20 нг K48, K63 и M1.
  3. Сокращение, алкиляция и пищеварение
    1. Приготовьте раствор бикарбоната аммония 50 мМ (NH4HCO3)в воде и отрегулируйте образец до рН 8 с 1 М НаОХ.
    2. Культура кишечной палочки, выращенная в бульоне LB, была центрифугирована 5000 х г в течение 5 мин для формирования гранулы, которая затем промылась 2x с PBS перед повторной ссадины в буфере стабилизации убиквитина на уровне 5 мкг/Л.
    3. Добавьте 1 мкг лизата кишечной палочки к каждому образцу и контролю. Этот протокол использует кишечную палочку (DH10B), но любой сложный лизат без убиквитина может быть использован. Обратите внимание, что убиквитин является общим для всех эукариот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование матрицы лизата кишечной палочки уменьшает потерю пептидов из-за неспецифической притонации к пластиковым изделиям. Это особенно заметно в отрицательном контроле или образцах с ограниченным содержанием белка и оказывает сильное влияние на наблюдение K6312.
    4. Подготовка раствора 500 мМ трис (2-карбоксетил)фосфин (TCEP) в воде класса MS (DTT может быть использован в качестве альтернативы).
    5. Уменьшите образцы и элементы управления путем добавления TCEP к окончательной концентрации 50 мМ. Вихрь кратко перед инкубацией в течение 30 минут при комнатной температуре (RT). При использовании DTT температура должна быть повышена до 50 градусов по Цельсию.
      ВНИМАНИЕ: Не используйте температуру выше 50 градусов по Цельсию из-за тенденции мочевины к формированию полиуреи при высоких температурах.
    6. Подготовка раствора хлороацетамида 550 мМ (CAA) в NH4HCO3. Хранить в темноте.
    7. Алкилат образцов и элементов управления, добавив CAA к окончательной концентрации 55 мМ. Vortex кратко перед инкубацией в течение 20 минут на RT в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CAA используется вместо iodoacetamide в качестве агента сокращения, чтобы уменьшить вероятность двойной модификации карбамидометил (114,0429) на остатке лизина ошибочно принимают за -GG модификации (114,0429)13.
    8. Добавьте эндопптидазу LysC к образцам в соотношении 1:25 (w/w) к содержанию белка. Инкубационный для 3 ч при 37 градусах Цельсия.
    9. Разбавить образцы и элементы управления с 200 йл 50 мМ NH4HCO3 рН 8 (1:5 v/v).
    10. Добавить трипсин в образцы в соотношении 1:25 ж/в к содержанию белка. Инкубационный для 12 ч при 37 градусах Цельсия.
    11. Добавьте 10% раствора формической кислоты (FA) в воду класса MS при соотношении 1:10 v/v к каждому образцу и контролю образца. Проверьте, что рН является lt;3) до очистки C18 и добавить больше мимической кислоты, если это необходимо.
    12. К каждому образцу и контролю добавить 0,5 МКЛ тяжелого пептидного стандарта, созданного в разделе 1.
  4. Очистка пептида
    1. Некоторые производители предлагают C18 очистки советы или пластины. Следуйте инструкциям производителя для используемого продукта, и сухие эластиированные пептиды в вакуумной центрифуге, готовые к анализу MS.

3. Анализ LC-MS/MS

  1. Выполнить первоначальный анализ PRM по тяжелому пептидного стандарта в незапланированной форме.
    1. Повторное высохшей пробы в 10 йл буфера загрузки MS 2% ACN/0.05% трифтороацевая кислота (TFA).
    2. Оборудуй HPLC с аналитической колонкой C18 обратной фазы (75 мкм х 15 см, 2 мкм 100 й С18 бусин), предназначенной для нанопотока MS. Форма линейных градиентов обмена MS класса воды дополнен 0,1% FA с ACN, содержащий 0,1% FA. Для сохранения жизни аналитической колонки здесь использовалась колонка жертвенной ловушки (75 мкм х 2 см, 3мкм, 100 й С 18 бусин), чтобы сохранить жизнь аналитической колонки, но не требуется.
    3. Привязать выход аналитической колонки к источнику наноэЭ на масс-спектрометре высокого разрешения.
    4. Используйте соответствующий целевой метод протеомика для масс-спектрометра. Например, на методе «К-Exactive плюс два эксперимента» цикл между Full MS и экспериментом PRM. Для эксперимента Full MS использовалось разрешение 120 000 с целью AGC 1e6 и 240 мс в качестве максимального ИТ. Для эксперимента PRM использовалась та же цель AGC и максимальная ИТ с более низким разрешением 60 000 и изоляционные окна 1,2 м/з.
    5. Ввись 200 нг отрицательного контроля в аналитическую колонку с помощью автоамплеера HPLC. Примените линейный градиент к выборке на аналитической колонке, увеличив концентрацию ACN с 2 до 25% в течение 45 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация ACN на 25% ниже, чем обычно для протеомики, из-за низкой гидрофильной природы типичных убиквитин топологически-характерных пептидов. Если другие пептиды должны быть количественно, более высокая концентрация ACN может быть желательно для достижения хорошей цели разделения.
    6. Проанализируйте результаты запуска планирования, описанные в разделе 4.2, чтобы создать запланированный список включений.
  2. Анализ образцов
    1. Вы запустите оставшиеся образцы, описанные для планирования в 3.1, кроме использования запланированного списка включения, созданного в разделе 4.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробел должен быть запущен после положительного контроля, чтобы гарантировать, что перенос от предыдущего запуска не обнаруживается в последующих образцах.

4. Анализ программного обеспечения

  1. Создайте список включения соответствующего форматирования для используемого MS. В этом протоколе использовалось программное обеспечение с открытым исходным кодом Skyline (версия 19.1.0.193) (https://skyline.ms), которое предлагает хорошо документированную поддержку и помощь. Список включения может быть создан для нескольких масс-спектрометров с использованием объекта изоляции экспорта.
    1. Откройте новый документ Skyline.
    2. Выберите тяжелые изотопные модификации, соответствующие тяжелым топологически характерным пептидам. В настройках| Пептид Настройки под вкладкой Модификация, нажмите на поле имени, чтобы увидеть потенциальную модификацию. Отбор основан на изотопном состоянии закупаемых тяжелых пептидов. В этом примере использовались синтетические пептиды, несущие либо тяжелый лизин (13C615N2-лизин) или тяжелый аргинин (13C615N4-аргинин) в C-термине. Соответствующие надписи будут: "Label:13C(6)15N(2) (C-термин K)" и "Label:13C(6)15N(4) (C-термин R)".
    3. Выберите настройки| Переход. Под вкладкой Фильтр включают Прекурсор сборы 2, 3, 4.
    4. Вставьте пептиды, выбрав Редактировать| Вставка| Пептиды.
    5. Заполните соответствующие области, включая топологию-характерную пептидную последовательность и белковое название (например, "Цепь-K63").
    6. Расширьте каждый пептид, показанный в панели Targets. Удалить нежелательные состояния заряда. Предпочтительное состояние заряда и энергия столкновения, которая может отличаться в зависимости от используемого масс-спектрометра, для каждого топологико-характерного пептида показана в таблице 1.
    7. Для каждого топологии характерный пептид (за исключением M1, где GG включен в последовательность) право нажмите на последовательность и выберите Modify. Добавить GG в качестве структурной модификации, нажав на поле имени и выбрав lt;Показать все... перед выбором "GlyGly (K)".
    8. Экспорт изоляционный список файл| Экспорт| Изоляционныйсписок, выберите тип инструмента и установите тип метода на стандарт. Выбор OK откроет подсказку для сохранения файла .csv, который может быть использован для создания метода PRM.
  2. Создайте запланированный список включения на основе тяжелого пептидного планирования запуска объяснил здесь с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом Skyline.
    1. Создайте целевой список, описанный в разделе 4.1.
    2. Импортируем запуск расписания в 3.1, выбрав файл| Импорт| Результаты.
    3. Просмотрите идентификацию. Тяжелый сигнал для каждого пептида наблюдается, нажав на массу для каждого тяжелого пептида вступления. Правильное распознавание пика часто определяется автоматически, но программное обеспечение может потребовать ручного кураторства, выбрав пик с помощью щелчка мыши и перетащить под x-оси.
    4. Время удержания, выбранное для тяжелых вариантов, также применяется к световым версиям, создавая тем самым график для PRM. Окно планирования может быть изменено в соответствии с настройками| Настройки пептида с помощью вкладки Прогноз, изменяя окно времени.
    5. Запланированный список включения теперь можно экспортировать с помощью файла| Экспорт| Изоляционный список и выбор соответствующего типа инструмента и тип метода настройки в запланированный.
  3. Анализируйте данные.
    1. Импорт образцов таким же образом, как и для анализа планирования запуска в разделе 4.2.
    2. После полного импорта всех образцов рекомендуется кураторизация переходов. Это процесс, с помощью которого удаляются переходы с помехами или плохими соотношениями сигнала к шуму. Пример хроматограммы до и после кураторства показан на рисунке 4.
    3. Теперь данные можно экспортировать либо путем правого нажатия на соответствующие графики и выбора данных копирования, либо путем выбора файла| Экспорт| Результаты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы продемонстрировать использование анализа цепи убиквитина PRM, были отобраны три клеточные линии: линия клеток мыши меланомы B16 и две общие линии клеток человека A549 (аденокарциномические альвеолярные базальные эпителиальные клетки) и HeLa (раковые клетки шейки матки). Эти культуры выросли до средней фазы в соответствующих средствах массовой информации, прежде чем лечить 0, 10, или 100 мМ МГ-132 за 4 ч до сбора урожая. MG-132 является ингибитором протеасомы, предотвращая деградацию убиквитин-спряженных белков протеасомой14. Учитывая это, это подходящее условие теста, чтобы продемонстрировать убиквитин цепной анализ. В результате увеличения цепи K48 можно увидеть на рисунке 3. Протеасом ингибитор лечения индуцированных увеличение K48 цепи15.

Как описано во введении, в отличие от SRM или MRM, PRM выполняет полное сканирование иона продукта после выбора иона-предшественника. Хотя это означает, что ионы продукта не должны быть указаны до запуска, они все равно должны быть куратором после запуска. Кураторство – это процесс, при котором выбираются переходы, действительно репрезентативные для предполагаемого пептида. На рисунке 4 показан продукт ионная хроматограмма для K48 до и после кураторства. Ионы продукта, которые имеют сигнал с несовместимым профилем elution, вероятно, из-за помех, были удалены. Затем ионы продуктов низкой интенсивности были удалены, учитывая, что соотношение сигнала к шуму менее благоприятно для таких переходов. Оптимальные переходы, выбранные во время кураторства, обычно согласуются между экспериментами и могут отличаться в зависимости от используемого масс-спектрометра, хроматографических условий, параметров анализа и биологического фона образца. Таким образом, для каждого исследования требуется надлежащее кураторирование переходов. Необходим также баланс между включением большего прогресса и, следовательно, техническими репликациями и более чистыми данными для количественной оценки.

Типичные ионные хроматограммы продукта для каждой из выявленных топологий цепи убиквитина в этом эксперименте показаны на рисунке 5. K27 и K29 опущены здесь, потому что в этих биологических условиях сигнал был ниже обнаружения. Профиль elution K33, как показано здесь, был значительно шире, чем это было бы общепринятым для анализа PRM. Тем не менее, альтернативный выбор пептидов с лучшими профилями элюциона не является возможным в анализе цепи убиквитина и интерпретация должна быть сделана на основе этого профиля. Если K33 представляет особый интерес, измененные хроматографические условия могут улучшить количественную оценку этого типа цепи, но, вероятно, в ущерб другим типам цепей.

При разработке эксперимента PRM предпочтительнее максимизировать сигнал ионов продукта, используемых для количественной оценки, увеличивая сигнал к шуму. Оптимизация энергии столкновения (т.е. энергии, используемой масс-спектрометром для фрагментации пептидных ионов-прекурсоров в ионы продукта) является одним из средств, с помощью которыхсигнал может быть улучшен 16. Энергетический диапазон столкновения от 14-28 был применен к повторным инъекциям одного образца с полученными наблюдаемыми пиковыми областями K63 и M1, показанными на рисунке 6. Как видно, для K63 более высокая энергия столкновения 26 была оптимальной, в то время как для M1 более низкая энергия 18 была идеальной. Энергия столкновения для каждого топологико-характерного пептида и выбор неизмененных фрагментов убиквитина показаны в таблице 1. Эти энергии столкновения, возможно, потребуется оптимизировать на основе используемого метода масс-спектрометра и фрагментации.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление убиквитин-спряженного каскада. Убиквитин сначала связан ферментом Е1 в зависимых от АТФ образом. Активированный убиквитин затем передается ферменту E2, который затем присоединяется к E3-лигазе для переноса убиквитина в субстратный белок. Этот процесс повторяется несколько раз, пока на субстратовом белке не образуется цепочка убиквитина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Диаграмма, показывающая вывод убиквитина топологии характерный пептид. Сообщение триптического пищеварения вверх по течению связывания сайта является производным с -GG C-терминал вниз по течению убиквитин прилагается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Сравнение цепи K48 в рамках лечения MG-132 для линии клеток мыши B16 и двух линий клеток человека A459 и HeLa. В А459 повышение концентрации МГ-132 привело к стабилизации цепей К48. С клетками B16 и HeLa увеличение было увидено под обработкой с или 10 mM или 100 mM MG-132. Снижение, наблюдаемое с 10 мм до 100 мм, можно объяснить повышенной чувствительностью клеток В16 и HeLa к МГ-132, что приводит к гибели клеток. Бары ошибок показывают стандартное отклонение переходов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Продукт ионных хроматограмм М1 топологии характерных пептида до и после кураторства переходов для помех или низкой интенсивности. Время удержания на оси x отображается в минутах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Типичный продукт ионные хроматограммы различных топологически-характерных пептидов, а также двух неизменяемых пептидов убиквитина. Время элюции в минутах и наблюдаемая массовая ошибка для каждого пептида сообщается выше вершины соответствующего пика. Пунктирные линии также показывают окно для определения пиковой области. Время удержания на оси x отображается в минутах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Наблюдаемая пиковая область для K63 и M1 в течение ряда нормализованных энергий столкновения. Различные цвета представляют интенсивность ионов, в значительной степени способствует каждому переходу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Тип цепи Топология Характерный пептид Состояние заряда Нормализовал столкновение энергии
K06 МСИФВК-ГГЗТЛТГК 3 18
K11 ТЛТГК-ГГГЕВЕПСДТИЕНВК 3 18
K27 НАЗВАНИЕВЕПСТИЕНВКХАГЗ 3 18
K29 АКЗГЗИКДК 2 22
K33 ИКДК 3 18
K48 ЛИФАГКЗГЗЛЕДГР 3 24
K63 ТЛСДИНИКК-ГГГЛХЛВЛР 4 26
M1 (линейный) ГГМЗИФВК 2 18
Неизмененый убкиутин ESTLHLVLR 2 26
Неизмененый убкиутин TITLEVEPSDTIENVK 2 18
Неизмененый убкиутин ТЛСДИНИК 2 18

Таблица 1: Последовательности для человеческих убиквитин топологически-характерных пептидов, наиболее наблюдаемое состояние заряда, и благоприятная нормализованная энергия столкновения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ состояния убиквитина в протеоме имеет все большее значение для широкого спектра биологических вопросов. Описание состояния убиквитина образца должно быть сосредоточено не только на профиле убиквитинированных белков, но и на топологии такого убиквитина. Оценка этой топологии целевым MS, как описано здесь, играет определенную роль в широком спектре биологических исследований.

Следует понимать, что изложенный здесь протокол содержит глобальный профиль топологии. Использование подхода протеомика снизу вверх позволяет определить пептиды, которые были убиквитинированы, в том числе пептиды убиквитина. Наблюдение убиквитина пептидов убиквитина позволяет определить топологию цепи, но связь с целью убиквитина теряется. Таким образом, конкретная топология цепи на том или ином протеине не может быть определена, но глобальный профиль топологии выведен. Метод также может быть объединен со стратегией обогащения, чтобы обеспечить более целенаправленные результаты. Такое обогащение должно учитывать цепную стабильность и обилие цепей после обогащения. Обнаружение топологии цепи ограничено чистотой, которую обеспечивает стратегия обогащения, так как невозможно отличить топологию убиквитина, связанную с загрязняющим белком, от тех, которые связаны с интересом белка. Важным шагом в этом протоколе, облегчая успешный анализ, является баланс сохранения цепи убиквитина при переваривании белка убиквитина. Это является сложной задачей из-за склонности к распаду цепи в сочетании с устойчивостью самого убиквитина к энзиматическому пищеварению. Кроме того, добавление матрицы поддержки и тщательное рассмотрение условий MS необходимы, учитывая менее благоприятный характер некоторых топологически-характерных пептидов к жидкому хроматографическому сочетанию масс-спектрометрического анализа.

Хотя мы изложили в этом протоколе средства, с помощью которых можно одновременно оценивать все типы убиквитиных цепочек, можно также скорректировать несколько аспектов протокола на основе конкретной топологии цепи, представляющих интерес. Манипулирование хроматографическими условиями или изменение концентрации тяжелых пептидов может повысить точность исследования, улучшая результаты для конкретной топологии цепи и адаптируя исследование к биологическому вопросу, предложенному.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Селин Джинти за помощь в создании клеточных гранул с лечением MG-132, как описано в репрезентативных результатах, и Элизе Моммертс за ее предоставление гранул кишечной палочки, используемых в протоколе.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN) Merck 100029
Ammonium bicarbonate (ABC) Fluka 9830
Centrifuge Beckman Coulter Microfuge 16
Chloroacetamide (CAA) Sigma 22790
Eppendorf LoBind Eppendorf 22431081
Formic acid (FA) Thermo Fisher Scientific 85178
Heavy Peptides JPT Peptide Technologies
HPLC Dionex Ulitimate 3000
LC Column Thermo Fisher Scientific 160321
Lys C Wako 125-05061
Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific Q-Exactive Plus
N-ethylmaleimide (NEM) ACROS Organics 156100050
Positive Control Chain K48 Boston Biochem UC-240
Positive Control Chain K63 Boston Biochem UC-340-100
Positive Control Chain M1 Boston Biochem UC-710B-025
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma S5881
Sonifier Branson sonifier SFX 150
Thermomixer Eppendorf Thermomixer Comfort
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigam T6508
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Thermo Fisher Scientific 77720
Trypsin Promega V1511A
Urea Sigma 51456
Waters μElution C18 plates Waters 186002318

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
  2. Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
  3. Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
  4. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  5. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
  6. Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
  7. Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
  8. Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
  9. Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
  10. Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
  11. Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
  12. Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).
  13. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
  14. Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
  15. Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
  16. MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).

Tags

Биохимия выпуск 160 убиквитин цепь масс-спектрометрия параллельный мониторинг реакции (PRM) протеомика целенаправленная посттрансляционная модификация топология
Убиквитин Цепной Анализ параллельным мониторингом реакции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Longworth, J., Mendes, M. L.,… More

Longworth, J., Mendes, M. L., Dittmar, G. Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring. J. Vis. Exp. (160), e60702, doi:10.3791/60702 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter