Summary
Hele 3D-struktur og cellulære indhold af organoider, samt deres fænotopypiske lighed med det oprindelige væv kan fanges ved hjælp af encellede opløsning 3D-billeddannelse protokol beskrevet her. Denne protokol kan anvendes på en bred vifte af organoider varierende i oprindelse, størrelse og form.
Abstract
Organoid teknologi, in vitro 3D dyrkning af miniaturevæv, har åbnet et nyt eksperimentelt vindue for cellulære processer, der styrer organudvikling og funktion samt sygdom. Fluorescensmikroskopi har spillet en stor rolle i at karakterisere deres cellulære sammensætning i detaljer og demonstrere deres lighed med det væv, de stammer fra. I denne artikel præsenterer vi en omfattende protokol for høj opløsning 3D-billeddannelse af hele organoider på immunfluorescerende mærkning. Denne metode er bredt anvendelig til billeddannelse af organoider forskellige i oprindelse, størrelse og form. Hidtil har vi anvendt metoden til luftveje, kolon, nyre, og lever organoider stammer fra sundt humant væv, samt menneskelige bryst tumor organoids og mus mælkekirtlen organoider. Vi bruger et optisk clearingmiddel, FUnGI, som gør det muligt at erhverve hele 3D-organoider med mulighed for encellet kvantificering af markører. Denne tre-dages protokol fra organoid høst til billedanalyse er optimeret til 3D-billeddannelse ved hjælp af konfokal mikroskopi.
Introduction
Udviklingen af nye kultur metoder, såsom organoid teknologi, har gjort det muligt kultur af organer i en skål1. Organoider vokse ind i tre-dimensionelle (3D) strukturer, resemble deres væv af oprindelse, som de bevarer fænoypiske og funktionelle træk. Organoider er nu medvirkende til at løse grundlæggendebiologiske spørgsmål 2, modellering sygdomme, herunder kræft3, og udvikle personligebehandlingsstrategier 4,5,6,7. Siden den første protokol til generering af organoider afledt af intestinal voksne stamceller8,organoid teknologi har udvidet til at omfatte en bred vifte af sunde og kræft væv stammer fra organer, herunder prostata9, hjerne10, lever11,12,mave 13, bryst14,15, endometrium16, spytkirtel17, smagsløg18, bugspytkirtel19, og nyre20.
Udviklingen af organoider har tilekom med stigningen i nye volumetriske mikroskopi teknikker, der kan visualisere arkitekturen af hele mount væv i 3D21,22,23,24. 3D-billeddannelse er bedre end traditionel 2D-vævssektionsbilleddannelse i visualiseringen af den komplekse organisering af biologiske prøver. 3D-oplysninger viser sig at være afgørende for forståelsen af cellulære sammensætning, celleform, celle-skæbne beslutninger og celle-celle interaktioner af intakte biologiske prøver. Ikke-ødelæggende optiske tværsningsteknikker, såsom konfokale eller multi-foton laserscanning mikroskopi (CLSM og MLSM) og lys ark fluorescens mikroskopi (LSFM), nu muliggøre kombineret visualisering af både fine detaljer, samt generelle væv arkitektur, inden for en enkelt biologisk prøve. Denne kraftfulde billeddannelse tilgang giver mulighed for at studere den strukturelle kompleksitet, der kan modelleres med organoider25 og kortlægge den rumlige fordeling, fænotopisk identitet og cellulære tilstand af alle individuelle celler komponere disse 3D-strukturer.
For nylig offentliggjorde vi en detaljeret protokol for høj opløsning 3D-billeddannelse af faste og ryddede organoider26. Denne protokol er specielt designet og optimeret til behandling af sarte organoidstrukturer i modsætning til metoder til store intakte væv såsom DISCO27,28, CUBIC29,30,31og CLARITY32,33. Som sådan, denne metode er generelt anvendes til en bred vifte af organoids forskellige oprindelse, størrelse og form og cellulære indhold. Desuden, sammenlignet med andre volumetrisk billeddannelse protokoller, der ofte kræver betydelig tid og kræfter, vores protokol er krævende og kan udfyldes inden for 3 dage. Vi har anvendt vores 3D-billeddannelse protokol til at visualisere arkitektur og cellulære sammensætning af nyudviklede organoid systemer stammer fra forskellige væv, herunder menneskelige luftveje34,nyre20,lever 11, og menneskelige brystkræft organoider15. I kombination med flerfarvede fluorescerende afstamning sporing, denne metode er også blevet brugt til at afsløre biopotens af basalceller i mus mammary organoider14.
Her forfiner vi protokollen ved at indføre det ugiftige clearingmiddel FUnGI35. FUnGI clearing opnås i en enkelt inkubation trin, er lettere at montere på grund af sin viskositet, og bedre bevarer fluorescens under opbevaring. Derudover introducerer vi natrium dodecylsulfat (SDS) til vaskebufferen for at forbedre nukleare pletter samt en silikonebaseret monteringsmetode til nem rutsjebaneforberedelse før mikroskopi. Figur 1 giver det grafiske overblik over protokollen (Figur 1A) og eksempler på 3D-afbildede organoider (Figur 1B-D). Kort sagt, organoider inddrives fra deres 3D-matrix, fast og immunmærket, optisk ryddet, afbildet ved hjælp af konfokal mikroskopi og derefter 3D gengivet med visualisering software.
Protocol
Brug af museafledte organoider i overensstemmelse med lovgivningsmæssige standarder og blev godkendt af Walter og Eliza Hall Institute (WEHI) Animal Ethics Committee. Alle humane organoidprøver blev hentet fra biobanker gennem Hubrecht Organoid Technology (HUB, www.hub4organoids.nl). UMC Utrechts (METC UMCU) medicalse godkendes for at sikre, at den nederlandske lov om medicinsk forskning, der involverer personer, overholdes, og donorerne fik informeret samtykke, når det var relevant.
1. Fremstilling af reagenser
- For at forberede 4% (w/v) paraformaldehyd (PFA) opvarmes 400 ml fosfatbufferet saltvand (PBS) til lige under 60 °C i et vandbad. Tilsæt 20 g PFA-pulver og opløses ved hjælp af en omrører.
- Dernæst tilsættes et par dråber 10 M NaOH. Lad afkøle på is og tilsæt et par dråber på 10 M HCl at justere pH til 7,4. Optære med PBS til 500 ml og aliquot (opbevares ved -20 °C i op til 2 måneder).
BEMÆRK: Der må ikke opvarmes over 60 °C for at undgå nedbrydning af PFA. Tilberedningstid = 4 timer.
- Dernæst tilsættes et par dråber 10 M NaOH. Lad afkøle på is og tilsæt et par dråber på 10 M HCl at justere pH til 7,4. Optære med PBS til 500 ml og aliquot (opbevares ved -20 °C i op til 2 måneder).
- For at forberede PBS med Tween-20 (PBT) (0,1% v/v) tilsættes 1 ml Tween-20 til 1 L PBS (opbevares ved 4 °C i op til 4 uger).
BEMÆRK: Tilberedningstid = 10 min. - Til fremstilling af 100 ml 0,5 M ethylenediamintetraaceticsyre (EDTA) tilsættes 18,6 g EDTA og 2,5 g NaOH til 80 ml dH2O. Juster pH-slutningen til 8 med 1 M NaOH og fyldes til 100 ml med dH2O.
- Til fremstilling af 500 ml 1 M Tris opløses 60,55 g Tris med 42 ml koncentreret (36−38%) HCl i 300 ml dH2O. Juster pH-slutningen til 8 og fyld til 500 ml.
- Til fremstilling af organoid vask buffer (OWB), tilsættes 1 ml Triton X-100, 2 ml af 10% (w / v) SDS og 2 g af kvæg serum albumin (BSA) til 1 L PBS (opbevares ved 4 °C op til 2 uger).
BEMÆRK: Tilberedningstid = 10 min. - For at gøre 220 ml FUnGI blandes 110 ml glycerol med 20 ml dH2O, 2,2 ml Tris buffer (1 M, pH 8,0) og 440 μL EDTA (0,5 M). Tilsæt 50 g fruktose og blandes ved stuetemperatur (RT) i mørke, indtil den er opløst. Når den er klar, tilsættes 49 g fruktose og blandes indtil opløst. Derefter tilsættes 33,1 g urinstof og blandes indtil opløst (opbevares ved 4 °C i mørke).
BEMÆRK: Må ikke opvarmes som fruktose karamelliserer ved højere temperaturer. FUnGI består af 50% (v/v) glycerol, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 mM tris base, 1,1 mM EDTA, 2,5 M fructose og 2,5 M urinstof. Tilberedningstid = 1 dag. - Til fremstilling af PBS-BSA (1% w/v) opløses 1 g BSA i 100 ml PBS (opbevares ved 4 °C i op til 2 uger).
BEMÆRK: Tilberedningstid = 10 min.
2. Gendannelse af organoid
BEMÆRK: Følgende trin gælder for organoider, der dyrkes i kældermembranekstrakt (BME), og som er dyrket i en 24 brøndplade med en størrelse på 100-500 μm .
- Aspirere kulturmediet og vask 1x med iskold PBS. Undgå at forstyrre 3D-matrixen.
- Sæt pladen på is og tilsæt 1 ml iskold cellegenvindingsopløsning (Materialetabel) til hver brønd. Inkuber 30−60 min ved 4 °C på en vandret shaker (40 omdr./min.).
BEMÆRK: 3D-matrixdråberne skal være helt opløst. - Coat en 1 ml pipettespids med BSA ved at dyppe i 1% PBS-BSA og pipettere op og ned 2x. Denne belægning vil forhindre organoids i at holde sig til spidsen. Til at belægge indersiden af et 15 ml konisk rør skal du fylde med 5 ml 1% PBS-BSA, vende 2−3x og kassere PBS-BSA.
BEMÆRK: Denne belægning er nødvendig for alle plastforbrugsstoffer indtil fiksering (trin 3.3). - Ved hjælp af en belagt spids, forsigtigt resuspendre indholdet af brønden 5−10x og overføre organoider til belagt 15 ml rør. Organoider fra forskellige brønde med samme identitet kan samles i samme rør.
- Tilsæt 1 ml iskold 1% PBS-BSA til hver kultur godt at skylle og indsamle alle organoids.
- Tilsæt kold PBS til 10 ml og drej ned i 3 min ved 70 x g og 4 °C for at opnå en stram pellet uden et synligt lag af 3D-matrix. Fjern forsigtigt supernatanten.
3. Fiksering og blokering
- Omhyggeligt resuspendere organoider i 1 ml iskold PFA ved hjælp af en belagt 1 ml spids.
- Fastgør ved 4 °C i 45 min. Forsigtigt resuspendere organoids halvvejs gennem fikseringstiden ved hjælp af en belagt 1 ml spids for at sikre jævn fiksering blandt alle organoider.
- Der tilsættes 10 ml iskold PBT til røret, blandes forsigtigt ved at vende røret, inkuberes i 10 minutter og drejes ned ved 70 x g,begge ved 4 °C.
BEMÆRK: Fra dette trin og fremefter belægning af spidser er generelt ikke nødvendig, da de fleste organoid typer ikke klæber til spidsen efter fiksering. Men, nogle organoids kan kræve belagt plast selv efter fiksering. - Bloker organoiderne ved at opslænke pellet i iskold OWB (mindst 200 μL OWB pr. brønd) og overføre organoiderne til en 24 brøndsuspensionplade.
BEMÆRK: Organoider fra en stor pellet kan opdeles over flere brønde til at udføre forskellige pletter. - Inkuber ved 4 °C i mindst 15 min.
4. Immunmærkning
- Pipette 200 μL OWB i en tom brønd til at tjene som en reference godt.
BEMÆRK: Immunmærkningen kan også udføres i 48- eller 96-brønde plader for at reducere brugen af antistof. Brugeren skal dog være opmærksom på, at både farvning og vaskeevne kan reduceres på grund af det mindre volumen. - Lad organoiderne sætte sig i bunden af pladen.
BEMÆRK: Dette kan kontrolleres ved hjælp af et stereomikroskop og gøres lettere ved hjælp af en mørk baggrund. - Vip pladen 45° og fjern OWB, så organoiderne efterlades i 200 μL OWB (brug referenceblyten til at anslå 200 μL).
- Der tilsættes 200 μL OWB med primære antistoffer 2x koncentreret (f.eks. keratin 8/18 [1:200], MRP2 [1:50] og Ki67 [1:200] for resultater i figur 2) og inkubere natten over ved 4 °C, mens mildt vuggende / rystende (40 rpm på vandret shaker). Figure 1
- Den næste dag, tilsættes 1 ml OWB.
- Lad organoiderne sætte sig i bunden af pladen i 3 min. Fjern OWB, så der er 200 μL i pladen. Tilsæt 1 ml OWB og vask 2 timer med mild rokkende/rystende.
- Gentag trin 4.6 to gange mere.
- Lad organoiderne sætte sig i bunden af pladen i 3 min. Fjern OWB og lad 200 μL være i brønden.
- Der tilsættes 200 μL OWB med sekundære antistoffer, konjugerede antistoffer og farvestoffer 2x koncentreret (f.eks. Figure 1 DAPI [1:1000], rotte-AF488 [1:500], kanin-AF555 [1:500], mus-AF555 [1:500], falloidin-AF647 [1:100] for resultater i figur 2; DAPI [1:1000], phalloidin-AF647 [1:100] for resultater i figur 3) og inkuberes natten over ved 4 °C, mens den er mildt vuggende/rystende.
- Den næste dag gentages trin 4.5−4.7.
- Overfør organoiderne til et 1,5 ml rør og drej ned ved 70 x g i 3 min.
5. Optisk rydning af organoider
- Fjern så meget som muligt OWB ved pipettering uden at forstyrre organoids.
- Der tilsættes FUnGI (mindst 50 μL, RT) ved hjælp af en 200 μL spids med enden afskåret og opslæmret forsigtigt for at forhindre bobledannelse. Inkubere på RT i 20 min.
BEMÆRK: Optisk rydning fra FUnGI kan forårsage mindre vævssvind. Dette vil ikke påvirke den generelle morfologi af monolag og flerlagede organoider; dog kan sfæriske formede monolagede organoider med store lumen kollapse. Protokollen kan sættes på pause her, og prøverne kan opbevares ved 4 °C (i mindst 1 uge) eller ved -20 °C (i mindst 6 måneder).
6. Skub forberedelse til konfokal billeddannelse
- Tilbered en 10 ml sprøjte med silikone fugemasse (Tabel af Materialer). Fastgør en 200 μL spids og afskåret enden for at tillade en blid strøm af tyktflydende silikone efter presning af sprøjten. Brug sprøjten til at tegne et rektangel på 1 cm x 2 cm i midten af et dias.
- Skær slutningen af en 200 μL spids og overføre organoider i FUnGI til midten af rektanglet.
- Placer en dæksling på toppen. For at minimere fanget luftbobler, skal du placere venstre side af dækslæbet først, derefter langsomt sænke dækslæbet fra venstre mod højre, indtil der ikke er nogen fanget luft og derefter frigive dækslæbet.
BEMÆRK: Afstandsfravigere, der er simililar i størrelse til organoids kan bruges til at forhindre dem i at blive beskadiget. - Pres forsigtigt på alle dækslernes kanter for at fastgøre den fast til silikonefugemassen. Diaset er nu klar til billedbehandling.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og prøven kan opbevares ved 4 °C (i mindst 1 uge) eller -20 °C (i mindst 6 måneder).
7. Erhvervelse og behandling af billeder
- Ved hjælp af en konfokal laser scanning mikroskop(Tabel af materialer), billede diaset med en multi-nedsænkning 25x eller olie nedsænkning 40x mål for konfokal billeddannelse.
- Brug følgende anskaffelsesindstillinger for 25x-målsætningen: scanningstilstandsramme, rammestørrelse 1024 x 1024, voxelstørrelse 332 nm x 332 nm x 1,2 μm, pixelbomtid <2 μs, tovejsscanning, gennemsnitsnummer 1, bitdybde 8. Hvis du vil reducere fotobleaching, skal du bruge lav lasereffekt (<5% generelt ,<10% for svag farvning).
- Brug Z-stack-tilstanden til at definere de nedre og øvre grænser og indstille Z-trinsstørrelsen til optimal. Når du billeder store organoidstrukturer eller flere organoider sammen, skal du bruge flisebelægningstilstanden med 10 % overlapning og angive interesseområdet.
BEMÆRK: Med disse indstillinger er datastørrelsen for et typisk organoid med en diameter på <300 μm <1 GB.
- For flise scanning datasæt, sy billedfiler i softwaren ledsaget af mikroskop(Tabel af materialer). I behandlingssektionen skal du vælge Syning som metode, vælge Nyt output under parametre og vælge den fil, der skal sys. Tryk på Anvend for at begynde at sy.
- Få en 3D-gengivet repræsentation af billeddannelsen under fanen 3D-visning i billedbehandlingssoftwaren (Tabel over Materialer), og optimer efterfølgende egenskaber for lysstyrke, kontrast og 3D-gengivelse. Eksporter RGB snapshots af resultaterne som TIFF-filer.
Representative Results
Billeddiagnostiske organoider i 3D muliggør visualisering af arkitektur, cellulær sammensætning samt intracellulære processer i detaljer. Den præsenterede teknik er krævende og kan formentlig anvendes på en bred vifte af organoid systemer, der er afledt af forskellige organer eller værtsarter.
Styrken af 3D-billeddannelse sammenlignet med 2D-billeddannelse illustreres af billeder af musemarkirtlens organoider, der blev genereret ved hjælp af nyligt offentliggjortemetoder 14. Det centrale lag af disse organoider består af søjleformede K8/K18-positive lysceller, og det ydre lag indeholder aflange K5-postive basalceller (Figur 2A), som opsummerer morfologien i mælkekirtlen in vivo. Denne polariserede organisation er udfordrende at forstå fra en 2D optisk del af samme organoid(Figur 2B,midterste panel). Et andet eksempel på en kompleks struktur, der er umulig at fortolke uden 3D-oplysninger, er netværket af MRP2-positive canaliculi, der letter indsamlingen af galdevæsken i humane leverorganoider11 (Figur 2B). Dette er et eksempel på, hvordan vores metode tillader visualisering af væsentlige strukturelle træk ved organoids. Desuden giver den opnåede kvalitet og opløsning mulighed for halvautomatisk segmentering og billedanalyse. Således kan samlede celletal og tilstedeværelse af markører kvantificeres i specifikke cellulære undertyper i hele organoider. Vi illustrerer dette ved at segmentere kernerne i et helt organoid, der indeholder 140 celler, hvoraf 3 celler viser høj positivitet for Ki67 cellecyklusmarkøren (Figur 2C). DAPI-kanalen vælges som kildekanal, og segmenter genereres baseret på et intensitetstærskkeltrin og en kuglediameter på 10 μm. Rørende objekter er opdelt efter region vokser fra frø punkter. Endelig anvendes et størrelsesfilter på 10 voxels til at fjerne små støjinducerede segmenter. For hvert segment, der repræsenterer en kerne, eksporteres ki67-kanalens gennemsnitsintensitet til plotning.
Vi har for nylig udviklet den optiske clearing agent FUnGI35, som vi nu integreret i denne protokol for at forfine gennemsigtigheden af organoids. FUnGI er nem at bruge, da clearing let opnås ved et enkelt inkubationstrin efter immunfluorescerende farvning. En ekstra fordel ved agenten er dets viskositet, hvilket gør det lettere for prøvehåndtering under slidemontering. Fluorescerende prøver i FUnGI bevarer deres fluorescens, selv når de opbevares i flere måneder ved -20 °C. Vi viser, at FUnGI overgår uklare og fruktose-glycerol i fluorescerende signalkvalitet dybt inde i organoid(figur 3A,B), og at FunGI-clearede organoider generelt har forbedret fluorescensintensitet sammenlignet med uklare organoids (Figur 3C).
Sammenfattende beskriver vi en krævende, reproducerbar 3D-billeddannelsesteknik til erhvervelse af volumetriske data for immunmærkede organoider. Denne protokol kan let bruges til at forestille sig en række organoids herunder af både mus og menneskelig oprindelse, fra sunde og sygdomsmodeller. Den enkle prøve forberedelse kan tilpasses for at lette konfokale, multi-foton og lys ark fluorescerende mikroskoper for at opnå cellulære til subcellulær opløsning af hele organoider.
Figur 1: Skematisk oversigt over 3D-billeddiagnostisk højopløsningsprotokol. Organoider er genvundet fra deres 3D-matrix. Fiksering og blokering udføres før immunmærkning med antistoffer og farvestoffer. Optisk rydning opnås i et enkelt trin ved hjælp af FUnGI clearing agent. 3D-gengivelse af billeder kan udføres ved hjælp af billedbehandlingssoftware. aA) Skematisk oversigt over proceduren. BB) Ryddet helmonteret 3D-konfokalt billede af et humant colon organoid immunmærket for F-actin og E-cadherin (E-cad) (25x oliemål). Skalabar = 40 μm. (C) Ryddet hele mount 3D konfokale billede. Skalabar = 20 μm. D) Forstørret optisk del af et humant colon organoid immunmærket for F-actin, E-cadherin (E-cad) og Ki67 (25x oliemål). Skalabar = 5 μm. Dette tal er blevet ændret fra Dekkers et al.26. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Volumetrisk billeddannelse visualiserer kompleks 3D-arkitektur. Konfokale billeder, der repræsenterer 3D-datasæt med hele monteringen (venstre panel), optiske 2D-sektioner (midterpanelet) og 3D-områder i et forstørret område (højre panel). a) Et organoid, der er fremstillet af en enkelt basalcelle i musemamarkirtlen, der illustrerer 3D-organisationen af aflange mælke basalceller, der omgiver lysceller eller er mærket for K8/18, K5 og F-actin (fructose-glycerolclearing; 25x oliemål). Skalastænger repræsenterer 55 μm (venstre panel) og 40 μm (midterste og højre paneler). (B) En human føtal lever organoid med et komplekst 3D-netværk af MRP2-positive canaliculi, mærket for DAPI, MRP2 og F-actin (fructose-glycerol clearing; 40x olie mål). Skalastænger repræsenterer 25 μm (venstre panel) og 8 μm (midterste og højre paneler). (C) Konfokal 3D hel-mount billede af en menneskelig føtal lever organoid mærket med DAPI og Ki67 (venstre panel) og et segmenteret billede på DAPI kanal ved hjælp af billedbehandling software (midterste panel). Skalabar = 15 μm. Graf afbildet repræsenterer Ki67 middelintensiteten i alle cellerne (DAPI-segmenteret) i hele organoid (140 celler) (højre panel). Dette tal er blevet ændret fra Dekkers et al.26. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Optisk rydning af organoider med FUnGI. AA) Repræsentative billeder af humane colonorganoider mærket med F-actin (grøn) og DAPI (grå) og afbildet uden clearing, ryddet med fruktose-glycerol eller ryddet med FUnGI (25x olie mål). Venstre panel: 3D-gengivelse af organoid. Højre panel: optisk-del af organoid på 150 μm dybde. For "ingen clearing" tilstand lysstyrken af billedet skulle øges i forhold til "fructose-glycerol" og "FUnGI" betingelser for at visualisere organoid. Skalabar = 50 μm. (B) Ikke-lineær regressionspasform, der viser faldet i DAPI-intensiteten med stigende Z-dybde for forskellige optiske clearingmetoder. Værdier repræsenterer intensiteter af de enkelte celler, der påvises ved DAPI-segmentering, og normaliseres til den gennemsnitlige DAPI-intensitet af de første 50 μm af organoiden. For at undgå undervurdering af dæmpningen forårsaget af lysere celler på de dybere kanter og spirende strukturer, kun de midterste regioner af organoids blev analyseret. (C) Tre organoider pr tilstand af samme størrelse og dybde mod dækslet blev afbildet ved hjælp af identiske mikroskop indstillinger. De fulde 3D-datasæt blev segmenteret med en enkelt celle på DAPI-signal til sammenligning. Søjlediagram, der viser gennemsnitlig DAPI-intensitet med forskellige clearingmetoder på fulde segmenterede datasæt. Data afbildes som middelværdi ± SD. Værdier er intensiteter af >3800 individuelle celler, der registreres af DAPI-segmentering. = p < 0,0001, Kruskal-Wallis test med tosidet Dunn's multiple sammenligning post-hoc test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her har vi fremlagt en detaljeret protokol for 3D-billeddannelse af intakte organoider med encellet opløsning. For at kunne udføre denne protokol skal der tages nogle vigtige trin. I dette afsnit fremhæver vi disse trin og udfører fejlfinding.
Det første kritiske skridt er fjernelsen af 3D-matrixen. De fleste organoider er formeret in vitro med brug af matricer, der efterligner in vivo ekstracellulære miljø for at forbedre dannelsen af vel polariserede 3D-strukturer. Fiksering og efterfølgende farvning i 3D-matrixen er mulig, men kan være ufordelagtig for udbredelsen af antistoffer eller kan generere højt baggrundssignal (data ikke vist). Effektiv fjernelse af matricer kan påvirkes af typen af matrix, mængden og størrelsen af organoids og langvarig dyrkning. Derfor kan optimering være nødvendig for forskellige kulturforhold. For organoider dyrket i Matrigel eller BME er et 30-60 min trin i den iskolde cellegenvindingsopløsning tilstrækkelig til at opløse matrixen uden at beskadige organoiderne. Desuden kan fjernelse af den understøttende 3D-matrix resultere i tab af oprindelige strukturer og afbrydelse af organoidkontakter med andre celletyper, for eksempel når organoider er co-dyrket med fibroblaster eller immunceller. Desuden er optimal organoidfiksering afgørende for at bevare 3D-vævsarkitektur, proteinantigenicitet og minimere autofluorescens. Fastsættelse i 45 min. med 4 % PFA ved 4 °C er normalt tilstrækkelig til mærkning af en lang række organoider og antigener. Men en længere fiksering skridt, op til 4 timer, er typisk mere hensigtsmæssigt for organoider udtrykke fluorescerende reporter proteiner, men vil kræve optimering for forskellige fluorophores. Fiksering gange kortere end 20 min er utilstrækkelige til korrekt mærkning F-actin ved hjælp af falloidin sonder. Et andet almindeligt spørgsmål er tabet af organoider under protokollen. Det er derfor vigtigt at (i) omhyggeligt pelsrørspidser og rør med 1% BSA-PBS som beskrevet ved håndtering af ufikserede organoider for at forhindre dem i at holde sig til plast, (ii) bruge lavklæbende eller suspensionsplader til at forhindre prøven i at holde sig til pladen, og (iii) give organerne tilstrækkelig tid til at sætte sig i bunden af pladen, før bufferne fjernes omhyggeligt. Pipettering viskøse FUnGI kan indføre bobler. Håndtering af den rensede prøve ved RT reducerer viskositeten og forbedrer brugervenligheden og minimerer dermed tab af organoider. Mens de fleste organoider er nemme at håndtere, cystiske organoider med en forstørret lumen har en høj tendens til at kollapse, når fastsættelse med 4% PFA eller når ryddet med FUnGI. Denne effekt kan reduceres, men ikke helt forebygges, ved hjælp af et andet fiksativ (f.eks. formalin eller PFA-glutaraldehyd). Men, Dette kan potentielt påvirke autofluorescens, antistof penetration og epitope tilgængelighed. Når cystiske organoider vises foldet efter clearing, anbefales det at springe clearing trin og billede ved multi-foton mikroskopi, som er mindre hæmmet af lys spredning. Endelig kan det være en udfordring at opnå hele 3D-strukturen af organoider og kræver minimal afstand mellem coverslip og organoid. Når organoider har plads til at bevæge sig i deres monteringsstof, kan det desuden resultere i X- og Y-skift, mens data optages i Z-dybde. Brug mindre silikone fugemasse under dias forberedelse kan løse suboptimal montering mellem coverslip og mikroskop dias. Men for lidt silikone kan føre til organoid kompression og tab af deres iboende 3D-struktur. FUnGI forbedrer håndteringen for diasmontering og stabilitet af organoider, mens billeddannelse, på grund af dets højere viskositet.
Mens denne protokol kan bruges til en bred vifte af applikationer til at studere i dybden cellulære indhold og 3D-arkitektur intaktorganoider, visse begrænsninger bør overvejes. Denne metode er temmelig lav-gennemløb og tidskrævende. Faktisk bør brugerne huske på, at billeddannelse store intakte organoider i 3D kræver både fliser og prøve erhvervelse i Z, hvilket fører til langvarige erhvervelse gange. Hurtigere billedbehandling kan opnås ved hjælp af mikroskop aktiver, herunder resonans eller spinning disk scanner, eller ved lys ark mikroskop teknologi26. En anden overvejelse er, at markører kan udtrykkes heterogent mellem forskellige organoider fra samme prøve. Derfor bør flere organoider erhverves for bedre at fange denne organoid heterogenitet i kulturen. Endelig, mens den komplette våde lab procedure er ligetil, efterbehandling af data kræver færdigheder i billedanalyse software til 3D visualisering og kvantificering, samt statistikker for minedrift alle de oplysninger, der findes i datasættet.
I det sidste årti, inden for volumen billeddannelse har langt fremme, på grund af både udviklingen af en bred vifte af optiske clearing agenter og forbedringer i mikroskopi og beregningsmæssige teknologier27,30,31. Mens der i fortiden de fleste undersøgelser fokuseret på store mængder billeddannelse af organer eller tilhørende tumorer, for nylig metoder til mindre og mere skrøbelige væv, herunder organoid strukturer, er blevetudviklet 36,,37,38. Vi har for nylig offentliggjort en enkel og hurtig metode til billeddannelse hel-mount organoids af forskellig oprindelse, størrelse og form på enkelt celle niveau for efterfølgende 3D-rendering og billedanalyse26, som vi præsenterede her med nogle forbedringer (f.eks FUnGI, silikone montering) og ledsaget af en video protokol. Denne metode er bedre end konventionel 2D-sektionsbaseret billeddannelse i dechifrering af kompleks cellemorfologi og vævsarkitektur (Figur 2) og let at implementere i laboratorier med konfokal mikroskop. Med små tilpasninger til protokollen, kan prøverne gøres kompatible med, super-opløsning konfokale, multi-foton samt lysark billeddannelse, hvilket gør denne protokol bredt anvendelig og giver brugerne et kraftfuldt værktøj til bedre at forstå den flerdimensionelle kompleksitet, der kan modelleres med organoider.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er meget taknemmelige for den tekniske support fra Princess Máxima Center for Pediatric Oncology og hubrecht instituttet og Zeiss for billedbehandling støtte og samarbejder. Alle billedbilleder blev udført på Princess Máxima imaging center. Dette arbejde blev støttet økonomisk af Princess Máxima Center for Pediatric Oncology. JFD blev støttet af et Samlet Marie Curie-stipendium og et VENI-tilskud fra Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO). ACR blev støttet af et starttilskud fra Det Europæiske Råd (EFR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| 2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
| Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
| Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
| Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
| Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
| Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
| Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
| Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
| Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
| Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
| Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
| Imaris software | Bitplane | ||
| Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
| Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
| E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
| Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
| Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
| Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
| MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
| Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
| Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
| Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
| Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
| Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
| Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Workstation | Dell |
References
- Sato, T., Clevers, H. Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Bartfeld, S., Stem Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), 84 (2016).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Nanki, K., et al. Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
- Jamieson, P. R., et al. Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics. Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Maimets, M., et al. Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. SnapShot: Tissue Clearing. Cell. 171 (2), 496 (2017).
- Rios, A. C., et al. Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation. Nature Communications. 7, 11400 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kubota, S. I., et al. Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 20, 236-250 (2017).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Rios, A. C., et al. Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging. Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).
- Chen, Y., et al. Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues. The Scientific World Journal. 2013, 624342 (2013).
- Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, 166884 (2019).
