Summary
Organoidlerin tüm 3Boyutlu yapısı ve hücresel içeriği nin yanı sıra orijinal dokuya olan henotipik benzerlikleri burada açıklanan tek hücreli çözünürlükte 3D görüntüleme protokolü kullanılarak yakalanabilir. Bu protokol, kökeni, büyüklüğü ve şekli değişen çok çeşitli organoidlere uygulanabilir.
Abstract
Organoid teknoloji, minyatür doku in vitro 3D kültür, organ gelişimi ve fonksiyonu yanı sıra hastalık yöneten hücresel süreçler için yeni bir deneysel pencereaçtı. Floresan mikroskopi, hücresel bileşimlerini ayrıntılı olarak karakterize etmede ve ortaya çıktıkları dokuya benzerliklerini göstermede önemli bir rol oynamıştır. Bu makalede, immünofloresan etiketleme üzerine tüm organoidlerin yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme için kapsamlı bir protokol sayılmiyoruz. Bu yöntem, kökeni, büyüklüğü ve şekli farklı organoidlerin görüntülenmesi için yaygın olarak uygulanabilir. Şimdiye kadar biz hava yolu, kolon, böbrek ve karaciğer organoidler sağlıklı insan dokusu, yanı sıra insan meme tümörü organoidler ve fare meme bezi organoidler elde edilen yöntem uyguladık. Biz işaretleri tek hücreli sayısallaştırma için fırsat ile tüm 3D organoidlerin edinimi sağlayan bir optik takas ajanı, FUnGI kullanın. Organoid hasattan görüntü analizine kadar bu üç günlük protokol konfokal mikroskopi kullanılarak 3 Boyutlu görüntüleme için optimize edilebistir.
Introduction
Organoid teknoloji gibi yeni kültür yöntemlerinin ilerlemesi, bir çanak1organ kültürünü sağlamıştır. Organoidler, phenotibik ve fonksiyonel özellikleri korurken menşe dokularını süsleyen üç boyutlu (3D) yapılara dönüşürler. Organoidler şimdi temel biyolojik sorular ele almak için araçsal vardır2, kanser de dahil olmak üzere hastalıkların modelleme3, ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmek4,5,6,7. Bağırsak erişkin kök hücrelerinden türetilen organoidler üretmek için ilk protokol beri8, organoid teknolojisi prostat9dahil olmak üzere organlardan türetilen sağlıklı ve kanserli dokuların geniş bir yelpazede içerecek şekilde genişletilmiştir 9 , beyin10, karaciğer11,12, mide13, meme14,15, endometrium16, tükürük bezi17, tat tomurcuk18, pankreas19, ve böbrek20.
Organoidlerin gelişimi 3D21, 22,,23,22,24tüm montaj dokusunun mimarisigörselleştirmek yeni volumetrik mikroskobik teknikleriyükselişi ile eşleşmiştir. 3D görüntüleme, biyolojik örneklerin karmaşık organizasyonunu görselleştirmede geleneksel 2D doku kesiti görüntülemeden daha üstündür. 3D bilgi bozulmamış biyolojik örneklerin hücresel bileşimi, hücre şekli, hücre kaderi kararları ve hücre-hücre etkileşimleri anlamak için gerekli olduğunu kanıtlıyor. Konfokal veya multifoton lazer tarama mikroskobu (CLSM ve MLSM) ve hafif sac floresan mikroskobu (LSFM) gibi tahribatsız optik kesit teknikleri artık hem ince ayrıntıların hem de genel doku mimarisinin tek bir biyolojik örnek içinde birleştirilmesine olanak sağlamaktadır. Bu güçlü görüntüleme yaklaşımı, organoidler25 ile modellenebilir yapısal karmaşıklığı çalışma ve bu 3D yapıları oluşturan tüm bireysel hücrelerin mekansal dağılımı, henotypik kimlik ve hücresel durumu harita fırsatı sağlar.
Son zamanlarda sabit ve temizlenmiş organoidler yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme için ayrıntılı bir protokol yayınladı26. Disco27,28,CUBIC29,,30,31ve CLARITY32,33gibi büyük bozulmamış dokular için metodolojiler aksine bu protokol, hassas organoid yapıların işlenmesi için özel olarak tasarlanmış ve optimize edilebiyideğiştirmiştir. Bu nedenle, bu yöntem genellikle kökeni, büyüklüğü ve şekli ve hücresel içerik farklı organoidler geniş bir yelpazede için geçerlidir. Ayrıca, genellikle önemli zaman ve çaba gerektiren diğer hacimsel görüntüleme protokolleri ile karşılaştırıldığında, protokolümüz talep edilemez ve 3 gün içinde tamamlanabilir. Biz mimari ve yeni geliştirilen organoid sistemlerin çeşitli dokulardan türetilen hücresel bileşimi görselleştirmek için 3D görüntüleme protokolü uyguladık, insan hava yolları dahil34, böbrek20, karaciğer11, ve insan meme kanseri organoidler15. Çok renkli floresan soy takibi ile birlikte, bu yöntem aynı zamanda fare meme organoidler bazal hücrelerin biyopotens ortaya çıkarmak için kullanılmıştır14.
Burada, toksik olmayan takas ajanı FUnGI35tanıtarak protokolü rafine. FUnGI temizleme tek bir kuluçka adımında elde edilir, viskozitesi nedeniyle montajı daha kolaydır ve depolama sırasında floresan iyi korur. Buna ek olarak, nükleer lekeleri geliştirmek için yıkama tamponuna sodyum dodecyl sülfat (SDS) ve mikroskopi öncesinde kolay slayt hazırlama için silikon bazlı montaj yöntemini sokuyoruz. Şekil 1 protokolün(Şekil 1A)grafiksel genel görünümünü ve 3Boyutlu görüntülenmiş organoidörnekleri(Şekil 1B−D)sağlar. Kısacası, organoidler 3D matris, sabit ve immünetiketli, optik temizlenmiş, konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenen ve daha sonra 3D görselleştirme yazılımı ile işlenen kurtarılır.
Protocol
Fare kaynaklı organoidlerin kullanımı mevzuat standartlarına uygun ve Walter ve Eliza Hall Enstitüsü (WEHI) Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı. Tüm insan organoid örnekleri Hubrecht Organoid Technology (HUB, www.hub4organoids.nl) aracılığıyla biyobankalardan alındı. UMC Utrecht Tıbbi Etik Komitesi (METC UMCU) tarafından, Hollanda İnsan Denekleri Yasası'na uygunluğu sağlamak amacıyla HUB'ın talebi üzerine yetki ler alınmış ve uygun olduğunda bağışçılardan bilgilendirilmiş onay almıştır.
1. Reaktiflerin hazırlanması
- %4 (w/v) paraformaldehit (PFA) hazırlamak için, 400 mL fosfat tamponlu salini (PBS) su banyosunda 60 °C'nin hemen altına ısıtın. PFA tozu 20 g ekleyin ve bir karıştırıcı kullanarak eritin.
- Sonra, 10 M NaOH birkaç damla ekleyin. Buz üzerinde soğumaya bırakın ve pH'ı 7,4'e ayarlamak için 10 M HCl'lik birkaç damla ekleyin. PBS ile 500 mL ve aliquot (2 aya kadar -20 °C'de saklayın).
NOT: PfA'nın bozulmasını önlemek için 60 °C'nin üzerinde ısıtmayın. Hazırlama süresi = 4 saat.
- Sonra, 10 M NaOH birkaç damla ekleyin. Buz üzerinde soğumaya bırakın ve pH'ı 7,4'e ayarlamak için 10 M HCl'lik birkaç damla ekleyin. PBS ile 500 mL ve aliquot (2 aya kadar -20 °C'de saklayın).
- PBS'yi Tween-20 (PBT) (%0,1 v/v) ile hazırlamak için 1 mL Ara-20 ila 1 L PBS ekleyin (4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın).
NOT: Hazırlama süresi = 10 dk. - 100 mL 0,5 M ethylenediamminetetraasetik asit (EDTA) hazırlamak için, 18,6 g EDTA ve 2,5 g NaOH ila80mL dH 2 O ekleyin.2
- 1 M Tris'in 500 mL'sini hazırlamak için 60,55 g Tris'i 42 mL konsantre (%36−38) ile çözün 300 mL dH2O'ndaki HCl, pH'ı 8'e ayarlayın ve 500 mL doldurun.
- Organoid yıkama tamponu (OWB) hazırlamak için 1 mL Triton X-100, 2 mL %10 (w/v) SDS ve 2 g büyükbaş serum albumin (BSA) ila 1 L PBS (4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın).
NOT: Hazırlama süresi = 10 dk. - 220 mL FUnGI yapmak için 110 mL gliserol ile 20 mL dH2O, 2,2 mL Tris tampon (1 M, pH 8,0) ve 440 μL EDTA (0,5 M) ile karıştırın. Fruktoz 50 g ekleyin ve çözünmüş kadar karanlıkta oda sıcaklığında (RT) karıştırın. Temizlendiğinde, 49 g fruktoz ekleyin ve eriyene kadar karıştırın. Daha sonra 33,1 g üre ekleyin ve eriyene kadar karıştırın (karanlıkta 4 °C'de saklayın).
NOT: Yüksek sıcaklıklarda fruktoz karamelize olarak ısıtmayın. FUnGI %50 (v/v) gliserol, %9.4 (v/v) dH2O, 10.6 mM tris baz, 1.1 mM EDTA, 2.5 M fruktoz ve 2.5 M üreden oluşur. Hazırlama süresi = 1 gün. - PBS-BSA (%1 w/v) hazırlamak için 1 g BSA'yı 100 mL PBS'de çözün (4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın).
NOT: Hazırlama süresi = 10 dk.
2. Organoid iyileşme
NOT: Aşağıdaki adımlar, 100−500 μm boyutunda 24 kuyu plakası ile yetiştirilen bodrum membran ekstresinde (BME) yetiştirilen organoidler için geçerlidir.
- Kültür ortamını aspire edin ve 1x buz gibi PBS ile yıkayın. 3B matrisi bozmaktan kaçının.
- Plakayı buza koyun ve her kuyuya 1 mL buz gibi hücre kurtarma çözeltisi(Malzeme Tablosu)ekleyin. Yatay bir çalkalayıcı (40 rpm) üzerinde 4 °C'de 30−60 dk kuluçka.
NOT: 3B matris damlacıkları tamamen çözülmelidir. - %1 PBS-BSA daldırma ve 2x yukarı ve aşağı boru lama ile BSA ile 1 mL pipet ucu kat. Bu kaplama organoidlerin uca yapışmasını önleyecektir. 15 mL konik bir tüpün iç tarafını kaplamak için %1 PBS-BSA'nın 5 mL'si ile doldurun, 2−3x ters çevirin ve PBS-BSA'yı atın.
NOT: Bu kaplama fiksasyona kadar tüm plastik sarf malzemeleri için gereklidir (adım 3.3). - Kaplamalı bir uç kullanarak kuyunun içeriğini 5−10x'i nazikçe askıya alın ve organoidleri kaplanmış 15 mL'lik tüplere aktarın. Aynı kimliğe sahip farklı kuyulardan gelen organoidler aynı tüpte biraraya getirilebilir.
- Durulama ve tüm organoidler toplamak için iyi her kültüriçin buz gibi% 1 PBS-BSA 1 mL ekleyin.
- 10 mL'ye soğuk PBS ekleyin ve 3B matrisin görünür bir katmanı olmadan sıkı bir pelet elde etmek için 70 x g ve 4 °C'de 3 dakika boyunca aşağı doğru döndürün. Dikkatle supernatant çıkarın.
3. Fiksasyon ve engelleme
- 1 mL buz gibi PFA'da, kaplamalı 1 mL uçlu organoidleri dikkatlice yeniden askıya alın.
- 4 °C'de 45 dk. Tüm organoidler arasında bile fiksasyon sağlamak için kaplamalı 1 mL ucu kullanarak fiksasyon süresiboyunca organoidleri yavaşça yeniden askıya alın.
- Tüpe 10 mL buz gibi PBT ekleyin, tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın, 10 dk kuluçkaya yatın ve her ikisi de 4 °C'de 70 x g'deaşağı doğru döndürün.
NOT: Bu adımdan itibaren uçların kaplanması genellikle gerekli değildir, çünkü çoğu organoid tip fiksasyon dan sonra uca yapışmaz. Ancak, bazı organoidler fiksasyon sonra bile kaplamalı plastik gerektirebilir. - Buz gibi OWB (kuyu başına en az 200 μL OWB) pelet yeniden askıya alarak organoidler blok ve 24 iyi süspansiyon plaka organoidler aktarın.
NOT: Büyük bir peletten organoidler farklı boyamalar yapmak için birden fazla kuyuya bölünebilir. - En az 15 dakika 4 °C'de kuluçka.
4. İmmün etiketleme
- Pipet 200 μL OWB boş bir kuyuda iyi bir referans olarak hizmet vermektedir.
NOT: İmmün etiketleme, antikor kullanımını azaltmak için 48 veya 96 kuyulu plakalarda da yapılabilir. Ancak, kullanıcı hem boyama ve yıkama performansı daha küçük hacim nedeniyle azaltılabilir farkında olmalıdır. - Organoidlerin tabağın dibine yerleşmesine izin verin.
NOT: Bu bir stereomikroskop kullanılarak kontrol edilebilir ve koyu bir arka plan kullanılarak daha kolay yapılır. - Plakayı 45° yatırın ve 200 μL OWB'de organoidleri bırakarak OWB'yi çıkarın (200 μL'yi tahmin etmek için referansı iyi kullanın).
- Şekil 1'dekisonuçlar için primer antikorlar 2kat konsantre (örneğin, E-kadherin [1:400] ve Ki67 [1:200] ile 200 μL OWB ekleyin; keratin 5 [1:500], keratin 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], ve Ki67 [1:200] Şekil 2sonuçları için ) ve gece boyunca tüp 4 °C'de hafif sallayarak /sallayarak (yatay çalkalayıcıda 40 rpm).
- Ertesi gün, OWB 1 mL ekleyin.
- Organoidler 3 dakika için plakanın altına yerleşmek için izin verin. OwB'yi plakada 200 μL bırakarak çıkarın. OWB 1 mL ekleyin ve hafif sallanan / sallayarak 2 saat yıkayın.
- Adımı 4.6'yı iki kez daha tekrarlayın.
- Organoidler 3 dakika için plakanın altına yerleşmek için izin verin. OWB'yi kuyuda 200 μL bırakarak çıkarın.
- İkincilantikorlar, konjuge antikorlar ve boyalar 2kat konsantre (örneğin, DAPI [1:1000], sıçan-AF488 [1:500], fare-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] Şekil 1'deki sonuçlar için 200 μL OWB ekleyin; DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], tavşan-AF555 [1:500], fare-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] Şekil 2sonuçları için ; DAPI [1:1000], phalloidin-AF647 [1:100] Şekil 3sonuçları için ) ve gece boyunca 4 °C'de inkübe ederken hafif sallayarak/sallayarak.
- Ertesi gün, 4.5−4.7 adımlarını tekrarlayın.
- Organoidleri 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3 dk boyunca 70 x g'de aşağı doğru döndürün.
5. Organoidlerin optik temizlenmesi
- Organoidleri bozmadan boru lar atarak OWB'yi mümkün olduğunca çıkarın.
- FUnGI (en az 50 μL, RT) ucu kesilmiş 200 μL ucu kullanarak ekleyin ve kabarcık oluşumunu önlemek için yavaşça askıya alın. 20 dakika RT'de kuluçka.
NOT: FUnGI ile optik takas küçük doku küçülme neden olabilir. Bu, tek katmanlı ve çok katmanlı organoidlerin genel morfolojisini etkilemez; ancak, büyük lümenile küresel şekilli monokatmanlı organoidler çökebilir. Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler 4 °C 'de (en az 1 hafta) veya -20 °C'de (en az 6 ay) saklanabilir.
6. Konfokal görüntüleme için slayt hazırlığı
- Silikon dolgu maddesi ile 10 mL'lik bir şırınga hazırlayın(Malzeme Tablosu). 200 μL'lik bir uç takın ve şırıngaya bastıktan sonra viskoz silikonun yumuşak bir şekilde akmasını sağlamak için ucunu kesin. Bir slayt ortasında 1 cm x 2 cm bir dikdörtgen çizmek için şırınga kullanın.
- 200 μL'lik bir ucun ucunu kesin ve FUnGI'deki organoidleri dikdörtgenin ortasına aktarın.
- Üstüne bir kapak fişi yerleştirin. Kapana kısılmış hava kabarcıklarını en aza indirmek için önce kapağın sol tarafını yerleştirin, sonra kapana kısılmış hava kalmayana kadar coverslip'i yavaşça soldan sağa indirin ve coverslip'i bırakın.
NOT: Organoidler için boyut olarak simililer spacers zarar görmelerini önlemek için kullanılabilir. - Silikon dolgu sıvısına sıkıca takmak için kapağın tüm kenarlarına hafifçe basınç uygulayın. Slayt görüntüleme için hazır.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numune 4 °C (en az 1 hafta) veya -20 °C (en az 6 ay) olarak saklanabilir.
7. Görüntü edinme ve işleme
- Konfokal lazer tarama mikroskobu(Malzeme Tablosu)kullanarak, kaydırağı konfokal görüntüleme için çok daldırma 25x veya yağ daldırma 40x hedefi ile görüntüleyin.
- 25x hedefi için aşağıdaki kazanım ayarlarını kullanın: tarama modu çerçevesi, kare boyutu 1024 x 1024, voxel boyutu 332 nm x 332 nm x 1,2 μm, piksel çalışma süresi <2 μs, çift yönlü tarama, ortalama sayı 1, bit derinliği 8. Fotobeyaztmayı azaltmak için düşük lazer gücü kullanın (
- Alt ve üst sınırları tanımlamak ve Z-adım boyutunu en iyi şekilde ayarlamak için Z-stack modunu kullanın. Büyük organoid yapıları veya birden fazla organoidi birlikte görüntülerken, %10 örtüşme ile fayans modunu kullanın ve ilgi alanını belirtin.
NOT: Bu ayarlarla, <300 μm çapında tipik bir organoidin veri boyutu <1 GB'dır. - Alt ve üst sınırları tanımlamak ve Z-adım boyutunu en iyi şekilde ayarlamak için Z-stack modunu kullanın. Büyük organoid yapıları veya birden fazla organoidi birlikte görüntülerken, %10 örtüşme ile fayans modunu kullanın ve ilgi alanını belirtin.
- 25x hedefi için aşağıdaki kazanım ayarlarını kullanın: tarama modu çerçevesi, kare boyutu 1024 x 1024, voxel boyutu 332 nm x 332 nm x 1,2 μm, piksel çalışma süresi <2 μs, çift yönlü tarama, ortalama sayı 1, bit derinliği 8. Fotobeyaztmayı azaltmak için düşük lazer gücü kullanın (
- Karo taraması veri setleri için, mikroskop(Tablo Malzemeler)ile birlikte yazılımgörüntüleme dosyaları dikiş. İşlem bölümünde, yöntem olarak Dikiş'i seçin, parametreler altında Yeni Çıktı'yı seçin ve dikişi için dosyayı seçin. Dikiş elemek için Uygula tuşuna basın.
- Görüntüleme yazılımında(Malzeme Tablosu) 3B Görünüm sekmesi altında görüntülemenin 3B görüntülenmiş bir temsilini edinin ve daha sonra parlaklık, zıtlık ve 3B işleme özelliklerini optimize edin. Sonuçların RGB anlık görüntülerini TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.
Representative Results
3Boyutlu görüntüleme organoidleri mimarinin, hücresel bileşimin ve hücre içi süreçlerin detaylı olarak görselleştirilmesini sağlar. Sunulan teknik talep edilemez ve muhtemelen çeşitli organ veya ev sahibi türlerden elde edilen organoid sistemlerin geniş bir yelpazede uygulanabilir.
2D görüntüleme ile karşılaştırıldığında 3D görüntüleme gücü son zamanlarda yayınlanan yöntemler kullanılarak oluşturulan fare meme bezi organoidlerin görüntüleri ile gösterilmiştir14. Bu organoidlerin merkezi tabakası columnar şekilli K8/K18-pozitif luminal hücrelerden oluşur ve dış tabaka, meme bezinin morfolojisini vivo olarak özetleyen uzamış K5-postive bazal hücreler(Şekil 2A)içerir. Bu polarize organizasyon aynı organoid(Şekil 2B, orta panel) bir 2D optik bölümünden takdir etmek zordur. 3D bilgi olmadan yorumlanması imkansız karmaşık bir yapının bir başka örneği insan karaciğer organoidlerinin safra sıvısı toplama kolaylaştırmak MRP2-pozitif kaniculiağı11 (Şekil 2B). Bu, yöntemimizin organoidlerin temel yapısal özelliklerinin görselleştirilmesine nasıl olanak sağladığını örneklemektedir. Ayrıca elde edilen kalite ve çözünürlük yarı otomatik segmentasyon ve görüntü analizine olanak sağlar. Böylece, toplam hücre sayıları ve belirteçlerin varlığı tüm organoidlerde belirli hücresel alt tiplerde ölçülebilir. Bunu, ki67 hücre döngüsü belirteci için yüksek pozitiflik gösteren 140 hücreiçeren tüm bir organoidin çekirdeklerini bölerek gösteriyoruz(Şekil 2C). DAPI kanalı kaynak kanal olarak seçilir ve segmentler yoğunluk eşik adımı ve 10 μm'lik küre çapına göre oluşturulur. Dokunma nesneleri tohum noktalarından büyüyen bölgeye göre bölünür. Son olarak, küçük gürültükaynaklı segmentleri kaldırmak için 10 voxels bir boyut filtresi uygulanır. Bir çekirdeği temsil eden her segment için, Ki67 kanalının ortalama yoğunluğu daha sonra çizim için dışa aktarılır.
Yakın zamanda, organoidlerin saydamlıklarını iyileştirmek için bu protokole entegre ettiğimiz optik takas ajanı FUnGI35'igeliştirdik. FUnGI kullanımı kolaydır, çünkü bağışıklık sistemisel boyamadan sonra tek bir kuluçka adımı ile takas kolayca sağlanır. Aracının ek bir avantajı da viskozitesidir, bu da slayt montajı sırasında numune işlemeyi kolaylaştırır. FUnGI'deki floresan numuneler -20 °C'de birden fazla ay saklansalar bile floresanlarını korurlar. Biz FUnGI organoid derin floresan sinyal kalitesi belirsiz ve fruktoz-gliserol daha iyi performans göstermektedir(Şekil 3A,B), ve Mantar temizlenmiş organoidler genel olarak gelişmiş floresan yoğunluğu belirsiz organoidler ile karşılaştırıldığında(Şekil 3C).
Özetle, immünetiketli organoidlerin hacimsel verilerini elde etmek için talep edilemez, tekrarlanabilir 3D görüntüleme tekniğini tanımlıyoruz. Bu protokol, hem fare hem de insan kökenli olanlar da dahil olmak üzere çeşitli organoidleri sağlıklı ve hastalıklı modellerden elde etmek için kolayca kullanılabilir. Basit numune hazırlama konfokal kolaylaştırmak için uyarlanabilir, multi-foton ve hafif levha floresan mikroskoplar tüm organoidlerin hücre içi hücresel çözünürlüğü elde etmek için.
Şekil 1: Yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme protokolünün şematik genel bakışı. Organoidler 3Boyutlu matrislerinden çıkarLar. Fiksasyon ve blokaj antikor lar ve boyalar ile immünetiketleme öncesinde yapılır. FUnGI takas aracısı kullanılarak optik takas tek bir adımda elde edilir. Görüntülerin 3D render görüntüleme yazılımı kullanılarak yapılabilir. (A) Prosedürün şematik genel bakışı. (B) F-actin ve E-kadherin (E-cad) (25x yağ hedefi) için etiketlenmiş bir insan kolon organoid immünotam 3D konfokal görüntü temizlendi. Ölçek çubuğu = 40 μm. (C) Temizlenmiş tam montaj 3D konfokal görüntü. Ölçek çubuğu = 20 μm. (D) F-actin, E-kadherin (E-cad) ve Ki67 (25x yağ hedefi) için immünoetiketli bir insan kolonik organoid genişletilmiş optik bölümü. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu rakam Dekkers ve ark.26'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hacimsel görüntüleme karmaşık 3B mimarisini görselleştirir. Tam montajlı 3D veri kümelerini (sol panel), 2B optik bölümleri (orta panel) ve genişlemiş bir bölgenin (sağ panel) 3B alanlarını temsil eden konfokal görüntüler. (A) Bir organoid fare meme bezinin tek bir bazal hücreden elde edilen luminal hücreleri çevreleyen veya K8/18, K5 ve F-actin (fruktoz-gliserol takas; 25x yağ hedefi) çevreleyen uzamış meme bazal hücrelerin 3D organizasyon gösteren. Ölçek çubukları 55 μm (sol panel) ve 40 μm (orta ve sağ paneller) temsil eder. (B) DAPI, MRP2 ve F-actin (fruktoz-gliserol temizleme; 40x yağ hedefi) etiketli MRP2-pozitif kanaliculi karmaşık bir 3D ağ ile bir insan fetal karaciğer organoid. Ölçek çubukları 25 μm (sol panel) ve 8 μm (orta ve sağ paneller) temsil eder. (C) Dapi ve Ki67 (sol panel) ile etiketlenmiş bir insan fetal karaciğer organoidinin confocal 3D tam montaj görüntüsü ve görüntüleme yazılımı (orta panel) kullanılarak DAPI kanalında segmentli bir görüntü. Ölçek çubuğu = 15 μm. Graf, tüm organoidin (140 hücre) (sağ panel) tüm hücrelerinde (DAPI-segmentli) Ki67 ortalama yoğunluğunu temsil eden çizilmiştir. Bu rakam Dekkers ve ark.26'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: FUnGI ile organoidlerin optik temizlenmesi. (A) F-actin (yeşil) ve DAPI (gri) ile etiketlenmiş ve hiçbir açıklık ile görüntülenen insan kolon organoidlerin temsili görüntüleri, fruktoz-gliserol ile temizlenir veya FUnGI ile temizlenir (25x yağ hedefi). Sol panel: organoid 3D render. Sağ panel: 150 μm derinlikte organoid optik bölümü. "Hiçbir temizleme" durumu için görüntünün parlaklığı organoid görselleştirmek için "fruktoz-gliserol" ve "FUnGI" koşulları ile karşılaştırıldığında artırılmalıdır. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Farklı optik temizleme yöntemleri için Artan Z derinliği ile DAPI yoğunluğunun azaldığını gösteren doğrusal olmayan regresyon uyumu. Değerler DAPI segmentasyonu tarafından saptanan tek tek hücrelerin yoğunluklarını temsil eder ve organoidin ilk 50 μm'lik ortalama DAPI yoğunluğuna normalleşir. Derin kenarlarda ve tomurcuklanan yapılarda daha parlak hücrelerin neden olduğu zayıflamanın hafife alınmaması için sadece organoidlerin merkezi bölgeleri analiz edildi. (C) Kapak kaymadoğru benzer boyut ve derinlikte durum başına üç organoidler aynı mikroskop ayarları kullanılarak görüntülendi. Tam 3B veri kümeleri karşılaştırma için DAPI sinyalinde tek hücreli olarak bölümlenmiştir. Tam parçalı veri kümelerinde farklı temizleme yöntemleriyle ortalama DAPI yoğunluğunu gösteren çubuk grafiği. Veriler ortalama ± SD. Değerleri DAPI segmentasyonu tarafından algılanan >3800 tek tek hücrelerin yoğunlukları olarak gösterilmiştir. = p < 0.0001, Kruskal-Wallis testi iki taraflı Dunn'ın çoklu karşılaştırma post-hoc testi ile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Burada, tek hücreçözünürlüğü ile bozulmamış organoidlerin 3Boyutlu görüntülemeiçin ayrıntılı bir protokol ortaya koyduk. Bu protokolü başarıyla gerçekleştirmek için bazı kritik adımların atılması gerekir. Bu bölümde bu adımları vurgular ve sorun giderme sağlar.
İlk kritik adım 3B matrisin kaldırılmasıdır. Çoğu organoidler iyi polarize 3D yapıların oluşumunu artırmak için in vivo ekstrasellüler ortamı taklit matris kullanımı ile in vitro yayılır. 3D matris içinde sabitleme ve sonraki boyama mümkündür, ancak antikorların penetrasyonu için dezavantajlı olabilir veya yüksek arka plan sinyali üretebilir (veriler gösterilmez). Matrislerin verimli bir şekilde çıkarılması matrisin türünden, organoidlerin miktarı ve büyüklüğünden ve uzun süreli kültürden etkilenebilir. Bu nedenle, farklı kültür koşulları için optimizasyon gerekebilir. Matrigel veya BME'de yetiştirilen organoidler için, buz gibi hücre kurtarma çözeltisinde 30−60 dk'lık bir adım, matrisi organoidlere zarar vermeden eritmek için yeterlidir. Buna ek olarak, destekleyici 3D matris kaldırılması yerli yapıların kaybına ve organoid diğer hücre tipleri ile organoid temas bozulmasına neden olabilir, örneğin organoidler fibroblastlar veya bağışıklık hücreleri ile birlikte kültürlü olduğunda. Ayrıca, optimal organoid fiksasyon 3D doku mimarisi, protein antijenitesi ve otofloresanenen aza indirilmesi nde çok önemlidir. 4 °C'de %4 PFA ile 45 dakika sabitleme, çok çeşitli organoid ve antijenlerin etiketlenmesi için normalde yeterlidir. Ancak, daha uzun bir fiksasyon adım, kadar 4 saat, genellikle daha floresan muhabir proteinlerifade organoidler için uygundur, ancak farklı floroforlar için optimizasyon gerektirir. 20 dk'dan kısa fiksasyon süreleri phalloidin probları kullanılarak F-aktini düzgün bir şekilde etiketlemek için yeterli değildir. Bir diğer yaygın sorun da protokol sırasında organoidlerin kaybedilmesi. Bu nedenle (i) sabitlenmemiş organoidleri kullanırken tanımlandığı şekilde %1 BSA-PBS ile boru uçlarını ve tüpleri dikkatlice kaplamak, (ii) numunenin plakaya yapışmasını önlemek için düşük yapışma veya süspansiyon plakaları kullanmak ve (iii) tamponları dikkatlice çıkarmadan önce organoidlerin plakanın alt kısmında yerleşmelerine izin vermek önemlidir. Viskoz FUnGI pipetleme kabarcıklar tanıtmak olabilir. TEMIZlenmiş numunenin RT'de kullanılması viskoziteyi azaltır ve kullanım kolaylığını artırır ve bu da organoid kaybını en aza indirir. Çoğu organoidin kullanımı kolay olmakla birlikte, genişlemiş lümenli kistik organoidler %4 PFA ile sabitlenirken veya FUnGI ile temizlendiğinde çökme eğilimi yüksektir. Bu etki, farklı bir fiksatif (örneğin, formalin veya PFA-glutaraldehit) kullanılarak azaltılabilir, ancak tamamen engellenemez. Ancak, bu potansiyel otofloresan etkisi olabilir, antikor penetrasyonu ve epitop kullanılabilirliği. Kistik organoidler açıklığa uğradıktan sonra katlanmış göründüğünde, ışık saçılımı ile daha az engellenen multi-foton mikroskopi ile temizleme adımını ve görüntüsünü atlamaları tavsiye edilir. Son olarak, organoidlerin tüm 3D yapısı elde zor olabilir ve coverslip ve organoid arasında en az mesafe gerektirir. Buna ek olarak, organoidler montaj ajanı taşımak için oda var, Bu Z derinliğinde veri kaydederken X neden olabilir- ve Y-shifts. Slayt hazırlama sırasında daha az silikon dolgu madde kullanmak, kapak kayması ve mikroskop kaydırağı arasındaki suboptimal montajı çözebilir. Ancak, çok az silikon organoid sıkıştırma ve doğal 3D yapısıkaybına yol açabilir. FUnGI, daha yüksek viskozitesi nedeniyle, görüntüleme sırasında slayt montajı ve organoidlerin stabilitesi için kullanım işlemlerini geliştirir.
Bu protokol derinlemesine hücresel içerik ve bozulmamış organoidlerin 3D mimarisi nde çalışmak için geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılabilir iken, bazı sınırlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Bu metodoloji oldukça düşük iş ve zaman alıcıdır. Gerçekten de, kullanıcılar 3D büyük bozulmamış organoidler görüntüleme z hem fayans ve örnek edinimi gerektirir akılda tutmak gerekir, uzun edinim süreleri yol. Daha hızlı görüntüleme, rezonans veya dönen disk tarayıcı sı dahil olmak üzere mikroskop varlıkları kullanılarak veya ışık sayfası mikroskop teknolojisi26ile elde edilebilir. Başka bir husus, belirteçlerin aynı örnekten farklı organoidler arasında heterojen olarak ifade edilebildiğidir. Bu nedenle, kültürde bu organoid heterojenliği daha iyi yakalamak için birden fazla organoid edinilmelidir. Son olarak, tam ıslak laboratuvar prosedürü basit olmakla birlikte, verilerin postprocessing 3D görselleştirme ve niceliklendirme için görüntü analizi yazılımı becerileri yanı sıra veri kümesinde mevcut tüm bilgileri madencilik istatistikleri gerektirir.
Son on yılda, hacim görüntüleme alanında büyük ölçüde gelişmiş, optik takas ajanları geniş bir yelpazede gelişimi ve mikroskopi ve hesaplamalıteknolojilerdegelişmeler hem de nedeniyle 27,30,31. Geçmişte çoğu çalışma organların veya ilişkili tümörlerin büyük hacimli görüntüleme odaklanmış iken, daha yakın zamanda organoid yapılar da dahil olmak üzere daha küçük ve daha kırılgan dokular için yöntemler, geliştirilmiştir36,37,38. Biz son zamanlarda sonraki 3D render ve görüntü analizi 26 için tek hücre düzeyinde çeşitli köken, boyut ve şekil tüm-montaj organoidler görüntüleme için basit ve hızlı bir yöntem yayınladı26, biz burada bazı iyileştirmeler ile sunulan (örneğin, FUnGI, silikon montaj) ve bir video protokolü eşliğinde. Bu yöntem, karmaşık hücre morfolojisi ve doku mimarisinin deşifre edilmesinde konvansiyonel 2D kesit tabanlı görüntülemeden daha üstündür(Şekil 2) ve konfokal mikroskoplu laboratuvarlarda uygulanması kolaydır. Protokole hafif adaptasyonlar ile, örnekler ile uyumlu yapılabilir, süper çözünürlüklü konfokal, multi-foton yanı sıra ışık sayfası görüntüleme, hangi bu protokolü yaygın olarak uygulanabilir hale getirir ve daha iyi organoidler ile modellenebilir çok boyutlu karmaşıklığı anlamak için güçlü bir araç ile kullanıcılara sağlar.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Princess Máxima Çocuk Onkoloji Merkezi'nden ve Hubrecht Enstitüsü ve Zeiss'e görüntüleme desteği ve işbirlikleri için teknik destek için minnettarız. Tüm görüntüleme Prenses Máxima görüntüleme merkezinde yapıldı. Bu çalışma Prenses Máxima Pediatrik Onkoloji Merkezi tarafından mali olarak desteklenmiştir. JFD, Marie Curie Global Fellowship ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nün (NWO) VENI bursu ile desteklenmiştir. ACR, avrupa konseyi (ERC) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| 2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
| Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
| Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
| Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
| Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
| Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
| Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
| Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
| Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
| Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
| Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
| Imaris software | Bitplane | ||
| Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
| Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
| E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
| Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
| Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
| Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
| MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
| Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
| Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
| Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
| Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
| Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
| Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Workstation | Dell |
References
- Sato, T., Clevers, H. Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Bartfeld, S., Stem Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), 84 (2016).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Nanki, K., et al. Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
- Jamieson, P. R., et al. Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics. Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Maimets, M., et al. Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. SnapShot: Tissue Clearing. Cell. 171 (2), 496 (2017).
- Rios, A. C., et al. Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation. Nature Communications. 7, 11400 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kubota, S. I., et al. Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 20, 236-250 (2017).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Rios, A. C., et al. Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging. Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).
- Chen, Y., et al. Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues. The Scientific World Journal. 2013, 624342 (2013).
- Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, 166884 (2019).
