Summary
全世界糖尿病和肥胖症的患病率在不断增加。需要进一步研究糖尿病、肥胖症及其相关死亡率和共病之间的机制。在这里，我们提出了一个协议，袖口胃切除术（SG）在动物作为一个简单的临床前模型的减肥手术。
Abstract
在成人和青少年中，超重和肥胖者的数量在不断增加。这与2型糖尿病（T2D）和其他代谢问题的普遍性现象增加相吻合。减肥手术，如SG，是目前最有效和常用的长期治疗肥胖和T2D之一，但他们之间的关联尚未完全探讨。根据临床前动物研究，可以研究人类减肥手术后的结果所依据的机制。SG 可降低体重、葡萄糖水平和许多代谢参数，并且易于执行，并发症发生率较低。这项工作的目标是为研究人员提供一个简单的方法和简单的动物减肥手术临床前模型。
Introduction
自1975年以来，全世界肥胖率增加了近三倍。2016年，超过19亿18岁成年人超重，超过6.5亿成年人肥胖。T2D在成人人口的患病率也翻了一番，从4.7%上升到8.5%，从1980年至2014年全球1.08亿成年人上升到4.22亿。大多数减肥手术导致显著减肥，减少身体脂肪，并改善葡萄糖耐受性，胰岛素抵抗和糖尿病控制2。除了T2D的减肥和缓解外，减肥手术还产生了额外的健康优势，如高血压控制，以及某些类型肥胖相关癌症的发病率下降和进展3。减肥手术还诱导T2D的持久完整、部分缓解，降低十年性大冠心病（CHD）的风险和某种程度的脑血管风险。然而，基本机制并不完全了解4。
有几种手术的减肥/代谢手术。限制性手术和胃肠道旁路手术对新陈代谢5有积极的影响。在减肥手术模型中，SG和改良的Roux-en-Y胃旁路具有较高的成功率和较低的死亡率，并证明可靠的限制性和胃肠道旁路手术模型在小鼠6。虽然胃肠道旁路手术提供了更多的减肥和显著改善葡萄糖耐受性及肝硬化比限制性程序长期，SG仍然产生良好的控制体重和葡萄糖水平，并易于执行与并发症发生率低6。从2008年到2014年，SG的比例从30%增加到54%，Roux-en-Y胃旁路手术从52%降至32%。目前，腹腔镜SG是在美国学术中心内最常进行的减肥手术。虽然已经发表了许多关于减肥手术、糖尿病和肥胖症之间病理生理过程的报告，但我们需要更多的动物实验来进一步探索未知的机制。
该协议旨在产生一种动物方法，以研究人类减肥手术后的结果基础的机制。目前的转化研究可能提供从SG肥胖和T2D治疗的机制的见解。
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Protocol
所有动物使用程序均经国家阳明大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合《实验室动物护理和使用指南》。第8版 ，2011年"。麻醉程序是根据国家阳明大学实验动物的疼痛控制、麻醉、术前和术后护理指南进行的，ICAUC-016，2015年，第 1版。
1. 动物准备
- 从国家实验室动物中心（NLAC）获得20只8周大的野生C57BL/6雄性小鼠，体重约16-18克。随机分配这些小鼠到SG或假操作组与10只小鼠。
- 在减肥或假手术9之前，先在cho或高Supplemental File脂肪饮食中启动小鼠（见补充文件）。产生饮食引起的肥胖症与至少2个术前周的HFD。
- 将老鼠住在国家阳明大学实验动物中心，在12：12的光暗循环下，于上午7时开始亮.M并允许对标准啮齿动物进行免费喂养和水。
- 限制所有动物的食物，但允许在手术前一天晚上免费取水。
2. 一般术前准备
- 在手术前禁食至少6小时。在 5% 异氟和氧气的感应室中诱导麻醉（均为 3-4 L/min）。
- 检查麻醉的深度，确保后爪、前爪和耳朵的挤压刺激（钝弯曲锯齿状平滑微钳）不会引起任何运动反射。手术前通过皮下注射管理抗生素（25毫克/千克塞法佐林）。
- 为外科手术分配特定的工作区域。清洁手术区域，并在手术前用 75% 的酒精溶液喷洒手术台。
- 将鼠标放在鼻锥中，用2%等值（2升/分钟）和氧气（4升/分钟）保持麻醉。
- 对于套管胃切除术和假手术，通过用趾刺激确认适当的麻醉深度后，在小鼠眼睛上涂抹0.2%的Carboomer眼凝胶，以防止眼睛干燥。
- 使用电动剃须刀将头发从腹部剃到胸骨。用脱毛霜去除并清洁剩余的头发。将鼠标放在手术台上，放在一个超级位置。
- 用波维酮碘溶液与 75% 酒精交替消毒小鼠的腹壁，用于 3 种应用。
3. 套管胃切除术和假手术
- 中位腹腔切除术
- 使用微剪刀在上腹部做一个1-1.5厘米长的中线切口。
- 胃肠外化
- 必要时，在放大解剖显微镜或放大镜的协助下执行SG程序，以防止不可预知的出血和低血性休克。
- 使用两个弯曲的光滑锯齿状微钳轻轻移动胃并完成外化。
- 根据需要，使用棉尖探针和电烧，小心地将连接左胃的胃部韧带与脾脏分开，从而从周围的脾脏和其他内脏中解剖胃部。
4. 胃隔离和夹子
注：鼠标的SG是使用新的剪辑应用程序技术执行，如之前发布的10。
- 用钳子轻轻和横向伸展胃部和胃部，识别中线（图1和图2），并小心地将手术夹从胃食管结和下极的胃中侧一半涂抹。夹紧并排除约75-80%的胃，从而创建整个胃的横向套管（图1和图2）。
- 将肠道移动到侧面裸露的皮肤，用热盐水湿润纱布盖住它，并根据需要进行内吸管水化，以防止脱水和体温过低。
- 切除横向夹住的胃，用微切口去除胃的外皮，然后用波维酮碘溶液对胃的切边进行消毒。
- 用 5-0 单丝不吸的缝合线过缝，以确保无泄漏。将缝合线末端与两端的夹子固定。
- 将胃肠返回到腹腔中的适当位置，并关闭腹部，用运行 5-0 单丝不可吸收的连续和不连续缝合到筋膜和腹壁。
- 在整个过程后，用酮保芬（2-5毫克/千克）和用西法佐林（25毫克/千克）在内性地管理镇痛药。
5. SG 的沙姆程序
- 执行与前面描述的类似手术，使用中线腹腔切除术，并使用 37 °C 湿热盐水纱布覆盖 5 分钟，将肠道和胃外化。
- 将胃和肠返回这些内脏器官的适当位置。
- 如先前所述，小心地关闭腹壁，使用缓慢或不可吸收的单丝缝合线对筋膜和皮肤进行 2 层连续和不连续闭合。在整个过程后，用酮保芬（2-5毫克/千克）和用西法佐林（25毫克/千克）在内性地管理镇痛药。
6. 一般术后护理
- 停止异氟兰，继续3-5 L/min的房间气流，直到鼠标完全清醒。
- 继续观察鼠标，而它恢复流动性，并开始在笼子里走来走去。
- 将鼠标放在30°C独立培养箱中5天。确保每个笼子只有一只老鼠，以防止老鼠互相伤害。
- 返回免费获得凝胶饮食食品（高脂肪凝胶饮食：10%猪油，10%液体糖，57%水）手术后3天，并在手术后3天重新引入先前分配的饮食。
- 手术后1天，在皮下或内皮注射酮（2-5毫克/千克）和塞法佐林（25毫克/千克）。
- 整个研究期每周评估小鼠体重。如果动物在手术后处于困境，请根据需要每天通过内丙酮注射提供酮酮（2-5毫克/千克），以便疼痛控制。
注：在这里，SG的存活率是90%后，学习期。
7. 代谢参数评估
- 快速小鼠6小时，并采集基线血液样本（0分钟）。从自由移动的老鼠11，12的尾静脉尖端获取所有血液样本。
- 通过内丙酮注射提供1毫克/克50%的葡萄糖，用于葡萄糖耐受性测试。
- 使用葡萄糖和测试条对重复样品进行葡萄糖给后，在 0、5、15、30、60 和 120 分钟内测量自由移动小鼠尾静脉尖端的血糖。
- 将整个血液样本（每组为n = 10）保持室温，凝血30分钟。
- 在 4 °C 下以 3，000 x g 离 心 血液样本 10 分钟。
- 将血浆转移到单独的管中，而不干扰血块，并在-80°C下储存。
- 研究结束时使用商用小鼠ELISA试剂盒研究血浆样本，用于血红蛋白A1c（HBA1c）、葡萄糖、胆固醇和胰岛素水平，根据制造商的指南。
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Representative Results
操作结果如图3 和图 4 所示。研究成活率为90%。一只老鼠因虚弱而死在假群中，另一只老鼠在手术后的第三天因不明原因在SG组死亡。HFD喂养小鼠手术后（图3A）的减肥结果与人类观察到的非常相似，最终体重减轻约15-20%13。13研究还表明，在HFD喂养小鼠的SG手术后，胆固醇水平（图3B）显著降低。
手术后，通过内皮内葡萄糖耐受性测试（IPGTT）观察到更好的胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性。在目前的研究中，我们证明HFD引起的肥胖引起野生C57BL/6型小鼠的胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受，可以通过SG进行矫正。在SG之后，胰岛素抵抗、葡萄糖和脂质水平在这项研究中都有所改善。
图1：SG的外科手术。
（A） 此实验模型中使用的 5 mm 手术夹。（B） 用捏刺激检查麻醉的深度。（C，D）将夹子涂抹在胃食管结的胃中线中间侧的一半上，并处于下极的优劣。（E） 消毒并缝合胃的切削边缘，以确保不漏水。（F-H）用温暖的盐水使小鼠水合，将胃肠放回腹腔中适当的位置。小心关闭腹腔。从感应室中的麻醉状态中恢复，当病情完全恢复和稳定时，返回笼。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：手术夹使用到胃的位点。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：SG对（A）每周体重变化和（B）胆固醇水平的影响。
数据表示为 SD ± *P < 0.05;**P < 0.001. 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：研究结束时，SG对（A）IPGTT（B）Hba1c和（C）HOMA-IR的影响。
（n = 5 Vsg; n = 7 假）;数据表示为 SD ± *P < 0.05;**P < 0.001. 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
大多数前瞻性队列研究已经证实，增加身体质量指数与死亡率增加有关。肥胖与糖尿病、心血管疾病 （CVD） 和两性死亡的较高风险相关。特定的病理过程已经建立了糖尿病、肥胖症和死亡率14之间的联系。系统回顾表明减肥手术在减少心血管疾病危险因素方面的好处，有心室肥大回归和改善舒张功能的证据。减肥/代谢手术可以改善肥胖糖尿病患者的传统CVD危险因素，在T2D 4肥胖患者进行各种减肥/代谢手术后，10年期CHD和致命CHD风险已显示出高达50%的降低。
减肥手术是治疗肥胖症最有效的长期治疗策略。减肥手术代谢参数的显著改善，如脂质特征、炎症生物标志物、血压和心力衰竭，也特别在意外的2型糖尿病控制中。SG已经减少和修改了脂肪组织炎症和发育，并可能降低动脉硬化的风险。
胃肠道激素的变化可能在长期体重控制16，17,方面发挥作用。SG还减少了热量摄入，并正常化血糖控制18。胃旁路手术相关的血糖耐受效应与当前理论19中绕过近肠引起的前肠激素效应有关。然而，SG已经证明了类似的抗糖尿病作用，建议进一步不绕过相关的未知机制，甚至超越胰高血糖素样肽1受体16，20,的效果。Lopez等人已经表明，SG促进减肥，改善胆固醇和葡萄糖状况，瘦素不敏感，并降低胰岛素抵抗，这是独立于肥胖的扎克大鼠21的ghrelin水平变化。所有这些问题需要进一步的动物研究，以澄清与糖尿病，肥胖症和疾病的联系。SG是一种不涉及肠道旁路，由于长期并发症低，这种手术在最近几十年在美国和全球越来越流行。
减肥外科手术在技术上难度大，耗时大，手术死亡率高，长期并发症多，是小动物实验的主要关键步骤。SG 是目前美国使用最多的减肥手术，因为它是一种简单、有效、共病和低死亡率的手术。该协议具有类似的优点，模仿体重减轻和代谢手术，在人类中经常进行。一般来说，手术技术在小鼠中是相当困难的，因为体型小，并且经常需要解剖显微镜，手术死亡率高。
Schlager等人已经开发出了一种具有手术夹应用的SG小鼠模型，而不是为胃缝手。这种动物模型已经证明了类似的体重减轻和葡萄糖控制的效果，但未能揭示显著胰岛细胞增殖10。这种对小鼠模型的代谢影响类似于人类减肥/代谢手术，手术死亡率非常低。
目前的研究表明，在HFD喂养的小鼠中，SG具有改进的糖化血红蛋白、IPGTT、HOMA-IR（胰岛素抵抗的恒量模型评估）和胆固醇水平，因此体重不断减轻。这种外科手术在小鼠中安全且易于进行。
我们实验室的手术存活率在学习期后约为90%，手术时间不到15分钟。该协议可能在未来的小型啮齿动物研究中提供重要的价值，具有手术可行性、安全性、可重复性和临床相关性。此方法还可用于突出人类减肥手术后观察到的生理变化。SG手术的难度是动物研究成功的重要因素。该协议易于执行，并模仿SG，如其他动物和人类研究中通常的做法。
这种动物模型可以通过一个简短的手术与套管胃切除术来研究糖尿病和肥胖症的临床相关性。这些手术可以缩短手术时间，提高手术存活率。本研究的主要优点是使用简单的手术模型模拟人类患者减肥手术的临床结果。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢伊莎贝尔·卢小姐的英语旁白。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% normal saline | China Chemical & Pharmaceutical Co., Ltd. | ||
| 5-0 monofilament suture | Shineteh Inc. Taiwan | Ethicon | |
| Alm | Shineteh Inc. Taiwan | ST-A072PK | UNIK |
| Animal Anesthesia | Step Technology | 0712VAP11076 | Matrx |
| Barraqer-Troutman forceps | Shineteh Inc. Taiwan | ST-N309(H-4410) | UNIK |
| cefazolin | Taiwan veteran pharmacy company | ||
| Chow diet | Research Diets | ||
| Glucose strips and glucometer | BeneCheck | BKM13-1 | BeneCheck |
| HbA1c kit | Level | OKEH00661 | |
| Hematology system | Fuji | FUJI DRI-CHEM 4000i | Europe |
| High Fat diet | Research Diets | 1810724 | LabDiet |
| Iris Forceps | Shineteh Inc. Taiwan | ST-1210 | UNIK |
| Iris Scissors | Shineteh Inc. Taiwan | ST-S011 | UNIK |
| Isoflurane | Panion & BF biotech INC | 8547 | Panion & BF |
| Ketoprofen | Sigma | 22071154 | Sigma-Aldrich |
| Stereo microscope | MicroTech | SZ-5T | MicroTech |
| Surgical clip (M) | Echicon Inc., Somerville, NJ | Size M, 5mm | |
| Vidisic gel | Dr. Gerhard Mann Chem.-pharm. Fabrik GmbH |
References
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