Summary
本稿では、ピロカルピン誘発てんかんマウスにおける記憶障害を評価するための実験的手順を提示する。このプロトコルは、てんかんの最も一般的な併存疾患の一つであるてんかん関連認知機能の病態メカニズムを研究するために使用することができる。
Abstract
認知障害は、側頭葉てんかんの最も一般的な併存疾患の一つである。てんかんの動物モデルにおけるてんかん関連認知機能の低下を再現するために、ピロカルピン処理慢性てんかんマウスを生成した。これらのてんかんマウスを用いた3つの異なる行動テストのプロトコルを提示します:新しい物体位置(NL)、新規物体認識(NO)、パターン分離(PS)テストをそれぞれ、場所、物体、および文脈の学習と記憶を評価する。動物の基底運動活動を測定するオープンフィールドテストに続いて、行動装置を設定し、NL、NO、PS試験の実験手順を提供する方法を説明します。また、てんかんマウスにおける記憶機能を評価するための他の行動検査に関するNL、NO、およびPS試験の技術的利点についても説明する。最後に、てんかんマウスが慣れ親しんだセッション中に30 sの物体と良好な接触を行わなかった場合の考えられる原因と解決策について議論します。したがって、このプロトコルは、マウスを使用しててんかん関連記憶障害を評価する方法に関する詳細な情報を提供する。NL、NO、およびPSのテストは、てんかんマウスの異なる種類の記憶の評価に適した、シンプルで効率的なアッセイです。
Introduction
てんかんは、自発的な,再発発作1、2、32を特徴とする1慢性疾患である。3反復発作は,5,,脳1、2、32において構造的および機能的異常を引き1起こす可能性があるため、異常発作活動は、最も一般的なてんかん関連の併存疾患の1つである認知機能障害に寄与し得る。3一過性で一時的な慢性的な発作イベントとは対照的に、認知障害はてんかん患者の生涯を通じて持続し、生活の質を低下させる可能性があります。したがって、てんかん関連認知機能低下の病態生理学的メカニズムを理解することが重要である。
,てんかんの様々な実験動物モデルは、慢性てんかん,7、8、9、10、11、128,に関連7する学習と記憶障害を12実証するために使用されてきた。91011例えば、モリス水迷路、文脈恐怖コンディショニング、ホールボード、新規物体位置(NL)、および新しい物体認識(NO)試験は、側頭葉てんかん(TLE)における記憶機能障害を評価するために頻繁に使用されてきた。海馬は、TLEが病理を示す主要領域の1つであるため、海馬依存性記憶機能を評価できる行動検査が優先的に選択されることが多い。しかし、発作が異常な海馬神経新生を誘発し、てんかん関連認知機能低下10に寄与する可能性があることを考えると、デンテート新生児神経機能を検査するための行動パラダイム(すなわち、空間パターン分離、PS)8、13はまた8,13、てんかんにおける記憶障害の細胞メカニズムに関する貴重な情報を提供することができる。
この記事では、てんかんマウスのメモリテスト(NL、NO、PS)のバッテリーを示します。テストは簡単で簡単にアクセスでき、洗練されたシステムを必要としません。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての実験手順は、韓国のカトリック大学の倫理委員会によって承認され、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイド(NIH出版物第80-23号)に従って実施されました。
1. 新規オブジェクト位置テスト (NL)
- ピロカルピン注射後4~6週間で、てんかんC57BL/6またはトランスジェニックマウスを準備します。
注:急性発作は腹腔内(IP)ピロカルピン注射によって誘発され、前の報告書14に詳述されたプロトコルに従った。 - 行動検査が始まる前日に、てんかんマウスを繁殖室から行動室に移す。マウスは一晩で少なくとも12時間習慣化することができます。
- 行動室では、個々のマウスを単一のハウジング用の新しいケージに分けます。ケージカードに各動物の情報を書き、行動テストを通して動物を同じケージに入れておきます。複数のケージはカートを使用して同時に移すことができる。
- 翌日、早朝に3日間の習慣セッション(H1-H3)を開始します。少なくとも30分間、家のケージの低光に動物を順応させる。
- 44 x 44 x 31 cmの外側の寸法と43 x 43 x 30.5 cmの内側の寸法を持つオープンフィールドボックスを準備します。習慣(H1)の1日目に、オープンフィールドボックスの中央に照度計を配置し、照度を60ルクスに調整します。
- オープンフィールドボックスの床と壁に70%のエタノールをスプレーし、きれいなペーパータオルで拭き取り、嗅覚の手がかりを取り除きます。その後、残存アルコールが完全に乾燥するまで少なくとも1分間待ちます。
- オープンフィールドテストを行うことで、各マウスの運動運動を評価します。
- 各実験用マウスの動作を記録および追跡するには、動物行動ビデオ追跡ソフトウェアを使用します(「資料文献」を参照)。
- ビデオトラッキングソフトウェアを開いたら、開いているフィールドボックスのサイズを調整します。次に、追跡用のゾーンを設定します。実験者の手を追跡しないように、3秒の待ち時間と15分の取得時間を設定します。実験用マウス(グループ、性別、年齢など)に関する情報を挿入します。
- 次に、壁に面したオープンフィールドボックスに実験用マウスをそっと置きます。取り扱いに関連するストレスや不安を最小限に抑えるために、ケージの蓋の上に置くことによってこれを行います。次に、オブジェクトが慣れ親しんだセッションの最も遠い場所である、開いているフィールド ボックスの壁の近くでマウスを放します (ステップ 1.9.3.
メモ:マウスが開いているフィールドボックスに入ると、マウストラッキングソフトウェアが自動的に検出して記録を開始します。探索の最適な追跡のために、カメラは開いているフィールド ボックスのすぐ上に配置できます。 - 記録の15分後、ケージの蓋の上に置くことによって、その家のケージに動物を返します。70%エタノールスプレーでオープンフィールドボックスを清掃し、試験の間にきれいなペーパータオルで拭き取ります。明るい光を復元し、メーカーの指示に従ってビデオ追跡ソフトウェアを使用して移動した動物の総距離を測定します。
- ビデオトラッキングソフトウェアとビデオクリップを開きます。次に、[分析] をクリックして、開いているフィールド ボックスのサイズのキャリブレーションに基づいて移動した合計距離を計算します。
- 2日目および3日目に、手順1.3~1.7を繰り返して習慣セッション(H2,H3)を行います。
- 4日目に、慣れ親しんだセッション(F1)を実行します。
- 薄暗い光の中で、空のオープンフィールドに各マウスを3分間置きます。その短い再居住の後、その家のケージに動物を返します。
- 慣れさせる間、70%エタノールで物を徹底的に清め、ペーパータオルで拭き取ります。残存アルコールが完全に乾燥するまで少なくとも1分待ちます。
- 隣接する壁から5cm離れたオープンフィールドアリーナに2つの同一のオブジェクト(ゴム人形、オブジェクトA)を配置します。両面テープでオブジェクトを固定します。開いたフィールド ボックスに、オブジェクトから最も遠い壁に面した実験用マウスを導入します。
- 20分間の無料探索を許可し、2つのストップウォッチを使用して両方のオブジェクトを探索するのにかかる時間を手動で測定します。マウスが両方のオブジェクトの最小探査時間(30 s)に達したら、F1セッションを停止し、動物を自宅のケージに移します。マウスが 20 分以内に 30 s のオブジェクトを探索できない場合は、開いているフィールド ボックスからマウスを削除し、それ以降のセッションから除外します。
- 開いたフィールドボックスから動物を取り除いた後、70%エタノールスプレーで箱の床や壁を徹底的に清掃し、ペーパータオルで拭き取ります。
注: マウスがヒゲ、スパウ、または前足でオブジェクトに触れた時間を測定します。動物のスナがオブジェクトに向いていない動作(オブジェクトの上に座ったり、オブジェクトを通過したり、後端がオブジェクトを指し示すなど)を指さない動作は、探索的な時間として数値化しないでください。
- 5 日目に NL テスト セッションを実行します。
- マウスをホームケージからオープンフィールドエリアに移し、3分間再居住します。その後、その家のケージに動物を返します。
- 慣れさせる間、70%エタノールで物を徹底的に清め、ペーパータオルで拭き取ります。残存アルコールが完全に乾燥するまで少なくとも1分待ちます。
- 1 つのオブジェクト(ゴム人形、オブジェクト A)を対角線位置に移動し、隣接する壁から 5 cm 離します。両面テープでオブジェクトを固定します。ケージの蓋の上の実験用マウスをオープンフィールド領域に移し、開いたフィールドボックスの壁に向かって置きます。
注: 移動したオブジェクトの位置を相殺して、特定の方向に対する自然の好みを減らします。例えば、実験動物の半分の慣れ親しんだセッションから好ましい対象物の位置を変更し、そして残りの動物については、あまり好ましくない物体を慣れ親しんだセッションから移動させる。 - ビデオトラッキングシステムで10分の無料探索と録画を可能にします。2つのストップウォッチを使用して各オブジェクトの探索に費やした時間を測定し、次のように判別比を計算します。
注: マウスがヒゲ、スパウ、または前足でオブジェクトに触れた時間を測定します。動物のスナがオブジェクトに向いていない動作(オブジェクトの上に座ったり、オブジェクトを通過したり、後端がオブジェクトを指し示すなど)を指さない動作は、探索的な時間として数値化しないでください。 - 実験用マウスの尾をつかみ、ケージの蓋の上に置いて自宅のケージに移します。3日間(6日から8日)、マウスは食べ物と水を自由に利用できます。
- 開いたフィールドボックスから動物を取り除いたら、70%エタノールスプレーで箱の床や壁を徹底的に清掃し、ペーパータオルで拭き取ります。
2. 新規物体認識試験(NO)
- 9日目に、1.2~1.7のステップを繰り返して15分の習慣セッションを行います。
- 10日目に、慣れ親しんだセッションを実行します(F1)。
- 薄暗い光の中で、空のオープンフィールドにマウスを3分間置きます。開いたフィールド領域にマウスを再び住み込んだ後、一時的にホームケージに戻します。
- 慣れさせる間、70%エタノールで物を十分に清め、ペーパータオルで拭き取ります。残存アルコールが完全に乾燥するまで少なくとも1分間待ちます。
- 隣接する壁から5cm離れたオープンフィールドに、同一の2つの物体(40 mLの水で満たされた50 mLプラスチックチューブ、物体B)を配置します。両面テープでオブジェクトを固定します。オブジェクトから最も遠い壁に面したオープンフィールドボックスに実験用マウスを導入します。
- 動物がNOテストで2つの異なる物体(50mLプラスチックチューブは40mLの水で満たされた、物体B;ガラスコプリン瓶、物体C)に曝露されると、F1セッション中に物体のバランスを相殺する。たとえば、グループ内の動物の半分に対して、同一の2つのオブジェクト(ガラスコプリン瓶、オブジェクトC)を提示します。
- 20分間の無料探索を許可し、2つのストップウォッチを使用して両方のオブジェクトを探索するのにかかる時間を手動で測定します。マウスが両方のオブジェクトの最小探査時間(30 s)に達したら、F1セッションを停止し、動物を自宅のケージに移します。マウスで 20 分以内に 30 s のオブジェクトを探索できない場合は、開いているフィールド ボックスからオブジェクトを削除し、それ以降のセッションから除外します。
- 開いたフィールドボックスから動物を取り除いた後、70%エタノールスプレーで箱の床や壁を徹底的に清掃し、ペーパータオルで拭き取ります。
注: マウスがヒゲ、スパウ、または前足でオブジェクトに触れた時間を測定します。動物のスナがオブジェクトに向いていない動作(オブジェクトの上に座ったり、オブジェクトを通過したり、後端がオブジェクトを指し示すなど)を指さない動作は、探索的な時間として数値化しないでください。
- 翌日(11日目)に、NOテストセッションを実行します。
- マウスをホームケージから3分間の再生息のためにオープンフィールドに移し、動物を自宅のケージに戻します。
- 慣れさせる間、70%エタノールで物を十分に清め、ペーパータオルで拭き取ります。残存アルコールが完全に乾燥するまで少なくとも1分待ちます。
- 1つの物体(40mLの水、物体Bで満たされた50 mLのプラスチックチューブ)を、隣接する壁から5cm離れた別の物体(ガラスコップリン瓶、物体C)に交換してください。両面テープでオブジェクトを固定します。ケージの蓋の上の実験用マウスを開いたフィールドに移し、壁に向かって置きます。NOテスト中に提示されたオブジェクトのカウンターバランスを取ります。例えば、1つのガラスコプリン瓶(オブジェクトC)を、慣れ親しんだセッション中に2つのガラスコプリン瓶(オブジェクトC)にさらされたマウスに対して40mLの水(オブジェクトB)で満たされた50 mLプラスチックチューブに置き換えます。
注: 置き換えられるオブジェクトの位置のバランスを相殺して、特定の方向の潜在的な自然の好みを減らすこともできます。例えば、2つの物体(オブジェクトBまたはオブジェクトC)の集合に曝露された動物のコホートごとに、実験動物の半分について慣れ親しんだセッションで好ましい対象を変更し、そして残りの動物については、慣れ親しんだセッションではあまり好ましくないオブジェクトを置き換える。 - 10分の無料探索を許可し、ビデオ追跡システムを使用して記録します。2つのストップウォッチを使用して各オブジェクトの探索に費やした時間を測定し、判別比を計算します。
注: マウスがヒゲ、スパウ、または前足でオブジェクトに触れた時間を測定します。動物のスナがオブジェクトに向いていない動作(オブジェクトの上に座ったり、オブジェクトを通過したり、後端がオブジェクトを指し示すなど)を指さない動作は、探索的な時間として数値化しないでください。 - 実験用マウスの尾をつかみ、ケージの蓋の上に置いて自宅のケージに移します。3日間(12-14日)、マウスは食べ物と水を自由に利用できます。
- 開いたフィールドボックスから動物を取り除いたら、70%エタノールスプレーでオープンフィールドボックスの床と壁を徹底的に清掃し、ペーパータオルで拭き取ります。
3. パターン分離試験(PS)
- 15日目に、PSテストの最初の慣れ親しんだセッション(F1)を実行します。
- マウスをホームケージからオープンフィールドエリアに移し、3分間再居住し、ホームケージに戻します。
- 習慣の間、70%エタノールでオブジェクトとグリッド付きの床板を徹底的に清掃し、ペーパータオルで拭き取ります。残存アルコールが完全に乾燥するまで少なくとも1分待ちます。
- 広いグリッド(5.5 x 5.5 cm)のフロアプレート(42.5 x 42.5 x 0.5 cm)をオープンフィールドボックスに配置し、隣接する壁から5cm離れたオープンフィールドに2つの同一の物体(50mLの水、物体Dで満たされたプラスチックTフラスコ)を配置します。両面テープでオブジェクトを固定します。オブジェクトから最も遠い壁に面したオープンフィールドボックスに実験用マウスを導入します。
- 動物はPSテストで2つの異なる物体(50mLの水で満たされたプラスチックTフラスコ、オブジェクトD;ガラス瓶、物体E)に曝露されると、F1およびF2セッション中にオブジェクトのバランスを取ります。例えば、グループ内の動物の半分に対して、広いグリッドフロアに2つの同一のオブジェクト(ガラスボトル、オブジェクトE)を提示する。
- 20分間の無料探索を許可し、2つのストップウォッチを使用して両方のオブジェクトを探索するのにかかる時間を手動で測定します。マウスが両方のオブジェクトの最小探査時間の合計(30 s)に達したら、F1セッションを停止し、動物を自宅のケージに移します。マウスで 20 分以内に 30 s のオブジェクトを探索できない場合は、開いているフィールド ボックスからオブジェクトを削除し、それ以降のセッションから除外します。
注: マウスがヒゲ、スパウ、または前足でオブジェクトに触れた時間を測定します。動物のスナがオブジェクトに向いていない動作(オブジェクトの上に座ったり、オブジェクトを通過したり、後端がオブジェクトを指し示すなど)を指さない動作は、探索的な時間として数値化しないでください。 - 最初の慣れ親しんだセッション(F1)の終了後、70%エタノールスプレーでオブジェクトとフロアプレートを徹底的に清掃し、オープンフィールドボックスから取り除きます。
- 翌日(16日目)に、PSテストの第2慣用セッション(F2)を実行します。
- マウスをホームケージからオープンフィールドエリアに移し、3分間再居住し、動物を自宅のケージに戻します。
- 習慣化の際は、70%エタノールで物やグリッド状の床板を徹底的に清掃し、ペーパータオルで拭き取ります。残存アルコールが完全に乾燥するまで少なくとも1分待ちます。
- 狭いグリッド(2.75 x 2.75 cm)のフロアプレート(42.5 x 42.5 x 0.5 cm)を開いたフィールドボックスに配置し、隣接する壁から5cm離れたオープンフィールドに2つの同一のオブジェクト(ガラスボトル、オブジェクトE)を配置します。両面テープでオブジェクトを固定します。オブジェクトから最も遠い壁に面したオープンフィールドボックスに実験用マウスを導入します。
- カウンターバランスのために、狭いグリッドの床に2つの同一のオブジェクト(50 mLの水で満たされたプラスチックTフラスコ、オブジェクトD)を提示する。
- 20分間の無料探索を許可し、2つのストップウォッチを使用して両方のオブジェクトを探索するのにかかる時間を手動で測定します。マウスが両方のオブジェクトの最小探査時間の合計(30 s)に達したら、F2セッションを停止し、動物を自宅のケージに移します。マウスで 20 分以内に 30 s のオブジェクトを探索できない場合は、開いているフィールド ボックスからオブジェクトを削除し、それ以降のセッションから除外します。
注: マウスがヒゲ、スパウ、または前足でオブジェクトに触れた時間を測定します。動物のスナがオブジェクトに向いていない動作(オブジェクトの上に座ったり、オブジェクトを通過したり、後端がオブジェクトを指し示すなど)を指さない動作は、探索的な時間として数値化しないでください。 - 2回目の慣れ親しんだセッション(F2)の終了後、70%エタノールスプレーでオブジェクトやフロアプレートを徹底的に清掃し、オープンフィールドボックスから取り除きます。
- 翌日(17日目)に、PSテストセッションを実行します。
- マウスをホームケージからオープンフィールドエリアに移し、3分間再居住し、ホームケージに戻します。
- 習慣化の際は、70%エタノールで物やグリッド状の床板を徹底的に清掃し、ペーパータオルで拭き取ります。残存アルコールが完全に乾燥するまで少なくとも1分待ちます。
- 狭いグリッド(2.75 x 2.75 cm)のフロアプレートをオープンフィールドボックスに置き、隣接する壁から5cm離れたフロアプレートに2つの異なるオブジェクト(50 mLの水、物体D、ガラス瓶、オブジェクトEで満たされたプラスチックTフラスコ)を配置します。両面テープでオブジェクトを固定します。ケージの蓋の上の実験用マウスをオープンフィールド領域に移し、壁に面した場所に置きます。
- PSテスト中に提示されたオブジェクトのカウンターバランスを取ります。たとえば、狭いグリッドの床に各オブジェクト(オブジェクト D、オブジェクト E)を配置して、このコンテキストでオブジェクト E を新規オブジェクトにします。オブジェクトDまたはオブジェクトE(狭い床パターン上の新規オブジェクト)の位置を相殺して、特定の方向に対する自然な好みの可能性を低減することもできます。例えば、実験動物の半分について第2の慣れ親しみセッションから好ましい対象物を置き換え、そして残りの動物については、第2の慣れ親しんだセッションからあまり好ましくない対象物を置き換える。
- ビデオトラッキングシステムを使用して、10分の無料探索と記録を許可します。2つのストップウォッチを使用して各オブジェクトの探索に費やした時間を測定し、判別比を計算します。
注: マウスがヒゲ、スパウ、または前足でオブジェクトに触れた時間を測定します。動物のスナがオブジェクトに向いていない動作(オブジェクトの上に座ったり、オブジェクトを通過したり、後端がオブジェクトを指し示すなど)を指さない動作は、探索的な時間として数値化しないでください。 - 実験用マウスの尾をつかみ、ケージの蓋の上に置いて自宅のケージに移します。
4. クレシルバイオレット染色
- すべての行動検査を完了した後、ケタミン(50mg/mL)とキシラジン(23.3 mg/mL)のカクテル(4:0.5)を生理食動物に注入して動物を麻酔します。つま先ピンチへの応答の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
- 動物が深く麻酔されたら、脳15を固定するために4%パラホルムアルデヒドで経心的灌流を行う。
- 心筋灌流が終わったら、ハサミ15で動物の首を切る。次に、虹彩はさみを使用して頭蓋骨を取り除き、脳を露出させます。脳が単離された後、一晩4%パラホルムアルデヒドに後置し、続いて0.01Mリン酸緩衝生理食塩液中の30%スクロースで凍結保護を行う。
- 凍結スタットを使用して、スナップ凍結脳からコロナセクション(30 μm)を作ります。
- スライドに脳組織をマウントし、100%エタノールから水道水までの一連の水和ステップを100%、95%、90%、80%、70%エタノールで3分間連続して洗浄して洗浄します。
- 組織スライドを0.1%クレシルバイオレット溶液で15分間インキュベートします。
- 95%エタノール/0.1%の氷酢酸に組織スライドを浸して過度の汚れを取り除き、100%エタノール、50%エタノール/50%キシレン、および100%キシレンの溶液で組織を脱水します。
- 市販のキシレン実装媒体を使用して、組織スライドをカバースリップする。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
認知機能を評価するための一般的な実験スケジュールと設定を図 1に示します。ピロカルピン誘発急性発作の導入から6週間後、マウスは、試験の間に3日間の休息期間で分離された順にNL、NO、およびPS試験を行った(図1A)。NL テストでは、慣れ親しんだセッション (F1) の間に 2 つの同一のオブジェクトがオープンフィールドに配置され、翌日に 1 つのオブジェクトが新しい場所に移動されました。NO テストでは、テスト セッション中に 1 つのオブジェクトが新しいオブジェクトに置き換えられました。PS テストでは、2 つの慣れ親しんだセッション (F1、F2) に、異なるフロア グリッド パターンとオブジェクトの組み合わせが導入されました。そして、試験日に、各慣れ親しんだセッションから1つのオブジェクトを狭いグリッド床パターンに配置し、狭いグリッドフロアパターンの文脈で1つのオブジェクトを斬新にした(図1B)。オープンフィールドボックスは、電荷結合デバイスカメラの下の机の上に置き、不必要な視覚的手掛かりを避けるために黒いカーテンで囲むことができます(図2A)。サンプルオブジェクトは、マウスと同じサイズまたはわずかに大きい材料を洗浄するのが簡単でした(図2B)。オブジェクトの組み合わせは、一緒に提示された 2 つのオブジェクト間に有意な優先順位がないことを確認するために事前に選別する必要があります (図 2C)。異なるパターンを持つフロアプレートは、PSテストで追加の実験的な手掛かりを提供するために、オープンフィールドボックスに配置されました(図2B)。開いたフィールドボックスにマウスを導入すると、ビデオ追跡システムは、その軌道を追跡して総移動距離を解析しました(図2D)。ピロカルピン注射の6週間後、てんかんマウスはNL試験における差別比の有意な減少を示し、空間記憶障害を示した(図3)。また、物体認識記憶の試験であるNO試験では、てんかんマウスは、シャムコントロールと比較して記憶機能障害を示した。デンテート新生児神経機能をPS試験で評価した場合、てんかんマウスは複数の手がかりを持つ文脈で新しい物体を認識することが困難であった。制御実験として、慣れ親しんだセッション中に探査基準に達する運動活動と待ち時間を評価した(図3)。運動活動の測定は、てんかん動物(図3C)の有意な増加を示し、以前の報告16、17に沿って、17対象物を探索する動機は、シャム動物とてんかん動物と比較した(図3D)。慣れ親しんだセッションで探査基準に失敗した中退率は、NL、NO、PSテストでそれぞれ17.4%、18.2%、0%であり、一連の行動試験中に動物が実験環境に慣れてきたことを示唆した。最後に、プリシルバイオレット染色を用いたピロカルピン誘導状態てんかんの後の海馬細胞死を評価し、発作誘発性神経損傷を確認した(図4)。ピロカルピン処理動物は、シャムコントロールとは異なり、海馬のhilusおよびCA3サブフィールドでピノスティック細胞を実証した(図4)。
図1:動作テスト用バッテリーの概略表示(A) 新規物体位置(NL)、新規物体認識(NO)、および偽マウスおよびてんかんマウスのパターン分離(PS)試験の行動スケジュールの模式図。(B) NL、NO、およびPSテストのオブジェクトおよびフロアプレートの配置の代表的な画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:認知機能の評価のための行動装置。(A) 動作設定の概要。カメラは、不必要な手がかりを避けるためにカーテンで囲まれたオープンフィールドボックスのすぐ上に配置されました。(B) 新規オブジェクト位置 (NL)、新規オブジェクト認識 (NO)、およびパターン分離 (PS) 検定のサンプル オブジェクト。PSテストでは、異なるパターンを持つフロアプレート、すなわち、広いグリッドと狭いグリッドを、追加の手がかりを提供するために、オープンフィールドボックスに挿入されました。(C) NO と PS のテストセッション中に提示された各オブジェクトを探索する時間を示すグラフ (n = 7)。Mann-Whitney U検定(NO検定)と学生の未ペアリングt検定(PS検定)によって評価された2つのオブジェクトの間に、好みに大きな違いはありませんでした。(D) ビデオ追跡システムが、開いているフィールドボックス内の実験用マウスを検出したことを示す画像。赤い四角は、マウスの軌道を追跡するためのプリセットゾーンを示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:てんかんマウスにおける空間記憶障害とパターン分離。(A) 新規オブジェクト位置(NL)、新規物体認識(NO)、およびパターン分離(PS)試験の概略表示。新しいオブジェクトは赤い円で示されます。(B)シャム(n=8)とてんかんマウス(n=10)の間のNL、NO、およびPS試験における判別比を示すグラフ。てんかんマウスは、NL、NO、およびPSテストで有意な障害を示し、それぞれ場所、物体、およびコンテキストのメモリ機能をテストしていることに注意してください。*p < 0.05 によって NL テストのためのマンホイットニー U テスト。*p < 0.05 学生のNOテストのペアになっていないt検定による。*p < 0.05 学生の非対tテストとウェルチのPSテストの修正。(C)シャム(n=8)およびてんかんマウス(n=10)の運動活性を示すグラフである。てんかんマウスは、以前の報告に沿って、移動の増加を示していることに注意してください。*p < 0.05 学生のペアなしのt検定による。(D) NL、NO、および PS テストの慣れ親しんだセッションでの 30 秒の基準までの待機時間を示すグラフ。なお、恥(n=8)とてんかんマウス(n=10)の間で物体を探索する動機に違いは見当たらない。データは平均の平均±標準誤差(SEM)として提示される。SE = ステータスてんかん。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ピロカルピン誘導性てんかん(SE)後の海馬における神経細胞死。ピロカルピン注射から58日後に(A)シャムおよび(B)てんかん群からの代表的な画像。拡大画像は、ヒラス(a,d),CA1サブフィールド(b,e)および海馬のCA3サブフィールド(c,f)を示しており、これは低倍率の画像で白い正方形として示されている。海馬のhilusおよびCA3サブフィールドのピノスティック細胞に注意してください。左端の画像のスケールバー = 200 μm、下部の画像にも有効です。スケールバーは、それぞれ d 、e 、fに対しても有効です。 cこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この研究は、慢性てんかんを有するマウスにおける認知機能を評価するための実験的手順を説明する。多くの異なる行動テストパラダイムは、マウス18の学習および記憶機能を評価するために使用される。モリス水迷路、ラジアルアーム迷路、Y迷路、文脈恐怖コンディショニング、およびオブジェクトベースのテストは、最も頻繁に使用される行動テストであり、信頼性の高い結果を提供します。中でも、NL、NO、およびPS試験は、てんかんマウス88,1010における学習と記憶を評価するための効率的で簡単な方法である。てんかんマウスは行動セッション中に予期せぬ自発的な発作を起こす可能性があるため、恐怖のコンディショニング、軽度の飢餓、または強制的に泳ぐなど、他の肯定的または否定的な強化剤を追加することなく、動物の自然な傾向に基づく行動検査を使用して、再発発作を引き起こす可能性があります。,20さらに、他の行動テストと比較して、新皮ベースのテストは、広範なトレーニングセッションが必要とされないため、動物にとってストレスが少ない。さらに、新規性ベースの行動テストは、オブジェクトの位置を変更したり、新しいオブジェクトを提示したり、追加の刺激を組み合わせたりするだけで、異なるタイプのメモリ(すなわち、空間記憶、認識記憶、またはエピソード記憶)を評価するように簡単に変更することができます。一緒に考えて、NL、NO、およびPSテストのような新規性ベースのテストは、てんかんマウスの認知機能を評価するための多目的な利点を有する。
NL、NO、PSのテストは、てんかんマウスの学習と記憶機能を調査するための迅速かつ有用な実験モデルですが、それらを使用する際にいくつかの要因を考慮する必要があります。慢性てんかんマウスは、ピロカルピン注射7による不安の高まりを示し、慣れ親しんだセッション中の物体探査の著しい減少につながることはよく知られている。この調査の欠如は、テスト結果の誤解を引き起こす可能性があります。そのため、慣れ親しんだセッションの前にマウスが環境に慣れるための十分な慣れ野原への慣れが重要である。株によっては、マウスは、慣れ親しんだセッションの20分以内に30sの対象物を探索することができないかもしれません。その場合、開いているフィールドボックス内のオブジェクトの余分なペアを使用して別の習慣セッションを追加すると、オブジェクトに対するマウスの不安を軽減するのに役立ちます。開いたフィールドボックスを囲むカーテンは、外部の部屋の手掛かりを最小限に抑えることができ、実験的なマウスはオープンフィールドのオブジェクトに焦点を当てることができます。さらに、探索基準は、オブジェクト上に座ったり、オブジェクトを通過したり、後端がオブジェクトを指し示すなど、動物のスナをオブジェクトに向けていない動作を除外するほど厳密である必要があります。最後に、非常にまれかもしれませんが、発作のイベントは行動タスク中に発生する可能性があります。この場合、これらの動物は、メモリ関数の評価のための交交バイアスの可能性のあるソースであり得るとして、さらなる評価から除去することが推奨される。
NL、NO、およびPSの試験は、動物の新しい刺激に対する自然な好奇心に依存する非常に敏感な実験であり、微妙な変化はマウスの探索的挙動に影響を及ぼし、結果として決定的な判別比21,22,22をもたらす。例えば、マウスの過酷な取り扱い、寝具の変化は行動タスクの直前に、試験のタイミングの一貫性がなく、試験室への不十分な順応は、すべて動物のストレスレベルを上昇させることができ、明確な試験結果を引き起こす。さらに、各セッションでの非対称オブジェクトの不整合な提示、実験場付近のホームケージの配置、実験者の嗅覚署名の切り替えなど、変更されたテスト環境は、追加の要因を避けるために慎重に検討する必要があります。データ分析の段階では、複数の実験者による評価は、げっ歯類の探索行動やストップウォッチの使用の異なる基準による行動結果の変動の増加に寄与する可能性があります。これらの側面をまとめて、NL、NO、およびPSテストの成功の実装のためにも念頭に置く必要があります。
海馬と海馬の領域は、メモリ処理23、24,24でユニークな役割を果たすることが知られています。空間記憶は、主に海馬の機能に依存することが広く受け入れられているが、これはNL試験23,24,24によって容易に評価することができる。一方、物体認識記憶は、海馬,,,,,,,,25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38に加えて、心膜皮質、皮質、腹腔前頭前野を含む複数の脳領域を38含むようです。35,36,3725,262934,272830313233ピロカルピン処理てんかんマウスは、広範囲,にわたる海馬神経損傷39、40、41、42の空間記憶検査において39,40,41,一貫して行動障害を実証してきたが、物体認識記憶検査は、海外脳42領域10、41、42、43、44における可変神経変10,41性を伴う議論の結果を生み出した。43,44,42これらのデータは、海馬が中心的な役割を果たすことができる空間記憶とは異なり、物体認識が複数の脳領域間で洗練されたネットワーク接続を必要とする可能性があることを示唆している。特定の海馬サブフィールドが綿密に評価されると、CA1およびCA3/デンテート回領域が異なる情報を処理することが判明した。具体的には、CA1ニューロンは類似した項目への曝露によって活性化されると考えられているが、CA3およびデンテート回は類似した物体23,45,45の識別に関与している。その仮説と一致して、新たな証拠は、デンテート新生児ニューロンがパターン分離性能45、46、4746,47に寄与できることを示唆している。45てんかん発生時に異常な海馬神経新生が誘発されることを考えると、てんかんマウスは、慢性てんかんにおける新生児ニューロンの崩壊による類似の経験を差別する際のパフォーマンス障害を示すことができる。
結論として、てんかんマウスの記憶障害を評価する方法について述べた。具体的には、場所、オブジェクト、およびコンテキストのメモリをそれぞれテストする 3 つの動作テスト、NL、NO、および PS テストの実験プロトコルを提供します。マウスで利用可能な多くの認知テストパラダイムの中で、NL、NO、およびPSテストは、動物に最小限のストレスを与える非常に簡単で短いアッセイであり、再発発作を引き起こすことなくてんかん動物の記憶機能を評価するのに最適です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
ジェイミン・リー博士の技術サポートに感謝します。この研究は、韓国政府が資金を提供する韓国国立研究財団(NRF)助成金(NRF-2019R1A2C1003958、NRF-2019K2A9A2A0800167)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Sung-shim | Use with the 26 or 30 gauge needle | |
| 70% Ethanol | Duksan | UN1170 | Spray to clean the box and objects |
| black curtain | For avoiding unnecessary visual cues | ||
| Cresyl violet | Sigma | C5042 | For Cresyl violet staining |
| cryotome | Leica | E21040041 | For tissue sectioning |
| double-sided sticky tape | For the firm placement of the objects | ||
| DPX mounting medium | Sigma | 06522 | |
| ethanol series | Duksan | UN1170 | Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions |
| floor plate with narrow grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm | |
| floor plate with wide grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm | |
| illuminometer | TES Electrical Electronic Corp. | 1334A | For the measurement of the room lighting (60 Lux) |
| Intensive care unit | Thermocare | #W-1 | |
| ketamine hydrochloride | Yuhan | 7003 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| LED lamp | Lungo | P13A-0422-WW-04 | Lighting for the behavioral test room |
| objects | Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle | ||
| open field box | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm | |
| paper towel | Yuhan-Kimberly | 47201 | Use to dry open field box and objects |
| paraformaldehyde | Merck Millipore | 104005 | Make 4% solution |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| ruler | Use to locate the objects in the open field box | ||
| scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Smart system 3.0 | Panlab | Video tracking system | |
| stopwatch | Junso | JS-307 | For the measurement of explorative activities of mice |
| sucrose | Sigma | S9378 | For cryoprotection of tissue sections |
| terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| video camera (CCD camera) | Vision | VCE56HQ-12 | Place the camera directly overhead of the open field box |
| xylazine (Rompun) | Bayer korea | KR10381 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| xylene | Duksan | UN1307 | For Cresyl violet staining |
References
- Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
- Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
- Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5 (7), 380-391 (2009).
- Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
- Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34 (1), 183-204 (2016).
- Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
- Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207 (2), 329-349 (2007).
- Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114 (17), 3536-3545 (2017).
- Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
- Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606 (2015).
- Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3316-3327 (2018).
- Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
- Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429 (2016).
- Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219 (1), 284-297 (2009).
- Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51 (4), 789-804 (2006).
- Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11 (1), 0147733 (2016).
- Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718 (2017).
- Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
- van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13 (8), 1763-1792 (2018).
- Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
- Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
- Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 41-50 (2000).
- Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (1), 51-61 (2001).
- Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
- Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25 (1), 52-61 (2005).
- Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12 (5), 447-449 (2005).
- Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16 (12), 1759-1765 (2006).
- Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
- Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
- Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17 (1), 5-11 (2010).
- Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
- de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405 (1-2), 142-146 (2006).
- Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82 (1), 26-34 (2004).
- Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20 (23), 8853-8860 (2000).
- Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
- Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
- Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
- Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
- Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59 (9), 1785-1795 (2018).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46 (4), 499-508 (2005).
- Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21 (7), 702-713 (2011).
- Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34 (10), 515-525 (2011).
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-539 (2011).
