Summary
Dieser Artikel stellt experimentelle Verfahren zur Beurteilung von Gedächtnisstörungen bei pilocarpine-induzierten epileptischen Mäusen vor. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die pathophysiologischen Mechanismen der Epilepsie-assoziierten kognitiven Abnahme zu studieren, die eine der häufigsten Komorbiditäten bei Epilepsie ist.
Abstract
Kognitive Beeinträchtigung ist eine der häufigsten Komorbiditäten bei der temporalen Lappenepilepsie. Um epilepsieassoziierte kognitive Abnahme in einem Tiermodell der Epilepsie zu rekapitulieren, haben wir pilocarpinebehandelte chronische epileptische Mäuse generiert. Wir präsentieren ein Protokoll für drei verschiedene Verhaltenstests mit diesen epileptischen Mäusen: neuartige Objektposition (NL), neuartige Objekterkennung (NO) und Mustertrennungstests (PS), um Lernen und Gedächtnis für Orte, Objekte bzw. Kontexte zu bewerten. Wir erklären, wie man die Verhaltensvorrichtungen einstellt und experimentelle Verfahren für die NL-, NO- und PS-Tests nach einem Offenen Feldtest durchführt, der die basalen Bewegungsaktivitäten der Tiere misst. Wir beschreiben auch die technischen Vorteile der NL-, NO- und PS-Tests im Vergleich zu anderen Verhaltenstests zur Beurteilung der Gedächtnisfunktion bei epileptischen Mäusen. Schließlich besprechen wir mögliche Ursachen und Lösungen für epileptische Mäuse, die während der Einarbeitungssitzungen keinen guten Kontakt zu den Objekten herstellen, was ein entscheidender Schritt für erfolgreiche Gedächtnistests ist. Daher bietet dieses Protokoll detaillierte Informationen darüber, wie Epilepsie-assoziierte Gedächtnisstörungen mit Mäusen bewertet werden können. Die NL-, NO- und PS-Tests sind einfache, effiziente Assays, die für die Bewertung verschiedener Arten von Gedächtnis bei epileptischen Mäusen geeignet sind.
Introduction
Epilepsie ist eine chronische Erkrankung, die durch spontane wiederkehrende Anfälle1,2,3gekennzeichnet ist. Da sich wiederholende Anfälle strukturelle und funktionelle Anomalien im Gehirn verursachen können1,2,3, abnormale Anfallsaktivität kann zu kognitiver Dysfunktion beitragen, Die eine der häufigsten Epilepsie-assoziierten Komorbiditäten4,5,6. Im Gegensatz zu den chronischen Anfallsereignissen, die vorübergehend und vorübergehend sind, können kognitive Beeinträchtigungen im Leben epileptischer Patienten fortbestehen und ihre Lebensqualität verschlechtern. Daher ist es wichtig, die pathophysiologischen Mechanismen des epilepsieassoziierten kognitiven Rückgangs zu verstehen.
Verschiedene experimentelle Tiermodelle der Epilepsie wurden verwendet, um die Lern- und Gedächtnisdefizite im Zusammenhang mit chronischer Epilepsie7,8,9,,10,11,12zu demonstrieren. Zum Beispiel wurden häufig das Morris-Wasserlabyrinth, die kontextuelle Angstkonditionierung, Das Hole-Board, die neue Objektposition (NL) und die Tests zur neuartigen Objekterkennung (NO) verwendet, um Gedächtnisfunktionsstörungen bei der temporalen Lappenepilepsie (TLE) zu bewerten. Da der Hippocampus einer der primären Regionen ist, in denen TLE Pathologie zeigt, werden Verhaltenstests, die hippocampus-abhängige Gedächtnisfunktion bewerten können, oft bevorzugt ausgewählt. Da Anfälle jedoch eine abnorme Hippocampus-Neurogenese induzieren und zur Epilepsie-assoziierten kognitiven Abnahme beitragen können10, können Verhaltensparadigmen für tests die neuronale Funktion von Neugeborenen (d. h. räumliche Mustertrennung, PS)8,13 auch wertvolle Informationen über die zellulären Mechanismen von Gedächtnisstörungen bei Epilepsie liefern.
In diesem Artikel zeigen wir eine Batterie von Gedächtnistests, NL, NO und PS, für epileptische Mäuse. Die Tests sind einfach und leicht zugänglich und erfordern kein ausgeklügeltes System.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission der Katholischen Universität Korea genehmigt und in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80-23) durchgeführt.
1. Neuartiger Objektpositionstest (NL)
- Bereiten Sie epileptische C57BL/6 oder transgene Mäuse 4-6 Wochen nach Derphäapin-Injektion vor.
HINWEIS: Akute Anfälle wurden durch intraperitoneale (IP) Pilokarininjektion induziert, nach dem Protokoll, das in unserem vorherigen Bericht14beschrieben wurde. - Übertragen Sie die epileptischen Mäuse aus dem Brutraum einen Tag vor Beginn der Verhaltenstests in den Verhaltensraum. Lassen Sie die Mäuse mindestens 12 h über Nacht gewöhnen.
- Im Verhaltensraum trennen Sie einzelne Mäuse in neue Käfige für Einzelgehäuse. Schreiben Sie die Informationen für jedes Tier auf die Käfigkarte und halten Sie die Tiere während der Verhaltenstests in denselben Käfigen. Mehrere Käfige können gleichzeitig mit einem Warenkorb übertragen werden.
- Beginnen Sie am nächsten Tag am frühen Morgen mit 3 Tagen Gewöhnungssitzungen (H1–H3). Die Tiere mindestens 30 min in ihren heimischen Käfigen an das schwache Licht ankleben.
- Bereiten Sie eine offene Feldbox mit Außenmaßen von 44 x 44 x 31 cm und Innenabmessungen von 43 x 43 x 30,5 cm vor. Legen Sie am ersten Tag der Gewöhnung (H1) ein Beleuchtungstoometer in die Mitte des offenen Feldkastens und stellen Sie die Beleuchtungsstärke auf 60 Lux ein.
- Den Boden und die Wände der offenen Feldbox mit 70% Ethanol besprühen und mit einem sauberen Papiertuch abwischen, um mögliche Geruchshinweise zu entfernen. Warten Sie dann mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
- Bewerten Sie die Bewegungsaktivität jeder Maus, indem Sie einen OffenenFeldtest durchführen.
- Um das Verhalten jeder experimentellen Maus aufzuzeichnen und nachzuverfolgen, verwenden Sie Video-Tracking-Software für das Tierverhalten (siehe Tabelle der Materialien).
- Sobald die Video-Tracking-Software geöffnet ist, kalibrieren Sie die Größe des offenen Feldfeldes. Legen Sie dann die Zone für die Nachverfolgung fest. Legen Sie 3 s Latenz und 15 min Erfassungszeit fest, um die Hände eines Experimentators nicht zu verfolgen. Geben Sie die Informationen zu jeder experimentellen Maus ein (Gruppe, Geschlecht, Alter usw.).
- Legen Sie dann vorsichtig eine experimentelle Maus in den offenen Feldkasten mit Blick auf die Wand. Tun Sie dies, indem Sie es auf den Käfigdeckel legen, um Umgang-assoziierten Stress und Angst zu minimieren. Lassen Sie dann die Maus in der Nähe der Wand des offenen Feldfelds los, das am weitesten von dem Ort entfernt ist, an dem sich die Objekte während der Einarbeitungssitzung befinden (Schritt 1.9.3.).
HINWEIS: Sobald sich die Maus im offenen Feld befindet, erkennt die Maus-Tracking-Software sie automatisch und beginnt mit der Aufzeichnung. Für eine optimale Verfolgung der Erkundung kann die Kamera direkt über dem offenen Feldkasten platziert werden. - Nach 15 min Aufnahme, kehren Sie das Tier in seinen Hauskäfig zurück, indem Sie es auf den Käfigdeckel legen. Reinigen Sie die offene Feldbox mit 70% Ethanolspray und wischen Sie sie zwischen den Versuchen mit einem sauberen Papiertuch ab. Stellen Sie das helle Licht wieder her und messen Sie die Gesamtentfernung des Tieres, die mit der Video-Tracking-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers bewegt wurde.
- Öffnen Sie die Video-Tracking-Software und Videoclips. Klicken Sie dann auf Analyse, um die gesamtbewegte Entfernung basierend auf der Kalibrierung der Größe des offenen Feldfelds zu berechnen.
- Führen Sie am 2. und 3. Tag die Gewöhnungssitzungen (H2, H3) durch, indem Sie die Schritte 1.3 bis 1.7 wiederholen.
- Führen Sie am 4. Tag die Einarbeitungssitzung (F1) durch.
- Platzieren Sie jede Maus im dim Licht für 3 min in das leere offene Feld. Nach dieser kurzen Reha, bringen Sie das Tier in seinen heimischen Käfig zurück.
- Während der Gewöhnung die Objekte mit 70% Ethanol gründlich reinigen und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
- Platzieren Sie zwei identische Objekte (Gummipuppen, Objekt A) in der offenen Feldarena 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Befestigen Sie die Objekte mit doppelseitigem Klebeband. Führen Sie die experimentelle Maus in das offene Feldfeld ein, mit Blick auf die Wand, die am weitesten von den Objekten entfernt ist.
- Lassen Sie eine kostenlose Erkundung für 20 min und messen Sie manuell die Zeit, die für die Erkundung beider Objekte aufgewendet wurde, mit zwei Stoppfeldern. Sobald die Maus die minimale Erkundungszeit (30 s) für beide Objekte erreicht hat, stoppen Sie die F1-Sitzung und übertragen Sie das Tier in seinen Heimischenkäfig. Wenn die Maus die Objekte für 30 s innerhalb von 20 min nicht erkunden kann, entfernen Sie die Maus aus dem geöffneten Feldfeld und schließen Sie sie aus weiteren Sitzungen aus.
- Nachdem das Tier aus dem offenen Feldkasten entfernt wurde, reinigen Sie den Boden und die Wände der Box gründlich mit 70% Ethanolspray und wischen Sie sie mit einem Papiertuch ab.
HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen.
- Führen Sie am 5. Tag die NL-Testsitzung durch.
- Übertragen Sie die Maus von ihrem Hauskäfig auf den offenen Feldbereich für die Reha für 3 min. Dann bringen Sie das Tier in seinen heimischen Käfig zurück.
- Während der Gewöhnung die Objekte mit 70% Ethanol gründlich reinigen und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
- Bewegen Sie ein Objekt (Gummipuppe, Objekt A) in die diagonale Position, 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Fixieren Sie das Objekt mit doppelseitigem Klebeband. Übertragen Sie die Versuchsmaus auf ihrem Käfigdeckel auf den offenen Feldbereich und platzieren Sie sie mit Blick auf die Wand des offenen Feldkastens.
HINWEIS: Gegengewicht zur Position des Objekts, das verschoben wurde, um die potenzielle angeborene Präferenz für eine bestimmte Richtung zu reduzieren. Ändern Sie z. B. die Position des bevorzugten Objekts aus der Einarbeitungssitzung für die Hälfte der Versuchstiere, und verschieben Sie für den Rest der Tiere das weniger bevorzugte Objekt aus der Einarbeitungssitzung. - Erlauben Sie 10 min kostenlose Erkundung und Aufnahme mit einem Video-Tracking-System. Messen Sie die Zeit, die für die Erkundung jedes Objekts aufgewendet wird, mit zwei Stoppfeldern und berechnen Sie das
HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen. - Schnappen Sie sich den Schwanz der Versuchsmaus und legen Sie ihn auf den Käfigdeckel, um ihn in den heimischen Käfig zu bringen. 3 Tage lang (Tage 6–8) lassen Sie die Maus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser ruhen.
- Sobald das Tier aus dem offenen Feldkasten entfernt wird, reinigen Sie den Boden und die Wände der Box gründlich mit 70% Ethanolspray und wischen Sie es mit einem Papiertuch ab.
2. Neuartiger Objekterkennungstest (NO)
- Führen Sie am 9. Tag eine 15-min-Gewöhnungssitzung durch, indem Sie die Schritte 1.2–1.7 wiederholen.
- Führen Sie am 10. Tag die Einarbeitungssitzung (F1) durch.
- Legen Sie die Maus bei leichtem Licht 3 min in das leere offene Feld. Nach der Rehabilitierung der Maus in den offenen Feldbereich, vorübergehend zurück in seinen heimischen Käfig.
- Während der Gewöhnung die Objekte mit 70% Ethanol gründlich reinigen und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
- Legen Sie zwei identische Objekte (50 ml Kunststoffrohre gefüllt mit 40 ml Wasser, Objekt B) in das offene Feld 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Befestigen Sie die Objekte mit doppelseitigem Klebeband. Führen Sie die experimentelle Maus in den offenen Feldkasten ein, der der Wand am weitesten von den Objekten zugewandt ist.
- Da das Tier den beiden verschiedenen Objekten (50 ml Kunststoffrohr gefüllt mit 40 ml Wasser, Objekt B; Glas Coplin Glas, Objekt C) im NO-Test ausgesetzt ist, wird das Objekt während der F1-Sitzung ausgeglichen. Stellen Sie beispielsweise zwei identische Objekte (Glas-Coplin-Gläser, Objekt C) für die Hälfte der Tiere in der Gruppe dar.
- Lassen Sie eine kostenlose Erkundung für 20 min und messen Sie manuell die Zeit, die für die Erkundung beider Objekte aufgewendet wurde, mit zwei Stoppfeldern. Sobald die Maus die minimale Erkundungszeit (30 s) für beide Objekte erreicht hat, stoppen Sie die F1-Sitzung und übertragen Sie das Tier in seinen Heimischenkäfig. Wenn die Maus die Objekte für 30 s innerhalb von 20 min nicht untersuchen kann, entfernen Sie sie aus dem geöffneten Feldfeld und schließen Sie sie aus weiteren Sitzungen aus.
- Nachdem das Tier aus dem offenen Feldkasten entfernt wurde, reinigen Sie den Boden und die Wände der Box gründlich mit 70% Ethanolspray und wischen Sie sie mit einem Papiertuch ab.
HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen.
- Führen Sie am nächsten Tag (Tag 11) die NO-Testsitzung durch.
- Übertragen Sie die Maus von ihrem Hauskäfig auf das offene Feld für 3 min, und bringen Sie das Tier dann in seinen Hauskäfig zurück.
- Während der Gewöhnung die Objekte mit 70% Ethanol gründlich reinigen und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
- Ersetzen Sie ein Objekt (50 ml Kunststoffrohr gefüllt mit 40 ml Wasser, Objekt B) durch ein anderes Objekt (Glas Coplin Glas, Objekt C) 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Befestigen Sie die Objekte mit doppelseitigem Klebeband. Übertragen Sie die experimentelle Maus auf den Käfigdeckel auf das offene Feld, und platzieren Sie sie mit Blick auf die Wand. Gegengewicht zu den Objekten, die während des NO-Tests zusammen dargestellt werden. Ersetzen Sie beispielsweise ein Glas-Coplin-Glas (Objekt C) durch ein 50 ml Kunststoffrohr, das mit 40 ml Wasser (Objekt B) für die Mäuse gefüllt ist, die während der Einarbeitungssitzung den beiden Coplin-Gläsern (Objekt C) ausgesetzt sind.
HINWEIS: Ein Gegengewicht zur Position des ersetzten Objekts kann auch durchgeführt werden, um die potentielle angeborene Präferenz für eine bestimmte Richtung zu reduzieren. Ändern Sie z. B. für jede Kohorte der Tiere, die dem Satz von zwei Objekten (Objekt B oder Objekt C) ausgesetzt sind, das bevorzugte Objekt in der Einarbeitungssitzung für die Hälfte der Versuchstiere, und ersetzen Sie für den Rest der Tiere das Objekt, das in der Einarbeitungssitzung weniger bevorzugt wird. - Erlauben Sie 10 min kostenlose Erkundung und zeichnen Sie es mit einem Video-Tracking-System auf. Messen Sie die Zeit, die für die Erkundung jedes Objekts aufgewendet wird, mithilfe von zwei Stoppfeldern, und berechnen Sie das Diskriminierungsverhältnis.
HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen. - Schnappen Sie sich den Schwanz der Versuchsmaus und legen Sie ihn auf den Käfigdeckel, um ihn in den heimischen Käfig zu bringen. 3 Tage lang (Tage 12–14) lassen Sie die Maus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser ruhen.
- Sobald das Tier aus dem offenen Feldkasten entfernt wird, reinigen Sie den Boden und die Wände der offenen Feldbox gründlich mit 70% Ethanolspray und wischen Sie es mit einem Papiertuch ab.
3. Mustertrenntest (PS)
- Führen Sie am 15. Tag die erste Einarbeitungssitzung (F1) für den PS-Test durch.
- Übertragen Sie die Maus von ihrem Hauskäfig auf den offenen Feldbereich für 3 min, und kehren Sie sie dann in ihren Hauskäfig zurück.
- Während der Gewöhnung die Objekte und die gegitterte Bodenplatte mit 70% Ethanol gründlich reinigen und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
- Legen Sie die Bodenplatte (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) mit dem breiten Gitter (5,5 x 5,5 cm) in den offenen Feldkasten und platzieren Sie zwei identische Objekte (Kunststoff-T-Flaschen gefüllt mit 50 ml Wasser, Objekt D) im offenen Feld 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Befestigen Sie die Objekte mit doppelseitigem Klebeband. Führen Sie die experimentelle Maus in den offenen Feldkasten ein, der der Wand am weitesten von den Objekten zugewandt ist.
- Da das Tier im PS-Test zwei verschiedenen Gegenständen ausgesetzt ist (Kunststoff-T-Flasche, gefüllt mit 50 ml Wasser, Objekt D; Glasflasche, Objekt E), wird das Objekt während der F1- und F2-Sitzungen ausgeglichen. Stellen Sie beispielsweise zwei identische Objekte (Glasflaschen, Objekt E) auf dem breiten Gitterboden für die Hälfte der Tiere in der Gruppe dar.
- Lassen Sie eine kostenlose Erkundung für 20 min zu, und messen Sie manuell die Zeit, die für die Erkundung beider Objekte aufgewendet wird, indem Sie zwei Stoppfelder verwenden. Sobald die Maus die minimale Explorationszeit (30 s) für beide Objekte erreicht hat, stoppen Sie die F1-Sitzung und übertragen Sie das Tier in seinen Heimischenkäfig. Wenn die Maus die Objekte für 30 s innerhalb von 20 min nicht untersuchen kann, entfernen Sie sie aus dem geöffneten Feldfeld und schließen Sie sie aus weiteren Sitzungen aus.
HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen. - Nach Abschluss der ersten Einarbeitungssitzung (F1) die Objekte und die Bodenplatte gründlich mit 70% Ethanolspray reinigen und aus dem offenen Feldkasten entfernen.
- Führen Sie am nächsten Tag (Tag 16) die zweite Einarbeitungssitzung (F2) für den PS-Test durch.
- Übertragen Sie die Maus von ihrem Hauskäfig auf den offenen Feldbereich für 3 min, und bringen Sie das Tier dann in seinen Hauskäfig zurück.
- Während der Gewöhnung die Objekte gründlich reinigen und bodenplatte mit 70% Ethanol gittern und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
- Legen Sie die Bodenplatte (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) mit dem schmalen Gitter (2,75 x 2,75 cm) in den offenen Feldkasten und platzieren Sie zwei identische Objekte (Glasflaschen, Objekt E) im offenen Feld 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Befestigen Sie die Objekte mit doppelseitigem Klebeband. Führen Sie die experimentelle Maus in den offenen Feldkasten ein, der der Wand am weitesten von den Objekten zugewandt ist.
- Zum Ausgleich stellen Sie zwei identische Objekte (Kunststoff-T-Flaschen, gefüllt mit 50 ml Wasser, Objekt D) auf dem schmalen Gitterboden vor.
- Lassen Sie eine kostenlose Erkundung für 20 min und messen Sie manuell die Zeit, die für die Erkundung beider Objekte aufgewendet wurde, mit zwei Stoppfeldern. Sobald die Maus die minimale Explorationszeit (30 s) für beide Objekte erreicht hat, stoppen Sie die F2-Sitzung und übertragen Sie das Tier in seinen Heimischenkäfig. Wenn die Maus die Objekte für 30 s innerhalb von 20 min nicht untersuchen kann, entfernen Sie sie aus dem geöffneten Feldfeld und schließen Sie sie aus weiteren Sitzungen aus.
HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen. - Nach Abschluss der zweiten Einarbeitungssitzung (F2) die Objekte und die Bodenplatte gründlich mit 70% Ethanolspray reinigen und aus dem offenen Feldkasten entfernen.
- Führen Sie am nächsten Tag (Tag 17) die PS-Testsitzung durch.
- Übertragen Sie die Maus von ihrem Hauskäfig auf den offenen Feldbereich für 3 min, und kehren Sie sie dann in ihren Hauskäfig zurück.
- Während der Gewöhnung die Objekte gründlich reinigen und bodenplatte mit 70% Ethanol gittern und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
- Legen Sie die Bodenplatte mit dem schmalen Gitter (2,75 x 2,75 cm) in den offenen Feldkasten und legen Sie zwei verschiedene Objekte (Kunststoff-T-Flasche gefüllt mit 50 ml Wasser, Objekt D; Glasflasche, Objekt E) auf die Bodenplatte 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Befestigen Sie die Objekte mit doppelseitigem Klebeband. Übertragen Sie die experimentelle Maus auf den Käfigdeckel auf den offenen Feldbereich und platzieren Sie sie mit Blick auf die Wand.
- Gegengewicht zu den Objekten, die während des PS-Tests zusammen präsentiert wurden. Platzieren Sie z. B. jedes Objekt (Objekt D, Objekt E) auf dem schmalen Rasterboden, um das Objekt E in diesem Kontext zu einem neuartigen Objekt zu machen. Ein Gegengewicht zur Position von Objekt D oder Objekt E (ein neuartiges Objekt auf dem schmalen Bodenmuster) kann ebenfalls durchgeführt werden, um das Potenzial für eine angeborene Präferenz für eine bestimmte Richtung zu verringern. Ersetzen Sie beispielsweise das bevorzugte Objekt aus der zweiten Einarbeitungssitzung für die Hälfte der Versuchstiere, und ersetzen Sie für die übrigen Tiere das weniger bevorzugte Objekt aus der zweiten Einarbeitungssitzung.
- Erlauben Sie 10 min kostenlose Erkundung und Aufzeichnung mit einem Video-Tracking-System. Messen Sie die Zeit, die für die Erkundung jedes Objekts aufgewendet wird, mithilfe von zwei Stoppfeldern, und berechnen Sie das Diskriminierungsverhältnis.
HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen. - Schnappen Sie sich den Schwanz der Versuchsmaus und legen Sie ihn auf den Käfigdeckel, um ihn in den heimischen Käfig zu bringen.
4. Cresyl violette Färbung
- Nach Abschluss aller Verhaltenstests das Tier durch Injektion eines Cocktails (4:0,5) Ketamin (50 mg/ml) und Xylazin (23,3 mg/ml) in Saline in einer Dosis von 110 ml/kg Körpergewicht (IP; 1 ml Spritze; 26 G Nadel) gelöst. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen einer Antwort auf eine Zehenklemme.
- Sobald das Tier tief anästhesiert ist, führen Sie transkardiale Perfusion mit 4% Paraformaldehyd durch, um das Gehirn zu fixieren15.
- Nachdem die transkardiale Perfusion abgeschlossen ist, enthaupten Sie das Tier mit einer Schere15. Entfernen Sie dann den Schädel mit einer Irisschere, um das Gehirn freizulegen. Nachdem das Gehirn isoliert ist, postfixieren Sie es in 4% Paraformaldehyd über Nacht, gefolgt von Kryoschutz in 30% Saccharose in 0,01 M phosphatgepufferter Salin.
- Machen Sie koronale Abschnitte (30 m) aus dem snap-frozen Gehirn mit einem Kryostat.
- Montieren Sie das Hirngewebe auf Dias und führen Sie eine Reihe von Hydratationsschritten von 100% Ethanol zu Leitungswasser durch, indem Sie 3 min sequenziell in 100%, 95%, 90%, 80%, 70% Ethanol waschen.
- Inkubieren Sie das Gewebe in 0,1% Kresylviolettlösung für 15 min.
- Entfernen Sie übermäßige Flecken, indem Sie die Geweberutschen in 95% Ethanol/0,1% Eisessigsäure eintauchen, und dehydrieren Sie dann das Gewebe mit Lösungen von 100% Ethanol, 50% Ethanol/50% Xylol und 100% Xylol.
- Die Gewebeschlitten mit einem handelsüblichen Xylol-Montagemedium abdecken.
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Representative Results
Abbildung 1zeigt einen allgemeinen Versuchsplan und ein allgemeines Setup für die Bewertung der kognitiven Funktion. Sechs Wochen nach der Einführung von pilocarpine-induzierten akuten Anfällen wurden Mäuse den NL-, NO- und PS-Tests in dieser Reihenfolge unterzogen, die durch 3 Tage Ruhezeiten zwischen den Tests getrennt waren (Abbildung 1A). Für den NL-Test wurden während der Einarbeitungssitzung (F1) zwei identische Objekte im offenen Feld platziert, und am nächsten Tag wurde ein Objekt an eine neue Position verschoben. Im NO-Test wurde während der Testsitzung ein Objekt durch ein neues ersetzt. Für den PS-Test führten die beiden Einarbeitungssitzungen (F1, F2) Kombinationen verschiedener Bodenrastermuster und Objekte ein. Am Testtag wurde dann ein Objekt aus jeder Einarbeitungssitzung auf das schmale Rasterbodenmuster gesetzt, wodurch ein Objekt im Kontext des schmalen Rasterbodenmusters neu geschrieben wurde (Abbildung 1B). Die offene Feldbox kann direkt unter einer aufgeladenen Gerätekamera auf einem Schreibtisch platziert und von einem schwarzen Vorhang umgeben werden, um unnötige visuelle Hinweise zu vermeiden (Abbildung 2A). Die Probenobjekte waren leicht zu reinigende Materialien ähnlicher Größe oder etwas größer als eine Maus (Abbildung 2B). Die Objektkombinationen mussten vorab abgeschirmt werden, um zu bestätigen, dass zwischen den beiden zusammen dargestellten Objekten keine signifikante Präferenz vorhanden war (Abbildung 2C). Die Bodenplatten mit unterschiedlichen Mustern wurden in den offenen Feldkasten gelegt, um zusätzliche experimentelle Hinweise im PS-Test zu liefern (Abbildung 2B). Sobald eine Maus in das offene Feldfeld eingeführt wurde, verfolgte ein Video-Tracking-System seine Flugbahn, um seine gesamte Fortbewegungsentfernung zu analysieren (Abbildung 2D). Sechs Wochen nach einer Pilokarin-Injektion zeigten die epileptischen Mäuse im NL-Test eine signifikante Verringerung des Diskriminierungsverhältnisses, was eine Beeinträchtigung des räumlichen Gedächtnisses zeigte (Abbildung 3). Darüber hinaus zeigten epileptische Mäuse im NO-Test, einem Test für das Objekterkennungsgedächtnis, eine eingeschränkte Gedächtnisfunktion im Vergleich zu Scheinkontrollen. Als die neuronale Funktion des Neugeborenen mit dem PS-Test bewertet wurde, hatten die epileptischen Mäuse Schwierigkeiten, das neuartige Objekt in einem Kontext mit mehreren Cues zu erkennen. Als Kontrollexperimente wurden die Motoraktivität und die Latenz zur Erreichung der Explorationskriterien während der Einarbeitungssitzung bewertet (Abbildung 3). Die Messung der motorischen Aktivität zeigte einen signifikanten Anstieg bei epileptischen Tieren(Abbildung 3C), im Einklang mit früheren Berichten16,17, während die Motivation, die Objekte zu erforschen, zwischen Schein- und epileptischen Tieren vergleichbar war (Abbildung 3D). Unsere Abbrecherquoten, die die Explorationskriterien in der Einarbeitungssitzung nicht erfüllten, lagen bei 17,4 %, 18,2 %, 0 % für den NL-, NO- und PS-Test, was darauf hindeutet, dass sich die Tiere während der Reihe von Verhaltensversuchen an die experimentellen Umgebungen gewöhnt haben. Schließlich bewerteten wir den Tod von Hippocampus-Zellen nach pilocarpin-induziertem Status epilepticus mit Cresylviolettfärbung, um anfallinduzierte neuronale Schäden zu bestätigen (Abbildung 4). Die mit Pilokarin behandelten Tiere zeigten im Gegensatz zu den Scheinkontrollen pyknotische Zellen im Hilus und im CA3-Unterfeld des Hippocampus (Abbildung 4).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Verhaltenstestbatterie. (A) Eine schematische Zeichnung des Verhaltensplans für die neue Objektposition (NL), neuartige Objekterkennung (NO) und Mustertrennungstests (PS) für Schein- und Epileptikermäuse. (B) Repräsentative Bilder der Objekt- und Bodenplattenanordnungen für die NL-, NO- und PS-Tests. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Verhaltensapparat zur Bewertung der kognitiven Funktion. (A) Eine allgemeine Übersicht über die Verhaltenseinstellung. Eine Kamera wurde direkt über dem offenen Feldkasten platziert, der vom Vorhang umgeben war, um unnötige Hinweise zu vermeiden. (B) Beispielobjekte für den neuartigen Objektort (NL), den Test zur neuartigen Objekterkennung (NO) und mustertrennung (PS). Für den PS-Test wurde eine Bodenplatte mit unterschiedlichen Mustern, d.h. breiten und schmalen Gittern, in den offenen Feldkasten eingesetzt, um zusätzliche Hinweise zu liefern. (C) Diagramme, die die Zeit zeigen, in der jedes Objekt zusammen während der NO- und PS-Testsitzung (n = 7) untersucht wird. Beachten Sie, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Präferenz zwischen den beiden Objekten gab, die durch den Mann-Whitney U-Test (für NO-Test) bewertet wurden, und dem ungepaarten t-Test des Schülers (für PS-Test). (D) Ein Bild, das zeigt, dass ein Video-Tracking-System die experimentelle Maus im offenen Feldfeld erkannt hat. Das rote Quadrat zeigt die voreingestellte Zone zum Verfolgen der Flugbahn der Maus an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beeinträchtigtes räumliches Gedächtnis und Mustertrennung bei epileptischen Mäusen. (A) Eine schematische Darstellung der neuartigen Objektposition (NL), der Neuartigen Objekterkennung (NO) und der Mustertrennungstests (PS). Ein neuartiges Objekt wird als roter Kreis angezeigt. (B) Schaubilder, die das Diskriminierungsverhältnis in den NL-, NO- und PS-Tests zwischen Schein-(n = 8) und epileptischen Mäusen (n = 10) zeigen. Beachten Sie, dass die epileptischen Mäuse signifikante Beeinträchtigungen in den NL-, NO- und PS-Tests zeigten, die die Speicherfunktion für Orte, Objekte und Kontexte testen. *p < 0.05 von Mann-Whitney U Test für den NL-Test. *p < 0.05 durch den ungepaarten t-Test des Schülers für die NO-Tests. *p < 0.05 von Student es unpaired t-test mit Welchs Korrektur für den PS-Test. (C) Ein Diagramm, das die motorische Aktivität von Scheinmäusen (n = 8) und epileptischen Mäusen (n = 10) zeigt. Beachten Sie, dass die epileptischen Mäuse eine erhöhte Fortbewegung zeigten, im Einklang mit früheren Berichten. *p < 0.05 durch den ungepaarten t-Test des Schülers. (D) Diagramme, die die Latenz nach 30 s-Kriterien in der Einarbeitungssitzung der NL-, NO- und PS-Tests zeigen. Beachten Sie, dass es keine Unterschiede in der Motivation für die Erforschung der Objekte zwischen Schein (n = 8) und epileptischen Mäusen (n = 10) gab. Die Daten werden als mittlerer Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. SE = Status epilepticus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Neuronaler Tod im Hippocampus nach Pilocarpin-induziertem Status epilepticus (SE). Repräsentative Bilder aus den (A) Schein- und (B) epileptischen Gruppen 58 Tage nach der Pilapinin-Injektion. Vergrößerte Bilder zeigen den Hilus (a, d), CA1 Unterfeld (b, e) und CA3 Unterfeld (c, f) des Hippocampus, die als weiße Quadrate in den Bildern mit geringer Vergrößerung angezeigt werden. Beachten Sie die pyknotischen Zellen im Hilus- und CA3-Unterfeld des Hippocampus. Maßstabsleiste im linksextremen Bild = 200 m, auch gültig für das untere Bild; Skalenbalken in a, b, c = 40 'm, auch gültig für d, e, f, bzw. . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Arbeit beschreibt experimentelle Verfahren zur Bewertung der kognitiven Funktion bei Mäusen mit chronischer Epilepsie. Viele verschiedene Verhaltenstestparadigmen werden verwendet, um Lern- und Gedächtnisfunktionen bei Mäusen18zu bewerten. Das Morris-Wasserlabyrinth, das Radialarmlabyrinth, das Y-Labyrinth, die kontextbezogene Angstkonditionierung und objektbasierte Tests sind die am häufigsten verwendeten Verhaltenstests und liefern zuverlässige Ergebnisse. Unter ihnen sind die NL-, NO- und PS-Tests effiziente, einfache Methoden zur Bewertung von Lernen und Gedächtnis bei epileptischen Mäusen8,10. Da epileptische Mäuse unerwartete spontane Anfälle während Verhaltenssitzungen haben können, ist es besser, Verhaltenstests zu verwenden, die auf der natürlichen Neigung der Tiere basieren, Neuheitzuforschungen zu erforschen, ohne andere positive oder negative Verstärkungen hinzuzufügen, wie sie bei aversiv motivierten Aufgaben wie Angstkonditionierung, leichtem Hungertod oder gezwungenem Schwimmen verwendet werden, um über Wasser zu bleiben, was wiederkehrende Anfälle auslösen kann19,20. Darüber hinaus sind die neuartigen Tests im Vergleich zu anderen Verhaltenstests für die Tiere weniger belastend, da keine umfangreichen Trainingseinheiten erforderlich sind. Darüber hinaus können die neuartigen Verhaltenstests leicht geändert werden, um verschiedene Arten von Speicher (z. B. räumliches Gedächtnis, Erkennungsgedächtnis oder episodisches Gedächtnis) zu bewerten, indem einfach die Objektposition geändert, ein neues Objekt präsentiert oder zusätzliche Reize kombiniert werden. Zusammengenommen haben neuartige Tests wie NL-, NO- und PS-Tests vielseitige Vorteile für die Bewertung kognitiver Funktionen bei epileptischen Mäusen.
Obwohl die NL-, NO- und PS-Tests schnelle und nützliche experimentelle Modelle zur Untersuchung der Lern- und Gedächtnisfunktion bei epileptischen Mäusen sind, müssen bei der Verwendung mehrere Faktoren berücksichtigt werden. Es ist bekannt, dass chronische epileptische Mäuse erhöhte Angst durch Pilopine-Injektionen zeigen7, was zu einer deutlichen Abnahme der Objektexploration während der Eingewöhnungssitzungen führt. Dieser Mangel an Exploration kann zu einer Fehlinterpretation der Testergebnisse führen. Daher ist es wichtig, genügend Gewöhnung in das offene Feld aufzunehmen, damit sich die Mäuse vor der Eingewöhnungssitzung an die Umgebung gewöhnen können. Je nach Belastung können die Mäuse die Objekte für 30 s innerhalb von 20 min der Eingewöhnungssitzung noch nicht erforschen, selbst nach 3 Trainingseinheiten. In diesem Fall könnte das Hinzufügen einer weiteren Gewöhnungssitzung mit zusätzlichen Paaren der Objekte im offenen Feldfeld dazu beitragen, die Angst der Maus gegenüber den Objekten zu reduzieren. Vorhänge, die den offenen Feldkasten umgeben, können externe Raumhinweise minimieren, sodass sich die Versuchsmäuse auf die Objekte im offenen Feld konzentrieren können. Darüber hinaus sollten die Explorationskriterien streng genug sein, um Verhaltensweisen auszuschließen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen. Schließlich, obwohl es sehr selten sein kann, können Anfallsereignisse während der Verhaltensaufgaben auftreten. In diesem Fall wird empfohlen, diese Tiere aus weiteren Bewertungen zu entfernen, da dies eine mögliche Quelle verwirrender Verzerrungen für die Auswertung der Speicherfunktion sein kann.
Da die NL-, NO- und PS-Tests sehr empfindliche Experimente sind, die sich auf die natürliche Neugier der Tiere auf neue Reize stützen, können subtile Veränderungen das explorative Verhalten von Mäusen beeinflussen, was zu nicht schlüssigen Diskriminierungsverhältnissen21,22führen kann. Zum Beispiel kann ein harter Umgang mit der Maus, eine Einstreuänderung direkt vor den Verhaltensaufgaben, das inkonsistente Timing des Tests und die unzureichende Akklimatisierung an den Testraum die Belastung der Tiere erhöhen und zu eindeutigen Testergebnissen führen. Darüber hinaus sollten veränderte Testumgebungen, wie inkonsistente Präsentationen asymmetrischer Objekte bei jeder Sitzung, Platzierung von Heimkäfigen in der Nähe der Versuchsarena oder Dasfaktorik des Experimentators, sorgfältig erwogen werden, um zusätzliche Faktoren zu vermeiden. In der Phase der Datenanalyse können Bewertungen durch mehrere Experimentatoren aufgrund unterschiedlicher Kriterien für nagetierexplorative Verhaltensweisen oder Stoppuhr-Nutzungen zu erhöhten Variabilitäten in den Verhaltensergebnissen beitragen. Gemeinsam sollten diese Aspekte auch für die erfolgreiche Umsetzung der NL-, NO- und PS-Tests im Auge behalten werden.
Der Hippocampus und parahippocampal Region sind dafür bekannt, einzigartige Rollen in der Gedächtnisverarbeitung23,24zu spielen. Es ist allgemein anerkannt, dass das räumliche Gedächtnis weitgehend von der Funktion des Hippocampus abhängt, die leicht durch den NL-Test23,24beurteilt werden kann. Auf der anderen Seite scheint das Objekterkennungsgedächtnis mehrere Hirnregionen zu umfassen, einschließlich der perirhinalen Kortex, insularen Kortex und ventromedialen präfrontalen Kortex, zusätzlich zum Hippocampus25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Pilocarpine-behandelte epileptische Mäuse haben konsequent Verhaltensstörungen in räumlichen Gedächtnistests mit umfangreichen hippocampalen neuronalen Schäden39,40,41,42, gezeigt, während Objekterkennungsgedächtnistests kontroverse Ergebnisse hervorgebracht haben, mit variabler neuronaler Degeneration in den parahippocampalen Hirnregionen10,41,42,43,44. Diese Daten implizieren, dass die Objekterkennung möglicherweise ausgeklügelte Netzwerkverbindungen zwischen mehreren Hirnregionen erfordert, im Gegensatz zum räumlichen Gedächtnis, in dem der Hippocampus eine zentrale Rolle spielen kann. Wenn die spezifischen Hippocampus-Unterfelder genau bewertet werden, werden die Gyrusregionen CA1 und CA3/dentate gefunden, um unterschiedliche Informationen zu verarbeiten. Insbesondere wird angenommen, dass CA1-Neuronen durch die Exposition gegenüber ähnlichen Gegenständen aktiviert werden, während CA3 und der Dentate Gyrus an der Unterscheidung ähnlicher Objekte beteiligt sind23,45. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese deuten neue Beweise darauf hin, dass dentate neugeborene Neuronen zur Mustertrennungsleistung beitragen können45,46,47. Angesichts der Tatsache, dass eine aberrante Hippocampus-Neurogenese während der Epileptogenese10induziert werden kann, können epileptische Mäuse eine Leistungseinbußen bei diskriminierenden analogen Erfahrungen aufgrund der gestörten Integration von neugeborenen Neuronen in chronische Epilepsie nachweisen.
Abschließend beschreiben wir, wie Gedächtnisstörungen bei epileptischen Mäusen bewertet werden können. Insbesondere stellen wir experimentelle Protokolle für drei Verhaltenstests bereit, den NL-, NO- und PS-Test, die Speicher für Orte, Objekte und Kontexte testen. Unter den vielen kognitiven Testparadigmen, die für Mäuse verfügbar sind, sind die NL-, NO- und PS-Tests recht einfache, kurze Assays, die die Tiere minimal belasten, was sie optimal für die Bewertung der Gedächtnisfunktion bei epileptischen Tieren macht, ohne wiederkehrende Anfälle auszulösen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Jae-Min Lee für seine technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) Von der koreanischen Regierung finanziert (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Sung-shim | Use with the 26 or 30 gauge needle | |
| 70% Ethanol | Duksan | UN1170 | Spray to clean the box and objects |
| black curtain | For avoiding unnecessary visual cues | ||
| Cresyl violet | Sigma | C5042 | For Cresyl violet staining |
| cryotome | Leica | E21040041 | For tissue sectioning |
| double-sided sticky tape | For the firm placement of the objects | ||
| DPX mounting medium | Sigma | 06522 | |
| ethanol series | Duksan | UN1170 | Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions |
| floor plate with narrow grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm | |
| floor plate with wide grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm | |
| illuminometer | TES Electrical Electronic Corp. | 1334A | For the measurement of the room lighting (60 Lux) |
| Intensive care unit | Thermocare | #W-1 | |
| ketamine hydrochloride | Yuhan | 7003 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| LED lamp | Lungo | P13A-0422-WW-04 | Lighting for the behavioral test room |
| objects | Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle | ||
| open field box | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm | |
| paper towel | Yuhan-Kimberly | 47201 | Use to dry open field box and objects |
| paraformaldehyde | Merck Millipore | 104005 | Make 4% solution |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| ruler | Use to locate the objects in the open field box | ||
| scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Smart system 3.0 | Panlab | Video tracking system | |
| stopwatch | Junso | JS-307 | For the measurement of explorative activities of mice |
| sucrose | Sigma | S9378 | For cryoprotection of tissue sections |
| terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| video camera (CCD camera) | Vision | VCE56HQ-12 | Place the camera directly overhead of the open field box |
| xylazine (Rompun) | Bayer korea | KR10381 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| xylene | Duksan | UN1307 | For Cresyl violet staining |
References
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