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Behavior

पिलोकार्पाइन-प्रेरित मिर्गी चूहों में मेमोरी फंक्शन का आकलन

doi: 10.3791/60751 Published: June 4, 2020

Summary

यह लेख पिलोकार्पाइन-प्रेरित मिर्गी चूहों में स्मृति हानि का आकलन करने के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाएं प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग मिर्गी से जुड़े संज्ञानात्मक गिरावट के रोगोपैथी तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जो मिर्गी में सबसे आम comorbidities में से एक है।

Abstract

संज्ञानात्मक हानि लौकिक पालि मिर्गी में सबसे आम comorbidities में से एक है। मिर्गी के एक पशु मॉडल में मिर्गी से जुड़े संज्ञानात्मक गिरावट को फिर से तैयार करने के लिए, हमने पिलोकार्पाइन-इलाज क्रोनिक मिर्गी चूहों को उत्पन्न किया। हम इन मिर्गी चूहों का उपयोग करके तीन अलग-अलग व्यवहार परीक्षणों के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं: उपन्यास ऑब्जेक्ट स्थान (एनएल), उपन्यास ऑब्जेक्ट रिकग्निशन (नहीं), और पैटर्न पृथक्करण (पीएस) परीक्षण क्रमशः स्थानों, वस्तुओं और संदर्भों के लिए सीखने और स्मृति का मूल्यांकन करने के लिए। हम बताते हैं कि कैसे व्यवहार तंत्र सेट करने के लिए और एनएल, नहीं, और पीएस परीक्षण के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को एक खुले क्षेत्र परीक्षण के बाद प्रदान करते हैं जो जानवरों की बेसल लोकोमोटर गतिविधियों को मापता है। हम मिर्गी चूहों में स्मृति समारोह का आकलन करने के लिए अन्य व्यवहार परीक्षणों के संबंध में एनएल, नो और पीएस परीक्षणों के तकनीकी फायदों का भी वर्णन करते हैं। अंत में, हम मिर्गी चूहों के लिए संभावित कारणों और समाधानों पर चर्चा करते हैं जो परिचित सत्रों के दौरान वस्तुओं के साथ 30 एस अच्छा संपर्क बनाने में विफल रहे हैं, जो सफल स्मृति परीक्षणों के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल चूहों का उपयोग करके मिर्गी से जुड़ी स्मृति हानि का आकलन करने के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है। एनएल, नहीं, और पीएस परीक्षण सरल, कुशल परख है कि मिर्गी चूहों में स्मृति के विभिन्न प्रकार के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त हैं।

Introduction

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मिर्गी एक पुरानी विकार है जो सहज आवर्ती दौरे1,2,3की विशेषता है । क्योंकि दोहराव बरामदगी मस्तिष्क में संरचनात्मक और कार्यात्मक असामान्यताओं का कारण बन सकता है1,,2,,3,असामान्य जब्ती गतिविधि संज्ञानात्मक रोग में योगदान कर सकती है, जो सबसे आम मिर्गी से जुड़े कोऑर्बिडिटीज4,,5,,6में से एक है। पुरानी जब्ती की घटनाओं के विपरीत, जो क्षणिक और क्षणिक हैं, संज्ञानात्मक हानि मिर्गी के रोगियों के जीवन भर में बनी रह सकती है, जिससे उनके जीवन की गुणवत्ता बिगड़ती जा रही है । इसलिए, मिर्गी से जुड़े संज्ञानात्मक गिरावट के पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र को समझना महत्वपूर्ण है।

मिर्गी के विभिन्न प्रायोगिक पशु मॉडलों का उपयोग क्रोनिक मिर्गी7,8,,9,,10,,11,12से जुड़े सीखने और स्मृति घाटे को प्रदर्शित करने के लिए किया गया है । उदाहरण के लिए, मॉरिस पानी भूलभुलैया, प्रासंगिक भय कंडीशनिंग, छेद बोर्ड, उपन्यास वस्तु स्थान (एनएल), और उपन्यास वस्तु मांयता (नहीं) परीक्षण अक्सर लौकिक पालि मिर्गी (TLE) में स्मृति रोग का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । क्योंकि हिप्पोकैम्पस प्राथमिक क्षेत्रों में से एक है जिसमें TLE पैथोलॉजी दिखाता है, व्यवहार परीक्षण जो हिप्पोकैम्पस-निर्भर स्मृति समारोह का मूल्यांकन कर सकते हैं, अक्सर अधिमानतः चयनित होते हैं। हालांकि, यह देखते हुए कि दौरे एग्क्रांत हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस को प्रेरित कर सकते हैं और मिर्गी से जुड़े संज्ञानात्मक गिरावट10में योगदान कर सकते हैं, नवजात न्यूरोनल फ़ंक्शन (यानी, स्थानिक पैटर्न जुदाई, पीएस)8,,13 के परीक्षण के लिए व्यवहार के प्रतिमान मिर्गी में स्मृति हानि के सेलुलर तंत्र के बारे में मूल्यवान जानकारी भी प्रदान कर सकते हैं।

इस लेख में, हम मिर्गी चूहों के लिए स्मृति परीक्षण, एनएल, नो और पीएस की बैटरी प्रदर्शित करते हैं। परीक्षण सरल और आसानी से सुलभ हैं और एक परिष्कृत प्रणाली की आवश्यकता नहीं है।

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Protocol

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सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को कोरिया के कैथोलिक विश्वविद्यालय की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH प्रकाशन संख्या 80-23) के अनुसार किया गया था ।

1. उपन्यास वस्तु स्थान परीक्षण (एनएल)

  1. पिलोकार्पाइन इंजेक्शन के 4-6 सप्ताह बाद मिर्गी C57BL/6 या ट्रांसजेनिक चूहों को तैयार करें।
    नोट: तीव्र बरामदगी इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) पिलोकार्पाइन इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था, हमारी पिछली रिपोर्ट14में विस्तृत प्रोटोकॉल का पालन ।
  2. व्यवहार परीक्षण शुरू होने से एक दिन पहले प्रजनन कक्ष से मिर्गी के चूहों को व्यवहार कक्ष में स्थानांतरित करें। चूहों को रात भर कम से कम 12 घंटे तक आदत बनाने की अनुमति दें।
  3. व्यवहार कक्ष में, एकल आवास के लिए नए पिंजरों में व्यक्तिगत चूहों को अलग करें। पिंजरे कार्ड पर प्रत्येक जानवर के लिए जानकारी लिखें और व्यवहार परीक्षण के दौरान एक ही पिंजरों में जानवरों को रखें। एक गाड़ी का उपयोग करके कई पिंजरों को एक साथ स्थानांतरित किया जा सकता है।
  4. अगले दिन सुबह 3 दिन के आदतन सत्र (एच1-एच3) की शुरुआत करें। जानवरों को कम से कम 30 मिन के लिए अपने घर पिंजरों में कम रोशनी में acclimate।
  5. 44 x 44 x 31 सेमी और 43 x 43 x 30.5 सेमी के अंदर आयामों के बाहरी आयामों के साथ एक खुला मैदान बॉक्स तैयार करें। आदत (H1) के दिन 1 पर, खुले क्षेत्र बॉक्स के केंद्र में एक इलामिनोमीटर रखें और इलमिनेंस को 60 लक्स में समायोजित करें।
  6. 70% इथेनॉल के साथ खुले क्षेत्र बॉक्स की मंजिल और दीवारों को स्प्रे करें और संभावित घ्राण संकेतों को हटाने के लिए एक साफ कागज तौलिया के साथ पोंछें। फिर कम से कम 1 मिन का इंतजार तब तक करें जब तक कि अवशिष्ट शराब पूरी तरह सूख न जाए।
  7. एक खुले क्षेत्र परीक्षण प्रदर्शन करके प्रत्येक माउस की लोकोमोटर गतिविधि का मूल्यांकन करें।
    1. प्रत्येक प्रयोगात्मक माउस के व्यवहार को रिकॉर्ड और ट्रैक करने के लिए, पशु व्यवहार वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. एक बार वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर खोलने के बाद, खुले क्षेत्र बॉक्स के आकार को कैलिब्रेट करें। इसके बाद ट्रैकिंग के लिए जोन सेट करें। एक प्रयोगकर्ता के हाथों पर नज़र रखने से बचने के लिए विलंबता के 3 एस और अधिग्रहण समय के 15 min सेट करें। प्रत्येक प्रयोगात्मक माउस (समूह, लिंग, आयु, आदि) के बारे में जानकारी डालें।
    3. फिर, धीरे-धीरे दीवार का सामना कर रहे खुले मैदान बॉक्स में एक प्रयोगात्मक माउस रखें। हैंडलिंग से जुड़े तनाव और चिंता को कम करने के लिए इसे पिंजरे के ढक्कन पर रखकर ऐसा करें। फिर, खुले मैदान बॉक्स की दीवार के पास माउस को छोड़ें जो सबसे दूर है जहां से वस्तुएं परिचय सत्र (चरण 1.9.3)।
      नोट: एक बार माउस ओपन फील्ड बॉक्स में है, माउस ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से इसका पता लगा लेगा और रिकॉर्डिंग शुरू कर देगा। अन्वेषण की इष्टतम ट्रैकिंग के लिए, कैमरे को सीधे खुले क्षेत्र बॉक्स के ऊपर रखा जा सकता है।
    4. रिकॉर्डिंग के 15 min के बाद जानवर को पिंजरे के ढक्कन पर रखकर अपने घर के पिंजरे में वापस कर दें। 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ खुले क्षेत्र बॉक्स को साफ करें और परीक्षणों के बीच एक साफ कागज तौलिया के साथ पोंछें। उज्ज्वल प्रकाश को बहाल करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके जानवर की कुल दूरी को मापें।
      1. वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर और वीडियो क्लिप खोलें। फिर, ओपन फील्ड बॉक्स आकार के अंशांकन के आधार पर स्थानांतरित कुल दूरी की गणना करने के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें।
  8. दिन 2 और 3 दिन, 1.3 से 1.7 कदम दोहराकर आदतन सत्र (एच 2, एच 3) करें।
  9. 4 दिन, परिचय सत्र (F1) प्रदर्शन करें।
    1. मंद रोशनी में प्रत्येक माउस को 3 मिन के लिए खाली खुले मैदान में रखें। उस संक्षिप्त पुनर्वास के बाद, जानवर को अपने घर के पिंजरे में वापस कर दें।
    2. आदत के दौरान, 70% इथेनॉल के साथ वस्तुओं को अच्छी तरह से साफ करें और उन्हें पेपर तौलिया के साथ मिटा दें। अवशिष्ट शराब पूरी तरह से सूखने के लिए कम से कम 1 मिन का इंतजार करें।
    3. आसपास की दीवारों से 5 सेमी दूर खुले मैदान के मैदान में दो समान वस्तुओं (रबर गुड़िया, वस्तु ए) रखें। वस्तुओं को दो तरफा टेप से ठीक करें। वस्तुओं से दीवार का सामना करते हुए, खुले मैदान बॉक्स में प्रयोगात्मक माउस पेश करें।
    4. 20 सीन के लिए मुफ्त अन्वेषण की अनुमति दें और मैन्युअल रूप से दो स्टॉपवॉच का उपयोग करके दोनों वस्तुओं की खोज करने में बिताए गए समय को मापें। एक बार माउस दोनों वस्तुओं के लिए न्यूनतम अन्वेषण समय (30 एस) तक पहुंच जाता है, तो F1 सत्र को रोकें और जानवर को अपने घर के पिंजरे में स्थानांतरित करें। यदि माउस 20 मिनट के भीतर 30 एस के लिए वस्तुओं का पता लगाने में विफल रहता है, तो माउस को खुले मैदान बॉक्स से हटा दें और इसे आगे के सत्रों से बाहर करें।
    5. जानवर को खुले मैदान के बक्से से हटाने के बाद, 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ बॉक्स की फर्श और दीवारों को अच्छी तरह से साफ करें और उन्हें पेपर तौलिया के साथ मिटा दें।
      नोट: उस समय को मापें जब माउस अपनी मूंछ, स्नाउट या सामने पंजे के साथ वस्तुओं को छूता है। अन्वेषणात्मक समय के रूप में मात्रा न लें किसी भी व्यवहार जिसमें जानवर का स्नाउट वस्तु की ओर इशारा नहीं करता है, जैसे कि वस्तु पर बैठना, वस्तु से गुजरना, या वस्तु की ओर इशारा करते हुए अपने हिंद छोर के साथ आराम करना।
  10. 5 दिन, एनएल परीक्षण सत्र प्रदर्शन करते हैं।
    1. माउस को अपने घर पिंजरे से 3 मिन के लिए पुनर्वासन के लिए खुले क्षेत्र क्षेत्र में स्थानांतरित करें। फिर जानवर को उसके घर पिंजरे में लौटा दें।
    2. आदत के दौरान, 70% इथेनॉल के साथ वस्तुओं को अच्छी तरह से साफ करें और उन्हें पेपर तौलिया के साथ मिटा दें। अवशिष्ट शराब पूरी तरह से सूखने के लिए कम से कम 1 मिन का इंतजार करें।
    3. एक वस्तु (रबर गुड़िया, वस्तु ए) को विकर्ण स्थिति में ले जाएं, आसपास की दीवारों से 5 सेमी दूर। वस्तु को दो तरफा टेप से ठीक करें। अपने पिंजरे के ढक्कन पर प्रयोगात्मक माउस को खुले मैदान क्षेत्र में स्थानांतरित करें और इसे खुले मैदान बॉक्स की दीवार का सामना करें।
      नोट: एक निश्चित दिशा के लिए किसी भी संभावित जन्मजात वरीयता को कम करने के लिए स्थानांतरित वस्तु के स्थान को प्रतिसंतुलित करें। उदाहरण के लिए, आधे प्रायोगिक जानवरों के लिए परिचित सत्र से पसंदीदा वस्तु का स्थान बदलें, और बाकी जानवरों के लिए, परिचित सत्र से कम पसंदीदा वस्तु को स्थानांतरित करें।
    4. एक वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम के साथ मुफ्त अन्वेषण और रिकॉर्ड के 10 min की अनुमति दें। दो स्टॉपवॉच का उपयोग करके प्रत्येक वस्तु की खोज करने में बिताए गए समय को मापें और भेदभाव अनुपात की गणना करें
      Equation 1
      नोट: उस समय को मापें जब माउस अपनी मूंछ, स्नाउट या सामने पंजे के साथ वस्तुओं को छूता है। अन्वेषणात्मक समय के रूप में मात्रा न लें किसी भी व्यवहार जिसमें जानवर का स्नाउट वस्तु की ओर इशारा नहीं करता है, जैसे कि वस्तु पर बैठना, वस्तु से गुजरना, या वस्तु की ओर इशारा करते हुए अपने हिंद छोर के साथ आराम करना।
    5. प्रयोगात्मक माउस की पूंछ पकड़ो और अपने घर पिंजरे में स्थानांतरित करने के लिए अपने पिंजरे ढक्कन पर जगह है । 3 दिनों (दिन 6-8) के लिए, माउस को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ आराम करने दें।
    6. एक बार जब जानवर को खुले मैदान के बक्से से हटा दिया जाता है, तो 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ बॉक्स की फर्श और दीवारों को अच्छी तरह से साफ करें और एक पेपर तौलिया के साथ मिटा दें।

2. उपन्यास वस्तु मान्यता परीक्षण (नहीं)

  1. 9 दिन, 1.2-1.7 चरणों को दोहराकर 15 मिन आदत सत्र करें।
  2. 10 दिन, परिचय सत्र (F1) प्रदर्शन करते हैं ।
    1. मंद रोशनी में माउस को 3 मिन के लिए खाली खुले मैदान में रखें। खुले क्षेत्र क्षेत्र में माउस को फिर से रखने के बाद, अस्थायी रूप से इसे अपने घर के पिंजरे में वापस कर दें।
    2. आदत के दौरान, 70% इथेनॉल के साथ वस्तुओं को अच्छी तरह से साफ करें और एक पेपर तौलिया के साथ मिटा दें। अवशिष्ट शराब पूरी तरह से सूखने के लिए कम से कम 1 मिन का इंतजार करें।
    3. आसपास की दीवारों से 5 सेमी दूर खुले मैदान में दो समान वस्तुओं (40 मिलीआर पानी, वस्तु बी से भरी 50 मिलीएल प्लास्टिक ट्यूब) रखें। वस्तुओं को दो तरफा टेप से ठीक करें। वस्तुओं से सबसे दूर दीवार का सामना करना पड़ खुले क्षेत्र बॉक्स में प्रयोगात्मक माउस परिचय।
    4. चूंकि जानवर दो अलग-अलग वस्तुओं (50 मिलीआर प्लास्टिक ट्यूब पानी के 40 मिलील, ऑब्जेक्ट बी; ग्लास कोपलिन जार, ऑब्जेक्ट सी) से भरा हुआ है, जैसा कि एफ 1 सत्र के दौरान ऑब्जेक्ट को प्रतिसंतुलित करता है। उदाहरण के लिए, समूह में आधे जानवरों के लिए दो समान वस्तुएं (ग्लास कोप्लिन जार, ऑब्जेक्ट सी) प्रस्तुत करें।
    5. 20 सीन के लिए मुफ्त अन्वेषण की अनुमति दें और मैन्युअल रूप से दो स्टॉपवॉच का उपयोग करके दोनों वस्तुओं की खोज करने में बिताए गए समय को मापें। एक बार माउस दोनों वस्तुओं के लिए न्यूनतम अन्वेषण समय (30 एस) तक पहुंच जाता है, तो F1 सत्र को रोकें और जानवर को अपने घर के पिंजरे में स्थानांतरित करें। यदि माउस 20 मिनट के भीतर 30 एस के लिए वस्तुओं का पता लगाने में विफल रहता है, तो इसे खुले मैदान बॉक्स से हटा दें और इसे आगे के सत्रों से बाहर करें।
    6. जानवर को खुले मैदान के बक्से से हटाने के बाद, 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ बॉक्स की फर्श और दीवारों को अच्छी तरह से साफ करें और उन्हें पेपर तौलिया के साथ मिटा दें।
      नोट: उस समय को मापें जब माउस अपनी मूंछ, स्नाउट या सामने पंजे के साथ वस्तुओं को छूता है। अन्वेषणात्मक समय के रूप में मात्रा न लें किसी भी व्यवहार जिसमें जानवर का स्नाउट वस्तु की ओर इशारा नहीं करता है, जैसे कि वस्तु पर बैठना, वस्तु से गुजरना, या वस्तु की ओर इशारा करते हुए अपने हिंद छोर के साथ आराम करना।
  3. अगले दिन (11 दिन) को नो टेस्टिंग सेशन करें।
    1. माउस को अपने घर के पिंजरे से 3 मिन के लिए पुनर्वासन के लिए खुले मैदान में स्थानांतरित करें, और फिर जानवर को अपने घर के पिंजरे में वापस करें।
    2. आदत के दौरान, 70% इथेनॉल के साथ वस्तुओं को अच्छी तरह से साफ करें और एक पेपर तौलिया के साथ मिटा दें। अवशिष्ट शराब पूरी तरह से सूखने के लिए कम से कम 1 मिन का इंतजार करें।
    3. एक वस्तु (50 मिलीआर प्लास्टिक ट्यूब पानी के 40 मिलील से भरा, वस्तु बी) एक और वस्तु (ग्लास Coplin जार, वस्तु सी) 5 सेमी आसपास की दीवारों से दूर के साथ बदलें। वस्तुओं को दो तरफा टेप से ठीक करें। पिंजरे के ढक्कन पर प्रयोगात्मक माउस को खुले मैदान में स्थानांतरित करें, और इसे दीवार का सामना करें। कोई परीक्षण के दौरान एक साथ प्रस्तुत वस्तुओं को प्रतिसंतुलित करें। उदाहरण के लिए, परिचय सत्र के दौरान दो ग्लास कोप्लिन जार (ऑब्जेक्ट सी) के संपर्क में आने वाले चूहों के लिए 40 मिलीएल पानी (ऑब्जेक्ट बी) से भरे 50 मिलील प्लास्टिक ट्यूब के साथ एक ग्लास कोप्लिन जार (ऑब्जेक्ट सी) को बदलें।
      नोट: बदले गए ऑब्जेक्ट के स्थान का प्रतिसंतुलन एक निश्चित दिशा के लिए संभावित जन्मजात वरीयता को कम करने के लिए भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, दो वस्तुओं (ऑब्जेक्ट बी या ऑब्जेक्ट सी) के सेट के संपर्क में आने वाले जानवरों के प्रत्येक पलटन के लिए, आधे प्रायोगिक जानवरों के लिए परिचित सत्र में पसंदीदा वस्तु को बदलें, और बाकी जानवरों के लिए, परिचित सत्र में कम पसंद की जाने वाली वस्तु को बदलें।
    4. 10 मिन की मुफ्त खोज की अनुमति दें और वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम का उपयोग करके इसे रिकॉर्ड करें। दो स्टॉपवॉच का उपयोग करके प्रत्येक वस्तु की खोज करने में बिताए गए समय को मापें और भेदभाव अनुपात की गणना करें।
      नोट: उस समय को मापें जब माउस अपनी मूंछ, स्नाउट या सामने पंजे के साथ वस्तुओं को छूता है। अन्वेषणात्मक समय के रूप में मात्रा न लें किसी भी व्यवहार जिसमें जानवर का स्नाउट वस्तु की ओर इशारा नहीं करता है, जैसे कि वस्तु पर बैठना, वस्तु से गुजरना, या वस्तु की ओर इशारा करते हुए अपने हिंद छोर के साथ आराम करना।
    5. प्रयोगात्मक माउस की पूंछ पकड़ो और अपने घर पिंजरे में स्थानांतरित करने के लिए पिंजरे के ढक्कन पर जगह है। 3 दिनों (दिन 12-14) के लिए, माउस को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ आराम करने दें।
    6. एक बार जब जानवर को खुले मैदान के बक्से से हटा दिया जाता है, तो 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ खुले फ़ील्ड बॉक्स की फर्श और दीवारों को अच्छी तरह से साफ करें और पेपर तौलिया के साथ मिटा दें।

3. पैटर्न जुदाई परीक्षण (पीएस)

  1. 15 दिन, पीएस परीक्षण के लिए पहला परिचय सत्र (F1) प्रदर्शन करें।
    1. माउस को अपने घर पिंजरे से 3 मिन के लिए पुनर्वासन के लिए खुले क्षेत्र क्षेत्र में स्थानांतरित करें, और फिर इसे अपने घर पिंजरे में वापस करें।
    2. आदत के दौरान, वस्तुओं और 70% इथेनॉल के साथ ग्रिड फर्श प्लेट को अच्छी तरह से साफ करें और एक पेपर तौलिया के साथ मिटा दें। अवशिष्ट शराब पूरी तरह से सूखने के लिए कम से कम 1 मिन का इंतजार करें।
    3. फर्श प्लेट (42.5 x 42.5 x 0.5 सेमी) खुले मैदान बॉक्स में चौड़े ग्रिड (5.5 x 5.5 सेमी) के साथ रखें और दो समान वस्तुओं (प्लास्टिक टी-फ्लास्क को खुले मैदान में 5 सेमी पानी से भरा रखें, ऑब्जेक्ट डी) आसपास की दीवारों से 5 सेमी दूर रखें। वस्तुओं को दो तरफा टेप से ठीक करें। वस्तुओं से सबसे दूर दीवार का सामना करना पड़ खुले क्षेत्र बॉक्स में प्रयोगात्मक माउस परिचय।
    4. चूंकि जानवर को पीएस परीक्षण में पानी के 50 मिलील पानी, ऑब्जेक्ट डी; ग्लास बॉटल, ऑब्जेक्ट ई से भरा प्लास्टिक टी-फ्लास्क दो अलग-अलग वस्तुओं (प्लास्टिक टी-फ्लास्क से अवगत कराया जाता है, F1 और F2 सत्रों के दौरान ऑब्जेक्ट को प्रतिसंतुलित करता है। उदाहरण के लिए, समूह में आधे जानवरों के लिए व्यापक ग्रिड मंजिल पर दो समान वस्तुएं (कांच की बोतलें, ऑब्जेक्ट ई) प्रस्तुत करें।
    5. 20 सीन के लिए मुफ्त अन्वेषण की अनुमति दें, और मैन्युअल रूप से दो स्टॉपवॉच का उपयोग करके दोनों वस्तुओं की खोज करने में बिताए गए समय को मापें। एक बार माउस दोनों वस्तुओं के लिए न्यूनतम अन्वेषण समय कुल (30 एस) तक पहुंचजाता है, F1 सत्र को रोकें और जानवर को अपने घर के पिंजरे में स्थानांतरित करें। यदि माउस 20 मिनट के भीतर 30 एस के लिए वस्तुओं का पता लगाने में विफल रहता है, तो इसे खुले मैदान बॉक्स से हटा दें और इसे आगे के सत्रों से बाहर करें।
      नोट: उस समय को मापें जब माउस अपनी मूंछ, स्नाउट या सामने पंजे के साथ वस्तुओं को छूता है। अन्वेषणात्मक समय के रूप में मात्रा न लें किसी भी व्यवहार जिसमें जानवर का स्नाउट वस्तु की ओर इशारा नहीं करता है, जैसे कि वस्तु पर बैठना, वस्तु से गुजरना, या वस्तु की ओर इशारा करते हुए अपने हिंद छोर के साथ आराम करना।
    6. पहले परिचय सत्र (F1) के पूरा होने के बाद, वस्तुओं और फर्श प्लेट को 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ अच्छी तरह से साफ करें और उन्हें खुले मैदान बॉक्स से हटा दें।
  2. अगले दिन (16 दिन) पीएस टेस्ट के लिए दूसरा परिचय सत्र (एफ2) करें।
    1. माउस को अपने घर पिंजरे से 3 मिन के लिए पुनर्वासन के लिए खुले क्षेत्र क्षेत्र में स्थानांतरित करें, और फिर जानवर को अपने घर के पिंजरे में वापस करें।
    2. आदत के दौरान, वस्तुओं को अच्छी तरह से साफ करें और 70% इथेनॉल के साथ फर्श प्लेट को ग्रिड करें और एक पेपर तौलिया के साथ मिटा दें। अवशिष्ट शराब पूरी तरह से सूखने के लिए कम से कम 1 मिन का इंतजार करें।
    3. फर्श प्लेट (42.5 x 42.5 x 0.5 सेमी) को खुले मैदान के बॉक्स में संकीर्ण ग्रिड (2.75 x 2.75 सेमी) के साथ रखें और आसपास की दीवारों से 5 सेमी दूर खुले मैदान में दो समान वस्तुओं (कांच की बोतलें, ऑब्जेक्ट ई) रखें। वस्तुओं को दो तरफा टेप से ठीक करें। वस्तुओं से सबसे दूर दीवार का सामना करना पड़ खुले क्षेत्र बॉक्स में प्रयोगात्मक माउस परिचय।
    4. प्रतिसंतुलन के लिए, संकीर्ण ग्रिड मंजिल पर दो समान वस्तुएं (50 मीटर पानी, ऑब्जेक्ट डी से भरे प्लास्टिक टी-फ्लास्क) प्रस्तुत करें।
    5. 20 सीन के लिए मुफ्त अन्वेषण की अनुमति दें और मैन्युअल रूप से दो स्टॉपवॉच का उपयोग करके दोनों वस्तुओं की खोज करने में बिताए गए समय को मापें। एक बार माउस दोनों वस्तुओं के लिए न्यूनतम अन्वेषण समय कुल (30 एस) तक पहुंचजाता है, तो F2 सत्र को रोकें और जानवर को अपने घर के पिंजरे में स्थानांतरित करें। यदि माउस 20 मिनट के भीतर 30 एस के लिए वस्तुओं का पता लगाने में विफल रहता है, तो इसे खुले मैदान बॉक्स से हटा दें और इसे आगे के सत्रों से बाहर करें।
      नोट: उस समय को मापें जब माउस अपनी मूंछ, स्नाउट या सामने पंजे के साथ वस्तुओं को छूता है। अन्वेषणात्मक समय के रूप में मात्रा न लें किसी भी व्यवहार जिसमें जानवर का स्नाउट वस्तु की ओर इशारा नहीं करता है, जैसे कि वस्तु पर बैठना, वस्तु से गुजरना, या वस्तु की ओर इशारा करते हुए अपने हिंद छोर के साथ आराम करना।
    6. दूसरे परिचय सत्र (एफ 2) के पूरा होने के बाद, 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ वस्तुओं और फर्श प्लेट को अच्छी तरह से साफ करें और उन्हें खुले मैदान बॉक्स से हटा दें।
  3. अगले दिन (दिन 17) पीएस टेस्टिंग सेशन करें।
    1. माउस को अपने घर पिंजरे से 3 मिन के लिए पुनर्वासन के लिए खुले क्षेत्र क्षेत्र में स्थानांतरित करें, और फिर इसे अपने घर पिंजरे में वापस करें।
    2. आदत के दौरान, वस्तुओं को अच्छी तरह से साफ करें और 70% इथेनॉल के साथ फर्श प्लेट को ग्रिड करें और एक पेपर तौलिया के साथ मिटा दें। अवशिष्ट शराब पूरी तरह से सूखने के लिए कम से कम 1 मिन का इंतजार करें।
    3. फर्श की प्लेट को खुले मैदान के बक्से में संकीर्ण ग्रिड (2.75 x 2.75 सेमी) के साथ रखें और फर्श प्लेट पर 5 सेमी दूर आसपास की दीवारों से 5 सेमी पानी से भरे दो अलग-अलग वस्तुओं (प्लास्टिक टी-फ्लास्क) रखें। वस्तुओं को दो तरफा टेप से ठीक करें। पिंजरे के ढक्कन पर प्रयोगात्मक माउस को खुले मैदान क्षेत्र में स्थानांतरित करें और इसे दीवार का सामना करें।
    4. पीएस परीक्षण के दौरान एक साथ प्रस्तुत वस्तुओं को प्रतिसंतुलित करें। उदाहरण के लिए, इस संदर्भ में ऑब्जेक्ट ई को उपन्यास वस्तु बनाने के लिए प्रत्येक वस्तु (ऑब्जेक्ट डी, ऑब्जेक्ट ई) को संकीर्ण ग्रिड फर्श पर रखें। ऑब्जेक्ट डी या ऑब्जेक्ट ई (संकीर्ण मंजिल पैटर्न पर एक उपन्यास वस्तु) के स्थान का प्रतिसंतुलन भी एक निश्चित दिशा के लिए एक सहज वरीयता की क्षमता को कम करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पूर्वायोगिक जानवरों के आधे के लिए दूसरे परिचय सत्र से पसंदीदा वस्तु को बदलें, और बाकी जानवरों के लिए, दूसरे परिचित सत्र से कम पसंदीदा वस्तु को बदलें।
    5. वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम का उपयोग करके 10 मिन ऑफ फ्री एक्सप्लोरेशन और रिकॉर्ड की अनुमति दें। दो स्टॉपवॉच का उपयोग करके प्रत्येक वस्तु की खोज करने में बिताए गए समय को मापें और भेदभाव अनुपात की गणना करें।
      नोट: उस समय को मापें जब माउस अपनी मूंछ, स्नाउट या सामने पंजे के साथ वस्तुओं को छूता है। अन्वेषणात्मक समय के रूप में मात्रा न लें किसी भी व्यवहार जिसमें जानवर का स्नाउट वस्तु की ओर इशारा नहीं करता है, जैसे कि वस्तु पर बैठना, वस्तु से गुजरना, या वस्तु की ओर इशारा करते हुए अपने हिंद छोर के साथ आराम करना।
    6. प्रयोगात्मक माउस की पूंछ पकड़ो और अपने घर पिंजरे में स्थानांतरित करने के लिए पिंजरे के ढक्कन पर जगह है।

4. क्रेसिल वायलेट धुंधला

  1. सभी व्यवहार परीक्षणों को पूरा करने के बाद, केटामाइन (50 मिलीग्राम/mL) और जाइलाज़ीन (23.3 मिलीग्राम/mL) के कॉकटेल (4:0.5) इंजेक्शन द्वारा जानवर को एनेस्थेटाइज करें 110 मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन (आईपी; 1 mL सिरिंज; 26 जी सुई) की खुराक पर खारा में भंग कर दिया। एक अंगूठे चुटकी के लिए एक प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की गहराई के लिए जांच करें ।
  2. एक बार जब जानवर गहराई से एनेस्थेटाइज्ड हो जाता है, तो मस्तिष्क15को ठीक करने के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ट्रांसकार्डायल परफ्यूजन करें।
  3. ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन समाप्त होने के बाद, जानवर को कैंची15की एक जोड़ी के साथ काटना। फिर, मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए आईरिस कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर खोपड़ी को हटा दें। मस्तिष्क के अलग होने के बाद, इसे रातोंरात 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में पोस्टफिक्स करें, इसके बाद 0.01 एम फॉस्फेट-बफर लवलाइन में 30% सुक्रोज में क्रायोप्रोटेक्शन।
  4. क्रायोस्टेट का उपयोग करके स्नैप-फ्रोजन मस्तिष्क से कोरोनल सेक्शन (30 माइक्रोन) बनाएं।
  5. स्लाइड्स पर मस्तिष्क के ऊतकों को माउंट करें और 100%, 95%, 90%, 80%, 70% इथेनॉल में 3 मिन क्रमिक रूप से धोकर पानी का दोहन करने के लिए 100% इथेनॉल से जलयोजन चरणों की एक श्रृंखला करें।
  6. 15 मिन के लिए 0.1% क्रेसिल वायलेट समाधान में ऊतक स्लाइड इनक्यूबेट करें।
  7. 95% इथेनॉल/0.1% हिमनदों एसिटिक एसिड में ऊतक स्लाइड विसर्जित करके अत्यधिक दाग हटादें, और फिर 100% इथेनॉल, 50% इथेनॉल/50% जाइलीन, और 100% जाइलीन के समाधान के साथ ऊतकों को निर्जलित करें।
  8. कवरस्लिप ऊतक एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जाइलीन बढ़ते माध्यम का उपयोग कर स्लाइड ।

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Representative Results

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संज्ञानात्मक कार्य के मूल्यांकन के लिए एक सामान्य प्रायोगिक अनुसूची और सेटअप चित्र 1में दिखाया गया है। पिलोकार्पाइन-प्रेरित तीव्र दौरे की शुरुआत के छह सप्ताह बाद, चूहों को परीक्षणों के बीच 3 दिन की शेष अवधि से अलग करने वाले आदेश में एनएल, नो और पीएस परीक्षणों के अधीन किया गया था(चित्रा 1A)। एनएल टेस्ट के लिए परिचय सत्र (F1) के दौरान खुले मैदान में दो समान वस्तुओं को रखा गया था और अगले दिन एक ऑब्जेक्ट को नए स्थान पर ले जाया गया । नो टेस्ट में टेस्टिंग सेशन के दौरान एक ऑब्जेक्ट को नए से बदल दिया गया । पीएस परीक्षण के लिए, दो परिचय सत्र (F1, F2) ने विभिन्न मंजिल ग्रिड पैटर्न और वस्तुओं के संयोजन पेश किए। फिर, परीक्षण के दिन, प्रत्येक परिचित सत्र से एक वस्तु संकीर्ण ग्रिड मंजिल पैटर्न पर रखा गया था, संकीर्ण ग्रिड मंजिल पैटर्न(चित्रा 1B)के संदर्भ में एक वस्तु उपन्यास बना रही है । ओपन फील्ड बॉक्स को सीधे एक चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरे के नीचे डेस्क पर रखा जा सकता है और अनावश्यक दृश्य संकेतों(चित्रा 2A)से बचने के लिए काले पर्दे से घिरा हुआ है। नमूना वस्तुओं को एक समान आकार की सामग्री को साफ करना आसान था या माउस(चित्रा 2 B)से थोड़ा बड़ा था। ऑब्जेक्ट संयोजनों को इस बात की पुष्टि करने के लिए प्रीस्क्रीन किए जाने की आवश्यकता थी कि एक साथ प्रस्तुत दो वस्तुओं(चित्रा 2C)के बीच कोई महत्वपूर्ण वरीयता नहीं थी। पीएस टेस्ट(चित्रा 2बी)में अतिरिक्त प्रायोगिक संकेत प्रदान करने के लिए विभिन्न पैटर्न वाली फर्श प्लेटों को खुले क्षेत्र के बॉक्स में रखा गया था। एक बार एक माउस को ओपन फील्ड बॉक्स में पेश किया गया था, एक वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम ने अपनी कुल लोकोमोशन दूरी(चित्रा 2D)का विश्लेषण करने के लिए अपने प्रक्षेपवक्र को ट्रैक किया। पिलोकार्पाइन इंजेक्शन के छह सप्ताह बाद, मिर्गी चूहों ने एनएल परीक्षण में भेदभाव अनुपात में उल्लेखनीय कमी दिखाई, स्थानिक स्मृति हानि(चित्रा 3)का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, कोई परीक्षण नहीं है, जो वस्तु मांयता स्मृति के लिए एक परीक्षण है में, मिर्गी चूहों नकली नियंत्रण की तुलना में बिगड़ा स्मृति समारोह दिखाया । जब नवजात न्यूरोनल फ़ंक्शन का मूल्यांकन पीएस परीक्षण के साथ किया गया था, तो मिर्गी चूहों को कई संकेतों के साथ एक संदर्भ में उपन्यास वस्तु को पहचानने में कठिनाई हुई थी। नियंत्रण प्रयोगों के रूप में, परिचय सत्र के दौरान अन्वेषण मानदंडों तक पहुंचने के लिए लोकोमोटर गतिविधि और विलंबता का आकलन किया गया(चित्रा 3)। लोकोमोटर गतिविधि की माप ने मिर्गी के जानवरों(चित्रा 3 सी)में पिछलीरिपोर्टों 16,,17के अनुरूप महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई, जबकि वस्तुओं का पता लगाने की प्रेरणा नकली और मिर्गी जानवरों(चित्रा 3 डी)के बीच तुलनीय थी। हमारे छोड़ने की दर परिचय सत्र में अंवेषण मापदंड में नाकाम रहने १७.४%, १८.२%, एनएल, नहीं, और पीएस परीक्षण के लिए 0% क्रमशः थे, सुझाव है कि जानवरों व्यवहार परीक्षणों की श्रृंखला के दौरान प्रयोगात्मक वातावरण के आदी हो गया । अंत में, हमने जब्ती से प्रेरित न्यूरोनल क्षति(चित्रा 4)की पुष्टि करने के लिए क्रेसिल वायलेट धुंधला का उपयोग करके पिलोकार्पाइन-प्रेरित स्थिति मिर्गी के बाद हिप्पोकैम्पल सेल मौत का मूल्यांकन किया। पिलोकार्पाइन-उपचारित जानवरों ने नकली नियंत्रण(चित्रा 4)के विपरीत, हिलस और हिप्पोकैम्पस के सीए 3 उपक्षेत्र में पाइनॉटिक कोशिकाओं का प्रदर्शन किया।

Figure 1
चित्रा 1: व्यवहार परीक्षण बैटरी की योजनाबद्ध प्रस्तुति। (ए)उपन्यास ऑब्जेक्ट स्थान (एनएल), उपन्यास वस्तु मान्यता (नहीं), और पैटर्न जुदाई (पीएस) नकली और मिर्गी चूहों के लिए पैटर्न जुदाई (पीएस) परीक्षणों के लिए व्यवहार अनुसूची की एक योजनाबद्ध ड्राइंग। (ख)एनएल, नो और पीएस परीक्षणों के लिए वस्तु और फर्श प्लेट की व्यवस्था की प्रतिनिधि छवियां । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: संज्ञानात्मक समारोह के मूल्यांकन के लिए व्यवहार तंत्र। (A)व्यवहार सेटिंग का एक सामान्य सिंहावलोकन। एक कैमरा सीधे खुले मैदान बॉक्स के ऊपर रखा गया था, जो अनावश्यक संकेतों से बचने के लिए पर्दे से घिरा हुआ था। (ख)उपन्यास ऑब्जेक्ट स्थान (एनएल), उपन्यास वस्तु मान्यता (नहीं), और पैटर्न जुदाई (पीएस) परीक्षण के लिए नमूना वस्तुएं। पीएस टेस्ट के लिए अलग-अलग पैटर्न वाली फ्लोर प्लेट यानी चौड़े और संकरे ग्रिड को अतिरिक्त संकेत देने के लिए ओपन फील्ड बॉक्स में डाला गया था। (ग)रेखांकन क्रमशः एन और पीएस परीक्षण सत्र (एन = 7) के दौरान एक साथ प्रस्तुत प्रत्येक वस्तु की खोज करने का समय दिखारहा है। ध्यान दें कि मान-व्हिटनी यू टेस्ट (नो टेस्ट के लिए) और स्टूडेंट के अनपेयेड टी-टेस्ट (पीएस टेस्ट के लिए) द्वारा मूल्यांकन की गई दो वस्तुओं के बीच वरीयता में कोई खास अंतर नहीं था । (D)एक छवि दिखा रही है कि एक वीडियो ट्रैकिंग प्रणाली खुले क्षेत्र बॉक्स में प्रयोगात्मक माउस का पता चला । लाल वर्ग माउस के प्रक्षेपवक्र पर नज़र रखने के लिए पूर्व निर्धारित क्षेत्र को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: मिर्गी चूहों में बिगड़ा स्थानिक स्मृति और पैटर्न जुदाई। (A)उपन्यास ऑब्जेक्ट स्थान (एनएल), उपन्यास वस्तु मान्यता (नहीं), और पैटर्न जुदाई (पीएस) परीक्षणों की एक योजनाबद्ध प्रस्तुति। एक उपन्यास वस्तु को लाल चक्र के रूप में दर्शाया गया है। (ख)एफएल, नहीं, और पीएस परीक्षणों में भेदभाव अनुपात दिखा रेखांकन शाम (एन = 8) और मिर्गी चूहों (एन = 10) के बीच । ध्यान दें कि मिर्गी चूहों ने एनएल, नो और पीएस परीक्षणों में महत्वपूर्ण हानि का प्रदर्शन किया, जो क्रमशः स्थानों, वस्तुओं और संदर्भों के लिए स्मृति समारोह का परीक्षण करते हैं। * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 एनएल टेस्ट के लिए मान-व्हिटनी यू टेस्ट द्वारा। * पी एंड एलटी; 0.05 नो टेस्ट के लिए स्टूडेंट के अनपेयर टी-टेस्ट से। * पी एंड एलटी; 0.05 पीएस टेस्ट के लिए वेल्च के सुधार के साथ छात्र के अपेयर टी-टेस्ट द्वारा। (C)एक ग्राफ जिसमें नकली (एन = 8) और मिर्गी चूहों (एन = 10) की लोकोमोटर गतिविधि दिखाई देती है। ध्यान दें कि मिर्गी चूहों ने पिछली रिपोर्टों के अनुरूप लोकोमोशन में वृद्धि का प्रदर्शन किया। * पी एंड एलटी; 0.05 छात्र के अपेयर टी-टेस्ट द्वारा। (डी)एनएल, एन, और पीएस परीक्षणों के परिचय सत्र में 30 एस मानदंडों के लिए विलंबता दिखा रेखांकन । ध्यान दें कि नकली (एन = 8) और मिर्गी चूहों (एन = 10) के बीच वस्तुओं की खोज के लिए प्रेरणा में कोई अंतर नहीं थे। डेटा मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं मतलब (एसईएम)। एसई = स्थिति मिर्गी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: पिलोकार्पाइन-प्रेरित स्थिति मिर्गी (एसई) के बाद हिप्पोकैम्पस में न्यूरोनल मौत। (ए)नकली और(बी)मिर्गी समूहों से प्रतिनिधि छवियां पिलोकार्पाइन इंजेक्शन के ५८ दिन बाद । बढ़ाया छवियों हिस(ए, डी),CA1 उपक्षेत्र(बी, ई),और CA3 उपक्षेत्र(सी, एफ)हिप्पोकैम्पस, जो कम आवर्धन के साथ छवियों में सफेद वर्गों के रूप में संकेत कर रहे है दिखाते हैं । हिप्पोकैम्पस के हिलस और सीए 3 सबफील्ड में पाइनॉटिक कोशिकाओं पर ध्यान दें। दूर-बाएं छवि = 200 माइक्रोन में स्केल बार, नीचे की छवि के लिए भी मान्य है; एक, बी, सी = 40 माइक्रोन में स्केल बार, क्रमशः डी, ई, एफके लिए भी मान्य है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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यह काम पुरानी मिर्गी के साथ चूहों में संज्ञानात्मक कार्य के मूल्यांकन के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। चूहों 18में सीखने और स्मृति कार्यों का आकलन करने के लिए कई अलग - अलग व्यवहार परीक्षण प्रतिमान का उपयोग किया जाता है। मॉरिस पानी भूलभुलैया, रेडियल आर्म भूलभुलैया, वाई-भूलभुलैया, प्रासंगिक भय कंडीशनिंग, और वस्तु आधारित परीक्षण सबसे अधिक बार उपयोग किए जाने वाले व्यवहार परीक्षण हैं और विश्वसनीय परिणाम प्रदान करते हैं। उनमें से, एनएल, नो और पीएस परीक्षण मिर्गी चूहों8,,10में सीखने और स्मृति के मूल्यांकन के लिए कुशल, सरल तरीके हैं। क्योंकि मिर्गी चूहों व्यवहार सत्रों के दौरान अप्रत्याशित सहज दौरे हो सकता है, यह इस तरह के डर कंडीशनिंग, हल्के भुखमरी, या मजबूर तैराकी के रूप में इस तरह के डर कंडीशनिंग, हल्के भुखमरी, या बचाए रहने के लिए मजबूर तैराकी के रूप में अversive-प्रेरित कार्यों में इस्तेमाल किया उन जैसे अन्य सकारात्मक या नकारात्मक सुदृढीकरण जोड़ने के बिना नवीनता की खोज के लिए जानवरों के प्राकृतिक झुकाव के आधार पर व्यवहार परीक्षणों का उपयोग करने के लिए बेहतर है, जो आवर्ती बरामदगी19,,20ट्रिगर कर सकते हैं । इसके अलावा, अन्य व्यवहार परीक्षणों की तुलना में, नवीनता आधारित परीक्षण जानवरों के लिए कम तनावपूर्ण होते हैं क्योंकि व्यापक प्रशिक्षण सत्रों की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, नवीनता आधारित व्यवहार परीक्षणों को आसानी से विभिन्न प्रकार की स्मृति (यानी, स्थानिक स्मृति, मान्यता स्मृति, या प्रासंगिक स्मृति) का आकलन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, बस वस्तु स्थान को बदलकर, एक उपन्यास वस्तु पेश करके, या अतिरिक्त उत्तेजनाओं का संयोजन। एक साथ लिया, इस तरह के एनएल, नहीं, और पीएस परीक्षण के रूप में नवीनता आधारित परीक्षण मिर्गी चूहों में संज्ञानात्मक कार्यों के मूल्यांकन के लिए बहुमुखी लाभ है ।

यद्यपि एनएल, नो, और पीएस परीक्षण मिर्गी चूहों में सीखने और स्मृति कार्य की जांच के लिए त्वरित और उपयोगी प्रयोगात्मक मॉडल हैं, लेकिन उनका उपयोग करते समय कई कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि क्रोनिक मिर्गी चूहों पिलोकार्पाइन इंजेक्शन7से बढ़ चिंता दिखाते हैं, जिससे परिचित सत्रों के दौरान वस्तु अन्वेषण में उल्लेखनीय कमी आती है। अन्वेषण की यह कमी परीक्षा परिणामों की गलत व्याख्या का कारण बन सकती है। इसलिए, चूहों को परिचित सत्र से पहले पर्यावरण के लिए उपयोग करने के लिए खुले मैदान में पर्याप्त आदत शामिल करना महत्वपूर्ण है। उपभेदों के आधार पर, चूहों अभी भी आदत के 3 सत्रों के बाद भी परिचित सत्र के 20 मिनट के भीतर 30 एस के लिए वस्तुओं का पता लगाने में विफल हो सकता है। उस मामले में, खुले क्षेत्र बॉक्स में वस्तुओं के अतिरिक्त जोड़े के साथ एक और आदत सत्र जोड़ने से वस्तुओं की ओर माउस की चिंता को कम करने में मदद मिल सकती है। खुले क्षेत्र बॉक्स के आसपास के पर्दे बाहरी कमरे संकेतों को कम कर सकते हैं, जिससे प्रायोगिक चूहों को खुले मैदान में वस्तुओं पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति मिल सकती है। इसके अलावा, अन्वेषण मानदंड उन व्यवहारों को बाहर करने के लिए पर्याप्त सख्त होना चाहिए जिनमें जानवर का स्नाउट वस्तु की ओर इशारा नहीं करता है, जैसे कि वस्तु पर बैठना, वस्तु से गुजरना, या वस्तु की ओर इशारा करते हुए अपने पिछले अंत के साथ आराम करना। अंत में, हालांकि यह बहुत दुर्लभ हो सकता है, जब्ती की घटनाओं व्यवहार कार्यों के दौरान हो सकता है । इस मामले में, यह सिफारिश की जाती है कि उन जानवरों को आगे के आकलन से हटादिया जाए क्योंकि यह स्मृति समारोह के मूल्यांकन के लिए पूर्वाग्रह को भ्रमित करने का एक संभावित स्रोत हो सकता है।

चूंकि एनएल, नो और पीएस परीक्षण उपन्यास उत्तेजनाओं के लिए जानवरों की प्राकृतिक जिज्ञासा पर निर्भर बहुत संवेदनशील प्रयोग हैं, सूक्ष्म परिवर्तन चूहों के अन्वेषणात्मक व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अनिर्णायक भेदभाव अनुपात21,,22हो सकता है। उदाहरण के लिए, माउस की कठोर हैंडलिंग, व्यवहार कार्यों से ठीक पहले एक बिस्तर बदलना, परीक्षण का असंगत समय, और परीक्षण कक्ष में अपर्याप्त अनुकूलन सभी जानवरों के तनाव के स्तर को ऊंचा कर सकते हैं, जिससे गोलमोल परीक्षण परिणाम हो सकते हैं। इसके अलावा, प्रत्येक सत्र में असममित वस्तुओं की असंगत प्रस्तुतियों, प्रयोगात्मक क्षेत्र के पास घर पिंजरों की नियुक्ति, या प्रयोगकर्ता के घ्राण हस्ताक्षर स्विचन जैसे परिवर्तित परीक्षण वातावरण को अतिरिक्त कारकों से बचने के लिए सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। डेटा विश्लेषण के चरण में, कई प्रयोगकर्ताओं द्वारा मूल्यांकन कृंतक अन्वेषणात्मक व्यवहार या स्टॉपवॉच उपयोगों के विभिन्न मानदंडों के कारण व्यवहार परिणामों में परिवर्तनशीलता में वृद्धि करने में योगदान दे सकते हैं। सामूहिक रूप से एनएल, एनओ और पीएस टेस्ट के सफल क्रियान्वयन के लिए इन पहलुओं को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

हिप्पोकैम्पस और पैराहिप्पोकैम्पस क्षेत्र23,24स्मृति प्रसंस्करण में अद्वितीय भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है । यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि स्थानिक स्मृति काफी हद तक हिप्पोकैम्पस के कार्य पर निर्भर करती है, जिसका मूल्यांकन एनएल परीक्षण23,24द्वारा आसानी से किया जा सकता है। दूसरी ओर, ऑब्जेक्ट रिकग्निशन मेमोरी में पेरिरिनल कॉर्टेक्स, द्वीपीय प्रांतस्था और वेंट्रोमेटियल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स सहित कई मस्तिष्क क्षेत्र शामिल हैं, जो हिप्पोकैम्पस25,,,26,,27,,28,,29,30,,31,,,32,,33,34,,35,,36,37,,38के अलावा हैं।, पिलोकार्पाइन-उपचारित मिर्गी चूहों ने लगातार व्यापक हिप्पोकैम्पल न्यूरोनल क्षति39,,40,,41,42के साथ स्थानिक स्मृति परीक्षण में व्यवहार हानि का प्रदर्शन किया है, जबकि वस्तु मान्यता स्मृति परीक्षणों ने विवादास्पद परिणाम पैदा किए हैं, जिसमें पैराहिप्पोकैम्पल मस्तिष्क क्षेत्रों में चर न्यूरोनल डिजनरेशन10,,,41,,42,,43,,44हैं। इन आंकड़ों का मतलब है कि ऑब्जेक्ट रिकग्निशन के लिए कई मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच परिष्कृत नेटवर्क कनेक्शन की आवश्यकता हो सकती है, स्थानिक स्मृति के विपरीत जिसमें हिप्पोकैम्पस एक केंद्रीय भूमिका निभा सकता है। जब विशिष्ट हिप्पोकैम्पल सबफील्ड्स का बारीकी से आकलन किया जाता है, तो सीए1 और सीए3/डेनटेट जाइरस क्षेत्र विभिन्न जानकारी को संसाधित करने के लिए पाए जाते हैं । विशेष रूप से, CA1 न्यूरॉन्स को इसी तरह की वस्तुओं के संपर्क में आने से सक्रिय माना जाता है, जबकि सीए 3 और डेनटेट जाइरस समान वस्तुओंको 23,,45के भेदभाव में शामिल कर ते हैं। उस परिकल्पना के अनुरूप, उभरते सबूत ों से पता चलता है कि नवजात न्यूरॉन्स पैटर्न जुदाई प्रदर्शन45,,46,,47में योगदान दे सकते हैं। यह देखते हुए कि एपिपिप्टोजेनेसिस10के दौरान एपिप्टोजेनेसिस के दौरान एपिप्टोजेनेसिस के दौरान प्रेरित किया जा सकता है, मिर्गी चूहे पुरानी मिर्गी में नवजात न्यूरॉन्स के बाधित एकीकरण के कारण अनुरूप अनुभवों को भेदभाव करने में बिगड़ा प्रदर्शन प्रदर्शित कर सकते हैं।

निष्कर्ष में, हम मिर्गी चूहों में स्मृति हानि का मूल्यांकन करने के तरीके का वर्णन करते हैं। विशेष रूप से, हम तीन व्यवहार परीक्षणों, एनएल, एनओ और पीएस परीक्षणों के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो क्रमशः स्थानों, वस्तुओं और संदर्भों के लिए स्मृति का परीक्षण करते हैं। चूहों के लिए उपलब्ध कई संज्ञानात्मक परीक्षण प्रतिमानों में, एनएल, नो और पीएस परीक्षण काफी सरल हैं, छोटे परखों कि न्यूनतम जानवरों पर तनाव है, जो उन्हें आवर्ती दौरे को ट्रिगर किए बिना मिर्गी के जानवरों में स्मृति समारोह का मूल्यांकन करने के लिए इष्टतम बनाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ जए-मिन ली को उनके तकनीकी सहयोग के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को कोरियाई सरकार (एनआरएफ-2019R1A2C1003958, एनआरएफ-2019K2A9A2A080000167) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringe Sung-shim Use with the 26 or 30 gauge needle
70% Ethanol Duksan UN1170 Spray to clean the box and objects
black curtain For avoiding unnecessary visual cues
Cresyl violet Sigma C5042 For Cresyl violet staining
cryotome Leica E21040041 For tissue sectioning
double-sided sticky tape For the firm placement of the objects
DPX mounting medium Sigma 06522
ethanol series Duksan UN1170 Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions
floor plate with narrow grid patterns Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm
floor plate with wide grid patterns Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm
illuminometer TES Electrical Electronic Corp. 1334A For the measurement of the room lighting (60 Lux)
Intensive care unit Thermocare #W-1
ketamine hydrochloride Yuhan 7003 Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
LED lamp Lungo P13A-0422-WW-04 Lighting for the behavioral test room
objects Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle
open field box Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm
paper towel Yuhan-Kimberly 47201 Use to dry open field box and objects
paraformaldehyde Merck Millipore 104005 Make 4% solution
pilocarpine hydrochloride Sigma P6503
ruler Use to locate the objects in the open field box
scopolamine methyl nitrate Sigma S2250 Make 10X stock
Smart system 3.0 Panlab Video tracking system
stopwatch Junso JS-307 For the measurement of explorative activities of mice
sucrose Sigma S9378 For cryoprotection of tissue sections
terbutaline hemisulfate salt Sigma T2528 Make 10X stock
video camera (CCD camera) Vision VCE56HQ-12 Place the camera directly overhead of the open field box
xylazine (Rompun) Bayer korea KR10381 Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
xylene Duksan UN1307 For Cresyl violet staining

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References

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349, (13), 1257-1266 (2003).
  2. Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7, (4), 348-354 (2007).
  3. Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5, (7), 380-391 (2009).
  4. Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
  5. Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34, (1), 183-204 (2016).
  6. Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
  7. Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207, (2), 329-349 (2007).
  8. Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114, (17), 3536-3545 (2017).
  9. Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
  10. Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606 (2015).
  11. Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55, (4), 3316-3327 (2018).
  12. Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
  13. Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429 (2016).
  14. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  16. Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219, (1), 284-297 (2009).
  17. Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51, (4), 789-804 (2006).
  18. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11, (1), 0147733 (2016).
  19. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718 (2017).
  20. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13, (2), 93-110 (2012).
  21. van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13, (8), 1763-1792 (2018).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8, (12), 2531-2537 (2013).
  23. Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
  24. Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1, (1), 41-50 (2000).
  25. Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2, (1), 51-61 (2001).
  26. Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24, (26), 5901-5908 (2004).
  27. Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25, (1), 52-61 (2005).
  28. Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12, (5), 447-449 (2005).
  29. Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16, (12), 1759-1765 (2006).
  30. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
  31. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23, (17), 1685-1690 (2013).
  32. Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17, (1), 5-11 (2010).
  33. Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
  34. de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405, (1-2), 142-146 (2006).
  35. Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82, (1), 26-34 (2004).
  36. Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20, (23), 8853-8860 (2000).
  37. Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
  38. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9, (2), 49-57 (2002).
  39. Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
  40. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
  41. Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59, (9), 1785-1795 (2018).
  42. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  43. Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46, (4), 499-508 (2005).
  44. Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21, (7), 702-713 (2011).
  45. Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34, (10), 515-525 (2011).
  46. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167, (4), 897-914 (2016).
  47. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472, (7344), 466-539 (2011).
पिलोकार्पाइन-प्रेरित मिर्गी चूहों में मेमोरी फंक्शन का आकलन
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Park, K. M., Kim, J. E., Choi, I. Y., Cho, K. O. Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice. J. Vis. Exp. (160), e60751, doi:10.3791/60751 (2020).More

Park, K. M., Kim, J. E., Choi, I. Y., Cho, K. O. Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice. J. Vis. Exp. (160), e60751, doi:10.3791/60751 (2020).

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