Summary
여기서, 우리는 기능성 메카노트랜스덕션 채널을 가진 청각 모발 세포에서 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱젠의 섭취를 시각화하는 방법을 제시한다. 또한, 3-10 kDa의 덱스 트랜스는 모발의 내분비증과 코르티 장기의 지지 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
모발 세포 메카노트랜스덕션(MET) 채널은 청력에 중요한 역할을 합니다. 그러나, MET의 분자 정체성 및 구조 정보는 알려지지 않은 남아 있습니다. 모발 세포의 전기 생리학적 연구는 MET 채널이 큰 전도도를 가지며 일부 스타일 염료 및 텍사스 적색 표지 된 아미노 글리코 시드 항생제를 포함하여 상대적으로 큰 형광 양이온 분자에 투과성임을 밝혔다. 이 프로토콜에서, 우리는 기능적 MET 채널을 위한 분석하기 위하여 이용될 수 있는 Corti 이식의 기관의 머리 세포에 있는 형광 덱스트랜스의 픽업을 구상하고 평가하는 방법을 기술합니다. 우리는 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱스른이 1-2 시간 배양 후 기능성 청각 모발 세포를 구체적으로 라벨로 표시한다는 것을 발견했습니다. 특히, 3 kDa dextran은 기능성 MET 채널이 존재할 때 두 개의 짧은 스테레오실리아 행을 라벨하고 확산 패턴으로 세포체에 축적한다. 라벨링의 추가 소포 같은 패턴은 모발 세포와 주변 지지 세포의 세포체에서 관찰되었다. 우리의 데이터는 3 kDa 텍사스-레드 dextran가 세포 염료 관전자를 위한 2개의 통로를 구상하고 공부하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 건의합니다; 기능성 MET 채널 및 내분비증을 통한 모발 세포 특이적 진입 경로, 더 큰 덱스렌에 사용할 수 있는 패턴.
Introduction
내이의 모발 세포는 소리를 감지하고 궁극적으로 우리의 뇌에 의해 해석되는 전기 신호의 기계적 자극을 은폐하는 감각 세포입니다. 이 세포는 그들의 정점 지역1,2에서돌출하는 스테레오실리아로 알려져 있는 actin 기지를 둔 필라멘트의 3개의 행의 계단 모양 의 묶음을 가지고 있습니다. 기계적 자극은 스테레오실리아 필라멘트를 가장 긴 행쪽으로 편향시키고 메카노트랜스덕션(MET) 채널3의개구부를 트리거합니다. MET 채널의 개통은 세포를 탈분극화하고 결과적으로 모발 세포의 기저 부위에 시냅스 소포의 방출을 신호하는 양이온의 유입으로 이어집니다.
청력에 필수적인 MET 채널의 생물물리학적 특성은 광범위하게 특징지어졌습니다. 다른 특성 들 중, 이들 채널은 양이온 선택적이며 상대적으로 큰 전도도 (낮은Ca2 +에서 150-300 pS)4,5,6,7,8,9,10을갖는다. 놀랍게도, FM1-43 및 텍사스 적색 표지된 아미노글리코시드와 같은 큰 형광 분자는 MET 채널의 퍼시블 차단제이며, 형광 현미경 검사법을 사용하여 가시화될 수 있는 모발 세포체에 축적되는 결과를11,12,13,14. 반대로, 분자 정체성 및 MET 채널및 그 투과 통로의 구조는 애매하게 남아 있습니다. 증가하는 실험적 증거는 막막유사 채널 단백질 1(TMC1)이 성숙한 모발 세포15,16,17,18,19에서MET 채널의 성분임을 나타낸다. 막형 채널 1(TMC1)의 돌연변이는 MET 채널 속성19,20,21,22를 변경하고 청각 장애를 일으킨다. 또한, TMC1은 MET채널(18,23)의 부위에 국소화하고, 기계적 힘을 MET채널(24,25)으로전송하는 것을 담당하는 팁 링크와 상호작용한다. 더욱이, 최근 생물정보학 분석은 TMC 단백질을 메카노민성 채널 TMEM63/OSCA 단백질 및 TMEM16 단백질, 칼슘 활성 염화물 채널 및 지질 스크램블라제 26,27,28와관련된 진화로 확인하였으며,28. 이들 단백질 간의 관계에 기초한 TMC1의 구조적 모델은 단백질-지질계면(27)에서큰 공동의 존재를 밝혀낸다. 이 공동은 상염색체 지배적 난청(DFNA36)을 유발하는 2개의 TMC1 돌연변이(DFNA36)27,29,30,31,32,및 캐비티 내의 잔류물을 위한 시스테인 돌연변이체의 선택적 변형MET 채널특성(28)을수용하며, 이는 MET 채널의 투과 경로로서 기능할 수 있음을 나타낸다. TMC 단백질에 있는 이 예측한 구멍의 큰 규모는 MET 채널을 침투하는 큰 분자의 기능을 설명할 수 있었습니다. MET 채널이 비정상적으로 큰 투과 경로를 포함하고 TMC1에서 관찰된 공동의 크기의 한계를 밀어내기 위해, 우리는 더 큰 분자를 가진 코르티 이식의 기관에서 섭취 실험을 수행하는 프로토콜을 개발, 3 kDa dextran 형광으로 텍사스 레드로 표지.
Dextran은 알파 1,6 글리코시딕 결합에 의해 결합된 많은 D-포도당 분자로 구성된 복잡한 분지 다당류입니다. 물의 높은 용해도, 낮은 세포 독성 및 생체 불활성은 여러 세포 과정을 연구할 수있는 다목적 도구입니다. 또한, 덱스렌은 다양한 크기와 형광으로 여러 가지 색상의 형광로 표지로 제공됩니다. 형광표지덱스트랜스는 세포 및 조직 투과성 연구33,34,다중 세포 시스템35,36,및 신경 추적37,38에서내분비증을 연구하는 데 일반적으로 사용된다. 청각 분야에서, 덱스렌 분자는 또한 코르티39,40의친칠라 기관에서 강렬한 소음에 노출 된 후 세포 세포 접합의 중단 및 청각 감각 상피 무결성의 손실을 평가하는 데 사용되었습니다.
이 작품에서, 우리는 뮤린 내이 모발 세포에서 의 한 부분의 관세포 실험을 수행하고 내이 모발 세포 MET 채널의 투과 경로의 크기를 탐구하기 위해 가장 작은 (3 및 10 kDa) 형광 덱스 트랜스의 일부의 특성을 이용했다. 또한, 우리는 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (LSM) 880을 사용하여 에어리스캔 검출기가 장착되어 입체 및 청각 모발 세포의 세포체에서 형광 덱젠을 시각화하고 국소화했습니다.
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Protocol
동물 관리 및 실험 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 수행되었다, 이는 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인된 (동물 프로토콜 은 KJS에 #1336).
1. 생쥐
- C57BL/6J 야생형의 번식 쌍을 세워 동물 시설에서 번식하여 새끼의 생년월일을 제어하고 새끼의 나이를 추적합니다.
2. 달팽이관 해부
- 해부를 수행하기 위해 입체 현미경에 가까운 깨끗한 공간을 설정합니다(그림1A). 70% 에탄올을 사용하여 공간과 주변 환경을 청소하고 깨끗한 벤치 패드를 놓습니다. 동물 시체를 폐기하려면 의료 병리학 폐기물(MPW) 비닐 봉지가 필요합니다.
- Leibovitz의 L15 미디어로 35mm 요리를 준비합니다.
참고: Leibovitz의 L-15 세포 매체는 팁 링크의 무결성을 유지하는 데 필요한 1-2 mMCa2+를함유하고 있으며, 세포 건강과 생존을 개선하기 위해 필수 아미노산, 비타민 및 나트륨 피루바테를 함유하고 있습니다. 혈청은 그 잘못 정의된 조성물 및 덱스렌과의 잠재적 간섭으로 인한 실험적 가변성을 피하기 위해 배제되었다. - 산후-6(P6) 마우스를 참수에 의해 안락사시한다.
참고 : 6 일 된 마우스는 흡입 성 마취제에 다소 내성이 있습니다. 이소플루란 또는 장기간CO2 노출(최대 50분)이 안락사에 사용될 수 있지만, 사망을 보장하기 위해 이차적인 물리적 방법을 사용하는 것이 좋습니다. - 외과 용 가위를 사용하여 전방에서 후방 끝및 외부 청각 운하를 가로 질러 피상적 인 컷을 만들어 두개골의 피부를 제거하십시오.
- 피부를 코쪽으로 접어 두개골을 노출시다(그림2B).
- 두개골 의 앞쪽과 눈 선을 가로 질러 뒤에서 절개를합니다(그림 2B-C).
- 두개골을 두 반으로 분리하고 작은 주걱을 사용하여 뇌를 제거하여 측두골에 노출시(그림 2C-D).
- 작은 가위로, 측두골 주위를 자르고 조직을 절제하십시오.
- 두 개의 측두뼈를 35mm 접시에 놓고 L15 용지로 덮여 있는지 확인합니다(그림2E).
참고: 다음 단계는 입체 현미경으로 수행됩니다. 검은 배경은 일반적으로 미세 해부 단계 동안 조직을 시각화하는 데 도움이됩니다. - 와이드필드 접안렌즈(10배 배율(WF10X)와 외부 교류 전류(AC) 할로겐 광원이 장착된 입체 현미경으로 주변 달팽이관 조직, 반원형 운하 및 수술용 집게가 있는 전정 기관을 제거합니다(그림2F).
- 덱스렌 및 L15 용지가 달팽이관 덕트에 들어갈 수 있도록 해부된 달팽이관에 두 개의 펑크 경계를 수행합니다.
- 9웰 유리 우울증 플레이트에서 각 우물에 Leibovitz의 L15 용지 300mL를 추가합니다.
- 각 우물에 적어도 세 개의 해부 된 달팽이를 놓습니다.
3. 덱스렌 라벨링
- Ca2+ 및 Mg2+ (HBSS-CFM)를 10 mg/mL의 최종 농도로 하지 않고 행크스의 균형 잡힌 소금 용액에 덱스렌을 재구성합니다. 이 스톡 용액은 불투명한 검정 튜브(빛으로부터 보호됨)로 aliquoted되고 사용 될 때까지 -30 °C에서 보관되어야합니다.
참고: 이 프로토콜의 성공적인 결과에는 lysine-fixable dextran의 사용이 중요합니다. - Leibovitz의 L15 용지 500 mL에서 2 mg/mL의 최종 농도로 각 덱젠을 준비합니다.
- 달팽이관에서 미디어를 제거하고 2 mg/mL의 최종 농도에서 관심 있는 덱스트란을 포함하는 Leibovitz의 L15 용지를 추가합니다.
참고: MET 채널의 비율이 나머지41,42에서열려 있지만, 덱스트렌 배양은 MET 채널의 개방 확률을 높이기 위해 이식의 완만한 흔들림으로 수행되었다. - 25°의 기울어진 각도로 3차원 셰이커를 사용하여 부드러운 흔들림(25rpm)으로 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
참고: 형광으로 라벨이 부착된 덱스트렌은 가능하면 빛으로부터 보호되어야 합니다. 2시간 배양 동안 덱스트렌을 보호하기 위해, 알루미늄 호일에 싸인 세포 배양 P150 접시 안에 9웰 유리 판을 놓는다.
4. 화상 진찰을 위한 견본 준비
- 덱스렌으로 배양한 후, 2분 동안 미디어를 두 번, HBSS로 한 번 씻는다.
- 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)에서 4 % 파라 포름 알데히드로 실온에서 30 분 동안 조직을 배양하십시오.
주의: 포름알데히드에 노출되면 눈, 코 및 상부 호흡기에 자극적일 수 있습니다. 특정 개별에서는, 포름알데히드에 반복된 피부 노출은 알레르기성 피부염 귀착될 수 있는 과민반응을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 포름알데히드는 알려진 인간 발암 물질이며 생식 위험이 의심됩니다. - HBSS로 고정 된 조직을 두 번 신속하고 부드럽게 세척하여 파라 포름 알데히드를 제거하십시오.
참고 : 달팽이관의 이 발달 단계에서는 측두골의 데칼화가 필요하지 않습니다. - 코르티의 기관을 해부하는 미세 팁 집게로 나선형 인대와 지각 막을 제거하십시오(그림 2G).
- 조직의 모든 작은 조각을 제거하고 HBSS로 조직을 씻어.
- 형광표지된 파할로이드를 함유한 PBS에서 0.5% 트리톤 X-100으로 조직을 투과하여(TR-또는 FITC 라벨이 부착된 덱스트란의 흡수를 각각 테스트할 때 녹색 또는 적색으로 공액화) 1:200 희석하여 F-액틴라벨을 30분 동안 액틴 기반 의 스테레오실리아.
- HBSS 완충액으로 매번 2-3회 조직을 세척하여 트리톤과 파할로이드의 과잉을 제거하고, 한 번 PBS로 소금을 제거한다.
- 현미경 슬라이드에 코르티 조직의 기관을 장착하고 장착 매체로 덮습니다.
참고: 티슈를 장착할 때, 모발 세포 스테레오실리아를 포함하는 조직의 측면이 커버슬립을 향하고 있는지 확인하십시오. - 마운팅 미디어를 추가하는 동안 발생하는 잠재적인 기포를 제거하고 커버슬립을 배치하는 동안 새로운 기포가 생성되는 것을 방지합니다.
참고: 마운팅 매체를 추가하는 동안 생성된 모든 기포를 파이펫으로 흡인합니다. 기포가 커버슬립 아래에 갇히지 않도록 하기 위해 커버슬립 가장자리를 시료 가까이에 놓고 집게 나 파이펫 팁을 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 천천히 하강합니다. - 유리 커버 슬립으로 마운팅 매체에 티슈를 덮습니다(그림2H).
참고: 수치 조리개가 0.4이상인 대점은 #1.5개의 커버슬립(두께 0.17mm)을 사용하도록 설계되었습니다. 잘못된 커버슬립을 사용하면 이미지의 강도와 품질에 심각한 영향을 미칠 수 있습니다. - 장착 된 조직을 실온에서 하룻밤 동안 배양하여 마운팅 매체가 건조하게하고 이미징이 될 때까지 슬라이드를 4 °C에서 저장합니다.
5. 이미지 수집 및 이미지 처리
참고: 공초점 이미지는 초고해상도(SR) 모드43및 63x 대물렌즈에서 32채널 Airyscan 검출기가 장착된 LSM 880 공초점 현미경으로 촬영되었습니다.
- 목표에 약간의 침지 오일을 추가합니다.
- 침지 오일을 향한 유리 커버슬립을 사용하여 장착된 조직 샘플을 포함하는 현미경 슬라이드를 현미경 단계에 놓습니다.
- 샘플에 초점을 맞추고 이미지 수집 소프트웨어를 사용하여 이미징 매개 변수를 설정합니다.
- 각 독립적인 실험에 대해 동일한 이미지 수집 설정과 x, y 및 z 해상도에 대해 최적의 매개변수를 사용합니다. 이미지의 z 스택을 획득할 때 목표를 빠르고 정확하게 이동하려면 압전 기반 포커스 시스템이 필요합니다.
참고: 모발 세포의 전체 정점 영역을 이미지화하려면 최적의 설정을 사용하여 스테레오실리아에서 모발 세포 체의 정점 절반까지 이미지의 z 스택을 수집합니다. 소포 와 같은 입자의 이미징을 보장하기 위해 모발 세포를 따라 큰 z 스택을 수집하는 것이 중요합니다. - 이미지 수집 소프트웨어를 사용하여 Airyscan 3D 재구성 알고리즘을 사용하여 자동 기본 데콘볼루션 필터 설정을 사용하여 원시 공초점 이미지를 처리합니다.
- 이미지 처리 소프트웨어에서 공초점 이미지를 열어 밝기와 대비를 조정하고 배율 막대를 추가하고 최종 그림에 대한 이미지를 내보냅니다.
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Representative Results
우리는 텍사스 레드 (dextran-TR)로 표지 된 3 kDa dextran 형광으로 야생 형 산후 - 6 (P6) 마우스에서 코르티 방종의 장기를 2 시간 배양 한 후 모발 세포의 강력하고 구체적인 라벨링을 관찰했습니다(그림 2A-B). Dextran 라벨링은 코르티 의 기관의 기저, 중간 및 정점 영역에서 내부 및 외부 모발 세포(IHC 및 OHC)에서 관찰되었다(도2B).
형광 표지된 파할로이드는 필라멘트 액틴(F-actin)을 역염색하고 액틴 계 모발 세포 스테레오실리아를 시각화하는 데 사용되었다. 우리는 또한 짧은 배양 시간에 유사한 실험을 수행하고, 우리는 모발 세포 체체에 dextran-TR 축적을 관찰했지만, 신호는 2 시간 배양에서보다 약하고 더 많은 변수였다(그림 2C).
우리는 다음으로 모발 세포의 스테레오실리아 및 세포 체를 모두 이미지화하고 그들의 세포체에 3 kDa dextran-TR을 혼입시킨 세포만이 그들의 스테레오실리아의 형광 라벨링을 보였다는 것을 관찰하였다(도3A). 스테레오실리아와 세포 체 라벨링 사이의 이러한 관계는 손상된 조직으로부터의 모발 세포에 결석하였고, 이는 또한 감각 상피의 여러 세포 유형에서 덱스트렌의 비특이적 라벨링을 제시하였다(도 2B의노란색 사각형, 및 도 3B). 중요한 것은, 우리는 MET 채널이18,23 (그림 3C)에위치한 짧은 스테레오실리아 행의 끝에서 농축과 함께 스테레오실리아를 따라 균일한 형광 신호를 관찰하였다. 또한, 우리는 모발 세포의 세포체와 인접한 지지 세포의 소포 와 같은 구조를 발견했습니다. 이들 세포에서 소포유사 섭취 패턴은 덱스트렌-TR이 또한 내분비증에 의해 채택될 수 있음을시사한다(도 3C).
여기에 설명된 프로토콜은 또한 더 큰 덱스트랜스의 섭취와 다른 덱스트랜스의 조합을 검사할 수 있게 한다. 텍사스 레드 (dextran-TR) 또는 플루오레세인 (dextran-FITC)으로 표지 된 10 kDa의 더 큰 덱스트론은 또한 모발 세포 및 지지 세포의 세포체에서 소포와 같은 패턴을 생성했으며, 모발 세포막 주변에 누덕된 패턴으로 축적된다(그림4A,B). 상기 10kDa dextran-TR은 또한 모든 모발 세포의 3개의 스테레오실리아 행을 표면적으로 표기(도4A,인세트)로 표시하였을 수도 있는데, 이는 아마도 모발 세포 혈장막(44,45,46)의음전하 표면으로 인한 것일 수 있다. 우리는 다음으로 코르티 이식의 기관에서 3 kDa dextran-TR 및 10 kDa dextran-FITC의 섭취를 동시에 조사했습니다. 3 kDa dextran-TR의 경우, 우리는 확산과 소포 와 같은 패턴을 모두 관찰했습니다. 그러나, 10 kDa dextran-FITC는 소포형 패턴만을나타냈다(도 4C). 이러한 데이터는 덱스렌의 크기에 의존하는 적어도 두 개의 뚜렷한 메커니즘에 의해 덱스렌 섭취가 발생한다는 것을 시사한다.
다음으로 3kDa dextran-TR의 섭취에 기능성 MET 채널이 필요한지 여부를 평가했습니다. 이를 위해, 우리는 MET 채널 차단제 (네오마이신 및 아밀로라이드)13,14,47 또는 Ca2+ 킬레이터 BAPTA의 존재에 코르티 이식의 기관에서 모발 세포에 dextran 혼입을 테스트, 이는 팁 링크를 끊고채널25,48,49의게이팅을 방지하여 MET 전류를 폐지 . 이러한 실험에서, 조직 이식은 이전에 대응 MET 차단제의 존재에 3kDa dextran-TR을 첨가하기 전에 네오마이신(500 mM), 아밀로라이드(150 mM), 또는 BAPTA(5mM)로 30분 동안 배양하였다. BAPTA 또는 MET 채널 차단제의 존재는 스테레오실리아 라벨링(도5A)과모발 세포에서 3 kDa dextran-TR의 섭취를 방지하였다(도5B). 그러나, MET 채널의 봉쇄는 소포와 같은패턴(그림 5B)을보존하이며, 이는 이러한 섭취 패턴이 기능적 MET 채널과 무관하다는 것을 나타낸다. 유사한 결과 TMC1/TMC2 이중 녹아웃 마우스에서 머리 세포에서 관찰 되었습니다., MET 부족27. 흥미롭게도, 이들 소포형 구조는Na+-H+교환기를 억제하고 이에 의해 내분비증을 억제하는 것으로 알려져 있는 아밀로라이드의 존재에서 관찰할 수 없었다 50,51. 이 결과는 3kDa dextran-TR가 두 개의 다른 통로를 통해 머리 세포를 입력한다는 것을 나타냅니다, 소포 같이 구조물을 관련시키는 더 큰 덱스트랜스에 일반적인 1개 및 기능적인 MET 채널에 의존하는 또 다른.
그림 1 : 코르티의 뮤린 기관의 해부 단계. (A)해부에 필요한 깨끗한 면적과 재료. (B)노출 된 마우스 두개골. 집게는 코를 향해 접힌 피부를 잡고 있습니다. 검은 선은 뇌의 제거에 필요한 두 절개를 나타냅니다. (C)주걱으로 뇌를 제거 할 수 있도록 두개골을 절개하고 열었습니다 (오른쪽). (D)뇌 제거 후 두개골 과 측두골. (E)P35 플레이트에 시간뼈(파선된 검은색 사각형)를 포함한 두개골을 절제하여 매체로 덮었다. (F)절제된 달팽이관. (G)유리 우울증 판의 우물에 코르티의 두 해부 기관. (H)이미징준비가 된 유리 커버슬립에 샘플을 장착하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 모발 세포 는 3 kDa 덱스트렌-TR을 섭취한다. (a)1.08 kDa의 분자량에 해당하는 6개의 포도당 분자를 함유하는 텍사스 적색 표지덱젠(dextran-TR)의 개략적 표현. succinimidyl 에스테르 반응은 포도당 단량체에 텍사스 빨간 분자 (마젠타)를 연결합니다. (B)대표적인 공초점 이미지는 6일령 마우스로부터 코르티의 전체 장기에 걸쳐 3 kDa dextran-TR을 가진 감각 모발 세포(HC)의 특정 라벨링을 나타낸다. 기저 (BA), 중간 (MD), 및 기관의 정점 (AP) 영역이 표시됩니다. 노란색 사각형은 조직 손상된 영역을 나타냅니다. (C)3 kDa dextran-TR 형광 후 30, 60, 90, 또는 120 분 인큐베이션 코르티 이피의 기관과 함께 녹색 (상단 이미지)에서 F-액틴과 병합 된 마젠타에 나타내고 그레이 스케일 (하단 이미지)에서 독립적으로. 이미지 디스플레이 범위는 3 kDa dextran-TR 형광의 시각화를 위해 각각의 회색 이미지에서 선형적으로 조정되었습니다. 배율 막대 = 20mm. 이 수치는27에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 3 kDa dextran-TR로 모발 세포 체 및 스테레오실리아 라벨링. (A)세포체에 3kDa dextran-TR 형광(magenta)을 표시하는 공초점 이미지와 파할로이드로 염색한 스테레오실리아를 F-액틴(녹색)으로 표시하여 모발 세포 경계와 스테레오실리아를 시각화한다. 외부 모발 세포 (OHC)와 내부 모발 세포 (IHC)의 한 행의 세 행이 표시됩니다. 스케일 바 = 20 mm.(B)손상된 조직 영역의 공초점 이미지는 3 kDa dextran-TR 형광을 나타내는 (마젠타) 세포 체체 및 스테레오실리아. 노란색 화살표는 비 감각 지지 세포의 라벨링을 나타냅니다. 스케일 바 = 20 mm.(C)외부 모발 세포 (OHC, 상단) 및 내부 모발 세포 (IHC, 하단)의 세포 체체 및 스테레오실리아에서 3 kDa dextran-TR 형광의 클로저보기. 배율 막대 = 5mm. 이 수치는27에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 더 큰 10 kDa dextran의 라벨링 및 3 및 10 kDa dextran의 조합. (a)모발 세포체(위쪽)와 스테레오실리아(아래) 수준에서 모발 세포의 공초점 이미지를 10 kDa dextran-TR로 배양하였다. 덱스론 형광 신호는 녹색으로 F-액틴과 병합된 자홍색으로 표시되고 그레이스케일에서는 독립적으로 표시됩니다. IHC의 부부는 10 kDa dextran-TR로 관찰된 스테레오실리아의 표면 적 라벨링을 감상하기 위해 인셋에서 더 높은 배율로 도시된다. 스케일 바 = 5 mm.(B)10 kDa dextran-FITC로 배양된 모발 세포의 공초점 이미지는 A.(C)모발 세포 체체에서의 모발 세포의 공초점 이미지(상단) 및 스테레오실리아(아래) 수준으로 동시에 배양된 3 kDa dextran-FITC 및 10 kDa dextran-FITC및 독립적인 채널을 사용하여 이미지화하였다. 오른쪽 패널에는 F-액틴(파란색), 10kDa dextran-FITC(녹색), 3kDa dextran-TR(마젠타)이 팔로이드(파란색)와 함께 표시됩니다. 스케일 바 = 20 mm, 및 소포 와 같은 섭취 패턴은 노란색 화살표로 표시됩니다. 이 수치는27에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 기능적 MET 채널은 3kDa dextran-TR 섭취량에 필요합니다. 대표적인 골체세포(A)또는 세포체(B) 수준에서모발 세포의 대표적인 공초점 이미지는 3 kDa dextran-TR을 배양한 후 BAPTA 또는 MET 채널 차단제아밀로라이드 및 네오마이신의 부재(control) 또는 존재상태에서 배양후이다. 3 kDa 덱스트렌-TR 형광은 자홍색으로 나타내고 있다. 조직은 모발 세포 스테레오실리아 및 경계(green)의 시각화를 위해 F-액틴에 라벨을 붙이도록 파할로이드로 반염색하였다. 흰색 화살표는 소포와 같은 구조를 가리킵니다. 외부 모발 세포 (OHC)와 내부 모발 세포 (IHC)의 한 행의 세 행이 표시되고, 스케일 바 = 20 mm. 이 수치는27에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 3 kDa dextran 텍사스 레드와 코르티 이식의 뮤린 기관에서 섭취 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 목표는 이전에 시험된 그 외 보다는 더 큰 분자가 또한 특히 청각 머리 세포를 표지하고 MET 채널을 통해 침투할 수 있었다는 것을 시험하는 것입니다. 유사한 실험 프로토콜은 이전에 FM1-43 (0.56 kDa)12,19,20 및 텍사스 적색 표지 된 아미노 글리코 시드 (1.29-1.43 kDa)와 같은 다른 형광 염료에 대한 모발 세포의 투과성을 평가하기 위해 이전에 사용되었습니다13,52. 이 형광 분자를 사용하여 모발 세포에 라벨을 붙이는 데 필요한 시간은 크기에 따라 다릅니다. 최대 라벨링은 FM1-4313,53,텍사스 레드 라벨 아미노글리코시드13,텍사스 레드 라벨 3 kDa dextran의 경우 1.5분 동안 몇 분이 필요합니다. 따라서, 긴 배양 시간은 짧은 배양 시간에 모발 세포 체의 최소한의 라벨링만을 보았기 때문에 이 실험에 매우중요합니다(도 2C). 우리는 이 실험에 대한 P6 마우스를 연구하기로 결정했는데, 왜냐하면 이 나이에, 대부분의 정점 및 기저 모발 세포는 형질전환 전류를 운반하고 TMC1 및 TMC2 단백질 을 모두 발현하기때문에, 12,18,54,55. MET 전류가 P6보다 일찍 존재하기 때문에, 특히 달팽이관12의기저 부근에서 어린 동물을 연구할 수 있어야 한다. 뼈 달팽이관의 해부가 더 어려워지기 때문에 더 오래된 동물을 공부하는 것은 더 어려울 수 있습니다 이 구조는56을ossify 계속으로.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 가장 중요한 것은 코르티 조직의 장기의 성공적인 해부 및 준비입니다(그림 1). 코르티 의 기관의 섬세한 구조와 뼈가 있는 달팽이관에 감싸는 것은 조직학적 및 생화학적 분석에 대한 도전을 제시합니다. 이 조직의 성공적인 해부를 위한 몇몇 상세한 프로토콜은 이전에 이 전표56,57,58 및 그 외59에간행되었습니다. 세포-세포 접합의 중단 및 청각 감각 상피 무결성의 손실은 최대 40 kDa의 덱젠의 섭취및 영향을 받는 세포의 라벨링으로 이어질 수있다 39,40. 이와 일치하여, 우리는 dextran 인큐베이션 전에 해부 동안 조직이 의도치 않게 집게로 손상되었을 때 모발 세포 및 주변 지지 세포의 비특이적 라벨링을 관찰하였다(도2B 및 도 3B). 연습과 인내 이외의 코르티의 그대로 기관을 해부에 숙련에 도달하는 트릭이나 지침이 없습니다. 그러나, 조직 해부 및 섭취 실험 동안 1-2 mMCa2+의 존재는 MET 채널에 기계적 힘을 전달하고 이에 의하여 MET 채널 기능을 보존하는 팁 링크의 무결성을 유지하는 데 매우 중요하다. 일단 조직이 4% PFA로 고정되면 완충제 또는 매체에 칼슘의 존재는 사소한 것이 됩니다.
이 연구의 한계 중 하나는 덱스 렌 분자의 이기종 특성에 있습니다. 류코노스토크 박테리아에 의해 정교화된 덱젠은 약 95% 알파-(1-6) D-링키지(도2A)로구성된 무수소포도당의 중합체이다. 나머지 링키지는 길이와 상관 관계가있는 덱스터의 분기를 차지하므로 더 낮은 분자량의 덱스터는 더 로드와 같으며 더 큰 덱스 트랜스가 폴리 디분산60인동안 더 좁은 크기 분포를 갖습니다. 따라서, 3 kDa dextran의 각 제제에서 분자의 실제 분자량은 형광분자(61)를포함하는 1.5~ 3.0 kDa 범위의 다. 추가적으로, 형광 표지된 덱스렌은 덱스렌에 부착된 텍사스 레드 분자의 수(라벨링 정도)가 다르다. 라벨의 낮은 정도가 현미경 검사법에 의해 형광 표지 dextran을 검출하는 기능을 방해하기 때문에 적어도 0.4의 라벨의 정도를 가진 dextran을 사용하는 것이 좋습니다. 고칠 수 있는 버전에서 덱스렌 및 라이신 잔기와 결합된 형광 염료는, 덱스렌의 전체 전하를 결정할 것이다. 이는 MET 채널의 양이온선택도가 바람직하게는양이온dextran(27)을차지하기 때문에 중요한 고려사항이다. 마지막으로, 이러한 실험에 표시된 해상도에 도달하기 위해서는 리신 고칠 수 있는 덱스트른이 필요합니다. 고칠 수 없는 덱스렌은 정확한 국소화 및 시각화를 방해하는 조직으로 계속 확산될 것입니다.
코르티 샘플의 장기를 이미지화하는 데 사용되는 Airyscan 검출기가 장착된 LSM 880 공초점 현미경은 기존의 공초점 현미경62에비해 2배의 해상도와 더 나은 신호 대 잡음 비(SNR)를 제공했습니다. 따라서, 이 현미경은 우리가 세포 체체에 있는 강력한 dextran 축적을 관찰할 뿐만 아니라 또한 체체에 있는 스테레오실리아 팁 그리고 소포 같이 패턴에 dextran의 축적을 정확하게 하기 위하여 허용했습니다. 종래의 공초점 현미경은 세포체에서 형광 덱스트란의 축적을 시각화하고 정량화할 수 있지만, 더 짧은 스테레오실리아 행의 끝에서 3개의 스테레오실리아 행과 덱스트란의 정확한 국소화를 구별하기는 어려울 것이다. SNR이 Airyscan 검출기로 도달한 것보다 낮을지라도, LSM 880 Airyscan 공초점으로 달성한 것과 유사한 해상도는 오버샘플링 및 데콘볼루션이 있는 기존의 공초점 현미경을 사용하여 도달할 수 있습니다.
기능성 MET 채널을 위한 분석하기 위하여 3 kDa dextran-TR의 사용 이외에, 이 프로토콜은 모든 덱스트랜스 시험된 세포 내비친 세포 같이 패턴을 내비탈 세포 같이 패턴을 드러내기 때문에 머리 세포에 있는 내분비 프로세스를 공부하기 위하여 추가 로 사용될 수 있었습니다. 이 과정은 우리의 일의 초점이 아니었고, 이 현상을 완전히 특성화하기 위하여 추가 연구가 요구될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 공초점 이미지 수집을 지원하기 위한 NICHD 현미경 검사법 및 이미징 코어의 빈센트 슈람과 식민지 관리 및 마우스 관리에 귀중한 도움을 준 Tsg-Hui Chang에게 감사드립니다. 이 연구는 NINDS, NIH, 베데스다, MD의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었으며, K.J.S. A.B.는 NINDS, NIH의 교내 연구 프로그램과 교내 연구 프로그램에서 로버트 웬홀드 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었습니다. NIDCD의
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
| C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
| Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
| Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
| Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
| Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
| Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
- Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
- Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
- Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
- Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
- Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
- Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
- Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
- Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
- Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
- Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
- Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
- Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
- Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
- Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
- Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
- Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
- Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
- Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
- Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
- Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
- Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
- Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
- Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
- Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
- Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
- Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
- Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
- Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
- Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
- Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
- Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
- Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
- Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
- Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
- Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
- Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
- Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
- Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
- Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
- Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
- Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Granath, K. A.
- Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
