Summary
ここでは、機能性メカノトランスダクションチャネルを有する聴覚毛髪細胞における3kDaテキサス赤ラベルデキストランの取り込みを視覚化する方法を提示する。さらに、3〜10kDaのデキトランスは、コルチの器官の毛髪および支持細胞におけるエンドサイトーシスを研究するために使用することができる。
Abstract
毛細胞メカノトランスダクション(MET)チャネルは、聴覚において重要な役割を果たしている。しかしながら、METの分子同一性と構造情報は不明のままである。毛髪細胞の電気生理学的研究により、METチャネルはコンダクタンスが大きく、スタイリル色素やテキサス赤色のアミノグリコシド系抗生物質を含む比較的大きな蛍光カチオン分子に透過性であることが明らかになった。本プロトコルでは、機能的METチャネルのアッセイに使用できるコルチ外植物の器官の毛細胞における蛍光デックストランスの取り込みを可視化し評価する方法について述べた。3 kDa テキサスレッドラベルデキストランは、1~2時間のインキュベーション後に機能性聴覚毛髪細胞に特異的にラベルを付けることがわかりました。特に、3 kDa dextranは2つの短い立体列にラベルを付け、機能的なMETチャネルが存在する場合に拡散パターンで細胞体に蓄積する。毛髪細胞および周囲の支持細胞の細胞体内で、さらなる小胞様の標識パターンが認められた。我々のデータは、3 kDaテキサスレッドデキストランを使用して、細胞染料取り込みのための2つの経路を視覚化し、研究することができることを示唆している。機能的なMETチャネルおよびエンドサイトーシスを通る毛髪細胞特異的なエントリルート、より大きなデキストランにも利用できるパターン。
Introduction
内耳の毛細胞は、音を検出し、最終的に私たちの脳によって解釈される電気信号の機械的刺激を隠す感覚細胞です。これらの細胞は、立体領域1、2から突き出た立体基のフィラメントの3列の階段状の束を有する。機械的刺激は、ステレオシリアフィラメントを最長の列に向かって偏向させ、メカノトランスダクション(MET)チャネル3の開口部を引き起こす。METチャネルの開口部は、細胞を脱分極し、その結果、毛細胞の基底領域でシナプス小胞の放出を知らせるカチベーションの流入につながります。
聴覚に不可欠なMETチャネルの生物物理学的特性は広範囲に特徴付けられている。他の特性の中でも、これらのチャネルはカチオン選択的であり、比較的大きなコンダクタンス(低Ca2+で150〜300 pS)4、5、6、7、8、9、10を有する。驚くべきことに、FM1-43およびテキサス赤標識アミノグリコシドのような大きな蛍光分子は、METチャネルの過透過遮断薬であり、蛍光顕微鏡11、12、13、14を用いて可視化することができる毛髪体内での蓄積をもたらす。逆に、METチャネルの分子同一性と構造とその透過経路は、依然として不可解なままである。実験証拠の増加は、膜貫通様チャネルタンパク質1(TMC1)が成熟した毛細胞15、16、17、18、19におけるMETチャネルの成分であることを示す。膜貫通チャネル1(TMC1)の突然変異は、METチャネル特性19、20、21、22を変化させ、難聴を引き起こす。また、TMC1はMETチャネル18,23の部位に局地化し、METチャネル24,25に機械的力を伝達するチップリンクと相互作用する。さらに、最近のバイオインフォマティクス解析では、TMCタンパク質がメカ感受性チャネルTMEM63/OSCAタンパク質およびTMEM16タンパク質、カルシウム活性塩化物チャネルおよび脂質スクランブラース26、27、28に関連する進化的なものであると同定されている。これらのタンパク質の関係に基づくTMC1の構造モデルは、タンパク質-脂質界面27における大きな空洞の存在を明らかにした。この空洞は、常染色体優性難聴(DFNA36)27、29、30、31、32を引き起こす2つのTMC1変異を収容し、また、空洞内の残基に対するシステイン突然変異体の選択的改変はMETチャネル特性28を変化させ、METチャネルの透過経路として機能し得る可能性があることを示す。TMCタンパク質におけるこの予測空洞の大きなサイズは、METチャネルに浸透する大きな分子の能力を説明することができる。METチャネルに異常に大きな浸透経路が含まれているという予測をテストし、TMC1で観察された空洞の大きさの限界を押し広げるために、テキサスレッドで蛍光標識された3kDaデキストランを大きな分子を有するコルチ外植体の器官で取り込み実験を行うプロトコルを開発した。
デキストランは、α-1,6グリコシド結合によって結合された多くのD-グルコース分子から構成される複雑な分岐多糖である。水、低細胞毒性、およびバイオインナーティの高い溶解性は、いくつかの細胞プロセスを研究するための汎用性の高いツールになります。さらに、デキストランは、サイズの広い範囲で利用可能であり、蛍光色に複数の色の蛍光体で標識されています。蛍光標識デックストランスは、細胞および組織透過性研究33、34において一般的に使用され、複数の細胞系システム35、36、および神経追跡37、38におけるエンドサイトーシスを研究する。聴覚分野では、デキストラン分子はまた、コルチ39、40のチンチラ器官の強烈な騒音にさらされた後の細胞接合の破壊および聴覚上皮完全性の喪失を評価するためにも使用されている。
本研究では、最小(3~10kDa)の蛍光デクトランスの特性を利用して、マウス内耳毛髪細胞の取り込み実験を行い、内耳毛細胞METチャネルの透過経路の大きさを調べた。また、エアリスキャン検出器を搭載したレーザー走査共焦点顕微鏡(LSM)880を用いて、立体性と聴覚毛細胞の細胞体で蛍光デキストランを可視化し、局在化しました。
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Protocol
動物のケアと実験手順は、国立神経障害・脳卒中研究所(KJSに#1336動物プロトコル)の動物ケアおよび使用委員会によって承認された実験動物のケアと使用のガイドラインに従って行われました。
1. マウス
- ごみの生年月日を制御し、子犬の年齢を追跡するために動物施設で繁殖するC57BL / 6J野生型の繁殖ペアのカップルを設定します。
2. コクレア解剖
- 分節を行うために、実体顕微鏡に近いきれいな空間を設定します(図1A)。70%エタノールを使用して、スペースや周囲をきれいにし、きれいなベンチパッドを置きます。動物の死骸を捨てるには、医療病理学的廃棄物(MPW)ビニール袋が必要です。
- ライボヴィッツのL15メディアで35mmの料理を数種類用意してください。
注:ライボヴィッツのL-15細胞培地には、チップリンクの完全性を維持するために必要な1~2 mM Ca2+が含まれており、細胞の健康と生存を改善するために必須アミノ酸、ビタミン、ピルビン酸ナトリウムが含まれています。血清は、その不十分な組成およびデキストランとの潜在的な干渉による実験的変動を避けるために除外された。 - 出生後6日(P6)マウスを切断することによって安楽死させる。
注:6日齢のマウスは、吸入麻酔薬に対してやや耐性があります。イソフルランまたは長期のCO2曝露(最大50分)を安楽死に使用することができますが、死亡を確実にするために二次的な物理的方法が推奨されます。 - 手術はさみを使用して、前部から後端まで、そして外耳道を横切って表面的な切り傷を作ることによって、頭蓋骨の皮膚を取り除きます。
- 皮膚を鼻に向かって折り畳んで、頭蓋骨を露出させる(図2B)。
- 頭蓋骨の後部から前部へ、そして目線を越えて切開する(図2B-C)。
- 頭蓋骨を2つの半分に分け、頭の骨を露出させるために小さなへらを使って脳を取り除きます(図2C-D)。
- 小さなはさみで、側頭骨の周りを切り取り、組織を切除する。
- 両方の側頭骨を35mm皿に入れ、L15メディアで覆われていることを確認します(図2E)。
注: 次の手順は、立体顕微鏡で実行されます。黒い背景は、通常、細かい解剖ステップ中に組織を視覚化するのに役立ちます。 - 広視野接眼レンズ(10X倍率(WF10X)と外付け交流(AC)ハロゲン光源を備えた立体顕微鏡の下で、周囲のコクチー組織、半規管、手術鉗子を有する前庭器官を取り除く(図2F)。
- デキストランとL15の媒体が人工内管に入るようにするには、解剖された人工内液に対して2つの穿刺境界を行い、1つは円形の窓に、もう1つは尖部の人工内口領域で行う。
- ライボヴィッツのL15メディアを9ウェルのガラスのうつ病プレートから各ウェルに300 mL追加します。
- 各井戸に少なくとも3つの解剖された内痛を置きます。
3. デキストランラベリング
- 最終濃度10mg/mLで、Ca2+およびMg2+(HBSS-CFM)を使用せずにハンクスのバランスの取れた塩溶液中のデキストランを再構成します。このストック溶液は、不透明な黒いチューブ(光から保護)で引用し、使用するまで-30°Cで保存する必要があります。
注: このプロトコルの成功の結果のためには、リジン修正可能デキストランの使用が重要です。 - ライボヴィッツのL15培地の500mLで2mg/mLの最終濃度で各デキストランを準備します。
- コクレアから培地を取り出し、関心のあるデキストランを含むライボヴィッツのL15培地を2mg/mLの最終濃度で追加します。
注: MET チャネルの比率は、残りの41、42で開いていますが、デキストランインキュベーションは、MET チャネルのオープン確率を高めるために、外植物の緩やかな揺れで実行されました。 - 傾いた角度25°の3次元シェーカーを使用して、穏やかな振とう(25rpm)で室温で2時間インキュベートします。
注:蛍光標識デキストランは、可能な限り光から保護する必要があります。2時間のインキュベーション中にデキストランを保護するために、9ウェルガラス板を細胞培養P150皿の中にアルミニウム箔で包んで置きます。
4. イメージング用サンプル調製
- デキストランでインキュベートした後、培地で2回、HBSSで1回、ティッシュを2分間洗います。
- ハンクスのバランスのとれた塩溶液(HBSS)で4%のパラホルムアルデヒドで30分間室温で組織をインキュベートします。
注意:ホルムアルデヒドへの暴露は、目、鼻、および上気道に刺激を与えることができます。特定の個体では、ホルムアルデヒドへの皮膚暴露を繰り返すと、アレルギー性皮膚炎を引き起こす可能性のある感作を引き起こす可能性があります。ホルムアルデヒドは、既知のヒト発がん性物質であり、生殖の危険性が疑われる。 - HBSSで固定組織を素早く、穏やかに洗浄し、パラホルムアルデヒドを除去します。
注:側頭骨の脱石は、この発生段階の内臓では必要ありません。 - 渦巻帯靭帯と微細な先端鉗子を持つテクトリアル膜を取り除き、コルチの器官を解剖します(図2G)。
- すべての小片のティッシュを取り除き、HBSSでティッシュを洗う。
- 蛍光標識ファロジン(TR-またはFITC標識デキストランの取り込み試験時に緑色または赤色に結合)を含むPBS中の0.5%トリトンX-100で組織を透過して、F-actinの標識を30分間1:20に希釈し、視覚化するアクチンベースのステレオシリア。
- HBSSバッファーで2分間2~3回組織を洗浄し、トリトンとファロイジンの過剰を除去し、PBSで1回ずつ塩を除去します。
- コルチ組織の器官を顕微鏡のスライドに取り付け、取り付けメディアで覆います。
注:組織を取り付ける際は、毛髪の立体性を含む組織の側面がカバースリップに向かっていることを確認してください。 - 取り付けメディアの追加中に発生する可能性のある気泡を取り除き、カバースリップの配置中に新しい気泡が発生するのを防ぎます。
メモ:取り付けメディアの追加中に発生した気泡はピペットで吸い込まれます。カバースリップの下に気泡が閉じ込められるのを防ぐには、カバースリップの端をサンプルの近くに置き、シーズ上のカバースリップを慎重にゆっくりと下げる。 - 取り付けメディアで組織をガラスカバースリップで覆う (図 2H)。
注: 0.4 以上の開口を持つ目的は、#1.5 カバースリップ(厚さ 0.17 mm)を使用するように設計されています。誤ったカバースリップを使用すると、画像の強度と品質に重大な影響を及ぼす可能性があります。 - 取り付け済み組織を室温で一晩インキュベートし、取り付けメディアを乾燥させ、スライドをイメージングまで4°Cで保存します。
5. 画像取得と画像処理
注:共焦点画像は、超解像度(SR)モード43と63xの目的で32チャンネルのエアリスキャン検出器を備えたLSM 880コンフォーカル顕微鏡で撮影されました。
- 目的に浸漬油の小さな滴を追加します。
- 実装された組織試料を含む顕微鏡スライドを、浸漬油に面したガラスカバースリップで顕微鏡ステージに配置します。
- サンプルに焦点を当て、画像取得ソフトウェアを使用してイメージングパラメータを設定します。
- X、Y、Z の解像度に対して、同一の画像取得設定と最適なパラメータを各独立実験に使用します。画像の z スタックを取得する際に、目的を素早く正確に移動するには、ピエゾ駆動のフォーカス システムが必要です。
注: ヘア セルのポペカル領域全体をイメージするには、最適な設定を使用して、ステレオシリアからヘア セルボディのポペカルハーフまでのイメージの Z スタックを収集します。小胞状粒子のイメージングを保証するために、毛髪細胞に沿って大きなzスタックを収集することが重要です。 - 画像取得ソフトウェアを使用して、Airyscan 3D再構築アルゴリズムを使用して生の共焦点画像を自動デフォルトのデコンボリューションフィルタ設定で処理します。
- 画像処理ソフトウェアで共焦点画像を開いて、明るさとコントラストを調整し、スケールバーを追加し、最終的な数値の画像をエクスポートします。
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Representative Results
我々は、テキサスレッド(dextran-TR)で蛍光標識された3kDaデキストランを有する野生型出生後6日目(P6)マウスからのコルチ外植物の器官の2hインキュベーション後の毛細胞の堅牢かつ特異的な標識を観察した(図2A-B)。デキストランの標識は、コルチの器官の基底、中、および尖部領域での内側および外側の毛細胞(IHCおよびOHC)の両方で観察された(図2B)。
蛍光標識ファロイジンは、フィラメントアクチン(F-アクチン)に対抗し、アクチン系毛髪ステレオシリアを可視化するために使用した。また、インキュベーション時間が短い場合も同様の実験を行い、毛髪体内でデキストラン-TRの蓄積を観察したが、シグナルは2hインキュベーションの場合よりも弱く、より可変であった(図2C)。
次に、毛髪細胞の立体体と細胞体の両方を画像化し、細胞体に3kDa dextran-TRを組み込んだ細胞のみが立体細胞の蛍光標識を示すことを観察した(図3A)。この立体と細胞体の標識との関係は、損傷した組織からの毛髪細胞には存在せず、これはまた、いくつかの細胞タイプの感覚上皮(図2Bの黄色の正方形)におけるデキストランの非特異的な標識を提示した。.重要なことに、METチャネルが位置する短い立体列の先端部で、ステレオシリアに沿って均一な蛍光信号を観測しました18,23 (図3C)。また、毛髪細胞の細胞体や隣接する支持細胞にも小胞のような構造が見えました。これらの細胞における小胞様の取り込みパターンは、デキストラン-TRもエンドサイトーシスによっても取り込むことができることを示唆している(図3C)。
ここで説明するプロトコルは、より大きなデックストランスの取り込みおよび異なるデックストランスの組み合わせの検査も可能にする。テキサスレッド(デキストランTR)またはフルオレセイン(dextran-FITC)で標識された10kDaのより大きなデキストランはまた、パッチ状のパターンで毛細胞膜の周りに蓄積することに加えて、毛細胞および支持細胞の細胞体内に小胞のようなパターンを作り出した(図4A,B)。10kDaデキストランTRはまた、表面的に表面的に全ての毛細胞の3つの立体列(図4A、差込)、おそらく毛細胞の毛細胞の表面に負帯電した表面に起因する44、45、46。次に、コルチ外出物の器官における3kDaデキストランTRと10kDaデキストラン-FITCの取り込みについて同時に調べた。3 kDa デキストラン-TR では、拡散と小胞状のパターンの両方を観察しました。しかし、10 kDa デキストラン-FITC は小胞のようなパターンしか表示しませんでした (図 4C)。これらのデータは、デキストランのサイズに依存する少なくとも 2 つの異なるメカニズムによってデキストランの取り込みが起こることを示唆しています。
次に、3 kDa デキストラン-TR の取り込みに機能 MET チャネルが必要かどうかを評価しました。これを行うために、METチャネルブロッカー(ネオマイシンおよびアミロリド)13、14、47またはCa2+キレートナーBAPTAの存在下でコルチ外植物の器官からの毛細胞へのデキストランの組み込みをテストし、先端リンクを切断し、チャネル25、48、49の合致を防ぐことによってMET電流を廃止する。これらの実験では、組織外植者を、ネオマイシン(500mM)、アミロライド(150mM)、またはBAPTA(5mM)を加えてから3kDaデキストラン-TRを添加する前に、対応するMETブロッカーの存在下で30分間インキュベートした。BAPTA または MET チャネルブロッカーの存在により、ステレオシリア標識(図 5A)と、ヘア セル内の 3 kDa デキストラン-TR の取り込みが妨げられました (図5B)。しかし、METチャネルの封鎖は小胞様パターン(図5B)を保持し、この取り込みパターンが機能的METチャネルから独立していることを示す。同様の結果は、MET27を欠くTMC1 / TMC2ダブルノックアウトマウスの毛細胞で観察されている。興味深いことに、これらの小胞様構造は、Amilorideの存在下では観察できなかったが、これはNa+-H+交換体を阻害し、それによってエンドサイトーシス50、51を阻害することが知られている。これらの結果は、3kDa dextran-TRが2つの異なる経路を介して毛細胞に入ることを示している。
図1:コルチのマウス器官の解剖のステップ。(A) 清浄領域と、解剖に必要な材料。(B) 露出したマウスの頭蓋骨。鉗子は、鼻に向かって折り畳まれた皮膚を保持しています。黒い線は、脳の除去に必要な2つの切開を示す。(C) 切開し、頭蓋骨を開いて、へらで脳を除去する(右側)。(D) 脳除去後の頭蓋骨と側頭骨。(E) メディアで覆われたP35板の側頭骨(破線の黒い四角)を含む切除された頭蓋骨。(F) 切除されたコクレ。(G) ガラスのうつ病板の井戸にコルチの2つの解剖された器官。(H) ガラスのカバースリップにサンプルを取り付けて、イメージングの準備が整いました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:毛髪細胞が取り込む 3 kDa デキストラン-TR.(A) 分子量1.08kDaに対応する6分子のグルコースを含むテキサスレッド標識デキストラン(dextran-TR)の模式図。スクシニミジルエステル反応は、テキサスレッド分子(マゼンタ)をグルコースモノマーに結び付ける。(B) 6日齢マウスからコルチの全臓器全体で3kDa dextran-TRを用いた感覚毛髪細胞(HC)の特異的標識を示す代表的な共焦点画像。基底(BA)、中央(MD)、および器官の尖部(AP)領域が示される。黄色の四角は組織損傷領域を示す。(C) 3 kDa デキストラン-TR 蛍光 30、60、90、または 120 分のコルチ外植物の器官とのインキュベーションは、緑色で F-actin と結合したマゼンタで示され (上の画像) グレースケール (下の画像).画像表示範囲は、3kDaデキストラン-TR蛍光の可視化のために、それぞれ独立してグレー画像のそれぞれで直線的に調整した。スケールバー = 20 mmこの図は27から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:3 kDaデキストラン-TRを使用した毛髪の体と立体標識(A)細胞本体に3kDaデキストラン-TR蛍光(マゼンタ)を表示する共焦点画像と、F-アクチン(緑色)を標識してF-actin(緑色)とラベルを付けて立体細胞の細胞に対する立体を示す図像を、毛髪細胞の境界と立体性を可視化する。外髪細胞(OHC)の3列と内毛細胞(IHC)の1列が示されている。スケールバー = 20 mm(B)細胞体および立体で 3 kDa デキストラン-TR 蛍光 (マゼンタ) を表示する損傷した組織領域の共焦点画像。黄色の矢印は、非感覚支持細胞の標識を示す。スケールバー = 20 mm(C)細胞体と外髪細胞(OHC、上)および内毛細胞(IHC、底部)の立体での3 kDaデキストラン-TR蛍光の近い図。スケールバー = 5 mmこの図は27から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:大きな10kDaデキストランと3と10 kDaデキストランの組み合わせのラベリング。(A) 10 kDa デキストラン-TR でインキュベートされた毛細胞体(上)およびステレオシリア(下)レベルの共焦点画像。デキストラン蛍光シグナルは、緑色で、グレースケールで独立してF-actinと結合したマゼンタで示される。IHCのカップルは、10 kDaデキストランTRで観察されたステレオシリアの表面的な標識を理解するために、インセットでより高い倍率で示される。 スケールバー = 5 mm (B) A. で表される 10 kDa dextran-FITC でインキュベートされた毛髪細胞の共焦点画像(C)毛髪細胞の共焦点画像(上)およびステレオシリア(下)レベルを、3 kDa デキストラン-TRと10 kDa デキストラン-FITCと同時に分離して画像化した。右パネルでは、F-アクチン(青)、10 kDaデキストラン-FITC(緑)、および3 kDaデキストランTR(マゼンタ)がファロイジン(青)と一緒に示されています。スケールバー= 20mm、小胞様の取り込みパターンは黄色の矢印で示されます。この図は27から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 機能 MET チャネルは 3 kDa デキストラン-TR 取り込みに必要です。非存在(コントロール)またはMETチャネルブロッカーアミロリドおよびネオマイシンの不在(制御)またはMETチャネルブロッカーの存在で3kDaデキストランTRをインキュベートした後、立体(A)または細胞体(B)レベルでの毛細胞の代表的な共焦点画像。3 kDa デキストラン-TR蛍光はマゼンタに示されている。組織は、毛髪細胞立体および境界(緑色)の可視化のためにF-アクチンを標識するファロイジンでカウンタ染色した。白い矢印は小胞のような構造を指しています。3列の外髪細胞(OHC)と1列の内毛細胞(IHC)が表示され、スケールバー= 20mmとなります。この図は27から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、3 kDa デキストランテキサスレッドとコルチ外植物のマウスの器官で取り込み実験を行う方法について説明します。この方法の目的は、以前にテストされた他の分子よりも大きい分子が、METチャネルを通して聴覚毛細胞を特異的に標識し、浸透させることができたかどうかをテストすることです。同様の実験プロトコルは、FM1-43(0.56 kDa)12、19、20およびテキサス赤色標識アミノグリコシド(1.29-1.43 kDa)13、52のような他の蛍光色素への毛髪細胞の透過性を評価するために以前に使用されてきた。これらの蛍光分子を使用して毛髪細胞を標識するために必要な時間は、そのサイズによって異なります。最大標識は、FM1-4313、53、テキサスレッドラベルアミノグリコシド13の場合は30〜60分、テキサスレッドラベル3 kDaデキストランの場合は1.5時間必要です。したがって、短いインキュベーション時間での毛髪の体の標識は最小限に抑えられるため、この実験では長いインキュベーション時間が重要です(図2C)。我々は、これらの実験のためにP6マウスを研究することを選んだのは、この年齢で、ほとんどの尖海および基底毛細胞が伝達電流を運び、TMC1およびTMC2タンパク質12、18、54、55の両方を発現するためである。MET電流がP6よりも早く、特にコクレア12の基部付近に存在するので、若い動物を研究することは可能であるべきである。この構造が56を骨化し続けるにつれて骨の内痛の解剖がより困難になるので、古い動物を研究することはより困難かもしれません。
このプロトコルには、いくつかの重要な手順があります。最も重要なものは、コルチ組織の器官の解剖と調製に成功した(図1)。コルチの器官の繊細な構造と骨の内臓の包み込みは、組織学的および生化学的分析のための課題を提示する。この組織の成功した解剖のためのいくつかの詳細なプロトコルは、以前にこのジャーナル56、57、58および他の59に掲載されています。細胞間接合の破壊および聴覚感覚上皮完全性の喪失は、最大40kDaのデキストランの取り込みおよび罹患した細胞39、40の標識に至る可能性がある。これに反して、デキストランインキュベーションの前に解剖中に組織が意図せずに鉗子で損傷を受けたときに、毛髪細胞および周囲の支持細胞の非特異的な標識が観察された(図2Bおよび図3B)。練習と忍耐以外のCortiの無傷の臓器を解剖する能力に達するためのトリックやガイドラインはありません。しかし、組織解剖および取り込み実験中に1~2mMのCa2+が存在することは、機械的な力をMETチャネルに伝達し、METチャネル機能を維持するチップリンクの完全性を維持するために重要である。組織が4%PFAで固定されると、緩衝液または培地中のカルシウムの存在は些細なものになる。
この研究の限界の1つは、デキストラン分子の異質な性質に存在する。ロイコノストク属細菌によって詳述されたデキストランは、約95%のα-(1-6)D-リンケージからなる無水グルコースのポリマーである(図2A)。残りのリンケージは、その長さと相関するデキストランの分岐を占めるので、低分子量のデキストランはよりロッド状であり、より大きなデキトランスは多分散60である一方でより小さいサイズ分布を有する。したがって、3kDaデキストランの各調製物における分子の実際の分子量は、蛍光分子61を含む1.5〜3.0 kDaの範囲である。さらに、蛍光標識デキストランは、デキストランに結合したテキサスレッド分子の数(標識の程度)が異なります。標識の程度が低いほど、顕微鏡で蛍光標識デキストランを検出する能力を妨げるので、少なくとも0.4の標識の程度を持つデキストランを使用することをお勧めします。この蛍光染料は、修正可能なバージョンのデキストランとリジン残基に結合し、デキストランの全体的な電荷を決定する。METチャネルのカチオン選択性は好ましくは取り込みカチオン性デキストラン27であろうので、これは重要な考慮事項である。最後に、リジン固定可能デキストランは、これらの実験で表示される解像度に到達するために必要である。固定できないデキストランは、組織に拡散し続け、正確な局在化と可視化を妨げます。
コルチサンプルの器官を画像化するために使用されるエアリスキャン検出器を装備したLSM 880共焦点顕微鏡は、従来の共焦点顕微鏡62と比較して2倍の分解能と優れた信号対ノイズ比(SNR)を提供しました。したがって、この顕微鏡は、細胞体における強いデキストランの蓄積を観察するだけでなく、立体の先端と細胞体の小胞状パターンでのデキストランの蓄積を正確に特定することを可能にした。従来の共焦点顕微鏡は、細胞体における蛍光デキストランの蓄積の視覚化と定量化を可能にするが、ステレオシリアの3列と短い立体列の先端部でのデキストランの正確な局在化を区別することは困難であろう。LSM 880 Airyscan共焦点で達成されたものと同様の解像度は、オーバーサンプリングとデコンボリューションを備えた従来の共焦点顕微鏡を使用して到達することができましたが、SNRはエアリスキャン検出器で到達したものよりも低くなります。
機能METチャネルのアッセイに3 kDa dextran-TRを使用することに加えて、このプロトコルは、テストされたすべてのデクストランスがエンドサイトーシスに似た細胞内小胞様パターンを明らかにするので、毛細胞のエンドサイトプロセスを研究するためにさらに使用することができる。このプロセスは私たちの仕事の焦点ではなく、この現象を完全に特徴付けるために追加の研究が必要になります。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
NICHD顕微鏡・イメージングコアのヴィンセント・シュラム氏が共焦点画像取得を支援してくれたことに感謝し、Tsg-Hui Chang氏はコロニー管理とマウスケアに非常に役立ててくれたことに感謝します。この研究は、NINDS、NIH、ベシスダ、MD、K.J.S.A.B.の壁内研究プログラムによって支援されました NINDSの壁内研究プログラム、およびロバート・ウェントホールド博士フェローシップによって支えられたの。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
| C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
| Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
| Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
| Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
| Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
| Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
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