Summary
כאן, אנו מציגים שיטה להמחיש את ספיגת 3 kda טקסס אדום התווית תוספי בתאי שיער שמיעתי עם ערוצי מכניזציה תפקודית. בנוסף, דקסטר של 3 – 10 kDa ניתן להשתמש כדי ללמוד endocyציטוזה בתוך השיער והתאים התומכים של האיבר של Corti.
Abstract
בערוץ המכונה (MET) מפעיל השער ממלא תפקיד חשוב בשמיעה. עם זאת, הזהות המולקולרית והמידע המבני של MET אינם ידועים. המחקרים האלקטרופיסיולוגיים של תאי השיער גילו שלערוץ MET יש היקף מוליכות גדול והוא חדיר למולקולות פלורסנט גדולות יחסית, כולל מספר צבעים בצבעי styryl ואנטיביוטיקה בצבע אדום עם התווית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה להמחיש ולהעריך את ספיגת דטרנס פלורסנט בתאי השיער של האיבר של האקריות Corti שניתן להשתמש בו כדי לטפל עבור הערוצים הפונקציונליים MET. מצאנו כי 3 kda טקסס אדום תווית תוספי במיוחד תוויות שיער שמיעתי פונקציונלי לאחר 1 – 2 h הדגירה. בפרט, 3 kda תוספי תוויות שתי שורות stereocilia קצר מצטבר בגוף התא בתבנית מפוזר כאשר ערוצי MET פונקציונלי נוכחים. דפוס נוסף שלפוחית העין של תיוג נצפתה בגוף התא של תאי השיער והתאים התומכים המקיפים. הנתונים שלנו מראים כי 3 kda טקסס-אדום תוספי ניתן להשתמש כדי להמחיש וללמוד שני מסלולים עבור ספיגת צבע הסלולר; מסלול כניסה ספציפי לתא שיער באמצעות ערוצי MET פונקציונלי והאנדוציטוזה, דפוס זמין גם dextran גדול.
Introduction
תאי השיער של האוזן הפנימית הם תאי החישה המזהים קול וסמויה את הגירוי המוכני באותות חשמליים, אשר מפורשים בסופו של דבר על ידי המוח שלנו. תאים אלה יש צרור בצורת גרם מדרגות של שלוש שורות של filaments מבוססי חוטים, המכונה stereocilia, אשר בולטות מאזור פסגה שלהם1,2. הגירוי המכני מהסיט את החוטים הסטריאוציאניים לעבר השורה הארוכה ביותר ומפעיל את פתיחת ערוצי המכונה3. פתיחת ערוצי ה-MET מובילה לזרם של הקטיונים המפתלים את התא וכתוצאה מכך מאותת על שחרורו של סינפסה באזור הבסיס של תא השיער.
המאפיינים הביופיזיים של ערוץ MET חיוני לשמיעה התאפיין בהרחבה. בין היתר, הערוצים הללו הם בררניים ובעלי מוליכות גדולה יחסית (150 – 300 pS ב-Ca+ 2 +)4,5,6,7,8,9,10. באופן מדהים, מולקולות פלורסנט גדול כגון FM1-43 ו-טקסס בעלת תווית של האדום מתויג של הערוץ ה, הנובע הצטברות שלהם בגוף תא השיער שניתן לדמיין באמצעות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית11,12,13,14. לעומת זאת, הזהות המולקולרית ומבנה ערוץ ה-MET ומסלול החדירות שלו נותרו חמקמקים. הגדלת הראיות הנסיוניות מצביעה על כך שחלבון הערוץ ה-transרפידה (TMC1) הוא רכיב של ערוץ ה-MET בתאי שיער בוגרים15,16,17,18,19. מוטציות בערוץ מדומה (TMC1) לשנות את מאפייני ערוץ MET19,20,21,22 ולגרום חירשות. בנוסף, TMC1 לאתר את ערוץ met18,23 ואינטראקציה עם הקישור טיפ אחראי על שידור הכוח המכני לערוץ MET24,25. יתר על כן, ניתוח ביואינפורמטיקה האחרונים זיהה את החלבונים tmc כמו האבולוציה הקשורים לערוצים מכנימתי TMEM63/osca חלבונים וחלבונים TMEM16, משפחה של ערוצי כלוריד סידן מופעל ו ליפידים26,27,28. מודל מבנית של TMC1 מבוסס על הקשר בין חלבונים אלה חשף נוכחות של חלל גדול בממשק חלבון-שומנים ממשק27. זה חלל הנמלים שתי מוטציות TMC1 שגורמות לאובדן שמיעה אוטוזומלית דומיננטי (DFNA36)27,29,30,31,32, ושינוי סלקטיבי של מוטציות ציסטאין עבור שאריות בחלל לשנות את המאפיינים של הערוץ28, המציין כי זה יכול לתפקד כנתיב חדירות של ערוץ MET. הגודל הגדול של חלל זה ניבא בחלבונים TMC יכול להסביר את היכולת של מולקולות גדולות לחלחל ערוץ MET. כדי לבדוק את החיזוי כי הערוץ MET מכיל מסלול חדירות גדול במיוחד כדי לדחוף את המגבלות של גודל החלל נצפתה ב TMC1, פיתחנו פרוטוקול לבצע ניסויים ספיגה באיבר של האקסון corti עם מולקולה גדולה יותר, 3 הודה תוספי באופן שכותרתו עם טקסס אדום.
Dextran הוא רב-סוכר מורכב בענף מורכב של מולקולות D-גלוקוז רבות כרוך על ידי alpha-1, 6 הקשרים הגליצידית. שלה מסיסות גבוהה במים, רעילות תא נמוכה, ו bioinertity להפוך אותו כלי רב-תכליתי ללמוד מספר תהליכים סלולריים. בנוסף, תוספי זמין במגוון רחב של גדלים ובעלי תווית fluorophores של מספר צבעים. בדרך כלל, משתמשים ב-dextrans באמצעות מחקר של תאים וחדירות רקמות33,34, כדי ללמוד אנדוקציטוזה במערכות סלולריות מרובות35,36, ועבור מעקב עצבי37,38. בשדה השמיעה, מולקולות תוספי גם נעשה שימוש כדי להעריך את ההפרעה של הצומת תא תא ואובדן של שלמות האפיתל חושי השמיעה לאחר החשיפה לרעש אינטנסיבי בעוגב צ'ינצ'ילה של corti39,40.
בעבודה זו, אנו לנצל את המאפיינים של חלק קטן (3 ו-10 kDa) הפלורסנט כדי לבצע ניסויים ספיגה בתאי שיער פנימי murine ולחקור את הגודל של הנתיב חדירות של תא האוזן הפנימית שיער פוגש ערוץ. בנוסף, השתמשנו מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בדיקת לייזר (lsm) 880 מצויד בגלאי airyscan כדי להמחיש ולהתאים את תוספי פלורסנט ב stereocilia ואת גוף התא של תאים שיער שמיעתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הטיפול בבעלי חיים והליכים ניסיוניים נערכו בעקבות ההנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, אשר אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים השימוש של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות שבץ (פרוטוקול בעלי חיים #1336 KJS).
1. עכברים
- הגדר כמה זוגות הרבייה של C57BL/6J פראי סוג להתרבות במתקן החי לשלוט על תאריך הלידה של הליטות ולעקוב אחר גיל של גורים.
2. ניתוח כנימת שבלול
- הגדר שטח נקי קרוב לstereomicroscope לביצוע הניתוח (איור 1א). השתמש 70% אתנול כדי לנקות את החלל והסביבה ולמקם פד ספסל נקי. שקית פלסטיק פתולוגית לפסולת רפואית (MPW) תידרש להשליך את הגוויות של בעלי החיים.
- הכינו מספר מנות 35 מ"מ עם מדיה L15 של ליבוביץ '.
הערה: המדיה הסלולרית של ליבוביץ ' מכילה 1 – 2 מ"מ Ca2 +, אשר נדרש כדי לשמור על שלמות של קישורי הקצה, ומכיל חומצות אמינו חיוניות, ויטמינים, ו פירובט נתרן כדי לשפר את בריאות התאים וההישרדות. סרום לא נכלל כדי להימנע השתנות ניסיוני בשל הרכב מוגדר גרוע שלה הפרעה פוטנציאלית עם dextran. - המתת החסד postnatal-יום 6 (P6) עכברים על ידי עריפת ראש.
הערה: עכברים בני 6 ימים עמידים במידה מסוימת להרדמה ממסים נדיפים. למרות שניתן להשתמשבחשיפות ממושכות (עד 50 דקות), מומלץ לעשות שימוש בשיטה פיזית משנית כדי להבטיח את המוות. - השתמש במספריים לניתוח כדי להסיר את העור של הגולגולת על ידי ביצוע חתך שטחי מן הקדמי אל הקצה האחורי ולרוחב תעלות השמיעה החיצונית.
- מקפלים את העור לכיוון האף כדי לחשוף את הגולגולת (איור 2ב).
- לעשות חתך מאחור לקדמת הגולגולת ולרוחב קו העין (איור 2ב-C).
- הפרידו את הגולגולת בשני חצאים והסירו את המוח בעזרת מרית קטנה לחשיפת עצמות הרקה (איור 2ג-ד).
- עם מספריים קטנים, חותכים מסביב לעצמות. הזמן, ובבלו את הרקמה
- מניחים את שתי עצמות הזמן בצלחת 35 מ"מ ולוודא שהם מכוסים L15 מדיה (איור 2E).
הערה: השלבים הבאים מתבצעים תחת הstereomicroscope. רקע שחור מסייע בדרך כלל להמחיש את הרקמה במהלך צעדי החיתוך העדינים. - תחת מstereomicroscope מצויד העין שדה (כוח ההגדלה 10X (WF10X) ומקור חיצוני זרם חילופין (AC) הלוגן), להסיר את הרקמה המקיפה שבלול, תעלות בחצי עיגול, ושיווי הבמה איברים עם מלקחיים כירורגי (איור 2F).
- כדי לאפשר את תוספי ו-L15 מדיה להיכנס צינור שבלול, לבצע שני הנקב הגבול על כנימת הפצע, אחד על החלון העגול ואחרים באזור השבלול האפובית פסגה.
- הוסף 300 mL של מדיה L15 של ליבוביץ בכל טוב מ 9-היטב משקע הזכוכית.
- מניחים לפחות שלושה שבלול בגזור על כל באר.
3. תיוג דקטרן
- מהווים מחדש את תוספי בפתרון מלח מאוזנת של הנקס ללא Ca2 + ו-Mg2 + (hbss-cfm) בריכוז הסופי של 10 מ"ג/mL. פתרון מניות זה חייב להיות מצוטט בצינורות שחורים אטומים (מוגן מפני אור) ומאוחסן ב-30 ° צ' עד השימוש.
הערה: השימוש בקוד ליזין לתיקון הוא קריטי לתוצאה מוצלחת של פרוטוקול זה. - הכינו כל תוספי בריכוז הסופי של 2 מ"ג/ml ב 500 מ ל של ליבוביץ ' s L15 מדיה.
- הסר את המדיה מתוך השבלול והוסף את המדיה הL15 של ליבוביץ ' המכילה דקטרן של עניין בריכוז הסופי של 2 מ"ג/mL.
הערה: למרות שחלק מערוצי ה-MET פתוחים במנוחה41,42, הדגירה של תוספי בוצעה עם טלטול עדין של האקסוצמחים כדי להגדיל את ההסתברות הפתוחה של הערוץ MET. - דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2 h עם טלטול עדין (25 סל ד) באמצעות שייקר תלת מימדי עם זווית מוטה של 25 °.
הערה: תוספי המסומן בתווית להיות מוגן מפני אור כאשר הדבר אפשרי. כדי להגן על תוספי במהלך הדגירה 2 h, למקם את 9-היטב צלחת זכוכית בתוך התרבות תא P150 תבשיל עטוף רדיד אלומיניום.
4. הכנה לדוגמא להדמיה
- לאחר הדגירה עם dextran, לשטוף את הרקמה עבור 2 דקות פעמיים עם מדיה ופעם עם HBSS.
- מודטת הרקמה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות עם 4% פאראפורמלדהיד בתמיסה מאוזנת מלח הנקס (HBSS).
התראה: חשיפה פורמלדהיד יכול להיות מרגיז את העיניים, האף, ואת מערכת הנשימה העליונה. אצל אנשים מסוימים, חשיפה לעור חוזר פורמלדהיד יכול לגרום לרגישות שעלולה לגרום לדלקת עור אלרגית. פורמלדהיד הוא מסרטן אנושי ידוע והוא חשוד בסכנת הרבייה. - במהירות ובעדינות לשטוף את רקמת קבוע פעמיים עם HBSS כדי להסיר את הפאראמפורמלדהיד.
הערה: הסרת העצמות הטמפורלית אינה נחוצה בשלב ההתפתחותי זה של שבלול. - הסר את הרצועה ספירלה ואת קרום tectorial עם מלקחיים תשר עדין כדי לנתח את האיבר של Corti (איור 2G).
- להסיר את כל חתיכות קטנות של רקמות ולשטוף את הרקמה עם HBSS.
- המחלחל את הרקמה ב 0.5% טריטון X-100 ב PBS המכיל phalloidin התווית באופן מבוקר (מצומדת ירוק או אדום בעת בדיקת ספיגת של TR-או fitc התווית dextran, בהתאמה) ב 1:200 דילול עבור 30 דקות תווית F-actin ולדמיין את ה סטריאוציליה מבוססת-actin.
- לשטוף את הרקמה 2 – 3 פעמים עבור 2 דקות בכל פעם עם מאגר HBSS כדי להסיר את עודפי טריטון ו phalloidin, ופעם עם PBS כדי להסיר את המלחים.
- הר האיבר של רקמות Corti על שקופית מיקרוסקופ ולכסות אותו עם הרכבה מדיה.
הערה: כאשר אתה מבצע את הרקמה, ודא שהצד של הרקמה המכילה את תא השיער סטריאוסיליה פונה לתוך הכיסויים. - הסר כל בועות פוטנציאליות שנוצרו במהלך התוספת של המדיה ההרכבה ולמנוע את הדור של בועות חדשות במהלך הצבת שמיכות.
הערה: מנושף בעזרת פיפטה כל בועה שנוצרת בתוספת המדיה הכוללת. כדי למנוע בועות אוויר מלהיות לכוד תחת coverslip, במקום קצה של coverslip קרוב למדגם בזהירות ובאיטיות להקטין את הכיסויים על הרקמה באמצעות מלקחיים או מפית. - כסו את הרקמה במדיה הכוללת שמיכות זכוכית (איור 2H).
הערה: יעדים עם צמצם מספרי מעל 0.4 מיועדים להשתמש #1 שמיכות 0.5 (עובי 0.17 מ"מ). שימוש בcoverslip לא נכון יכול להיות השלכות חמורות על העוצמה והאיכות של התמונות. - מודטת את הרקמה הטעונה לילה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר למדיה לעלות להתייבש ולאחסן את השקופיות ב -4 ° צ' עד להדמיה.
5. רכישת תמונה ועיבוד תמונה
הערה: התמונות קונפוקלית וקד נלקחו עם lsm 880 מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד בגלאי airyscan ערוץ 32 ברזולוציה סופר (SR) מצב43 ו-63 x המטרה.
- להוסיף טיפה קטנה של שמן טבילה על המטרה.
- הניחו את שקופית המיקרוסקופ המכילה את דגימת הרקמה שנטענה בשלב המיקרוסקופ עם שמיכות זכוכית מול שמן טבילה.
- התמקד במדגם והגדר את פרמטרי ההדמיה באמצעות תוכנת רכישת התמונות.
- השתמש בקביעות רכישה זהות ובפרמטרים אופטימליים עבור רזולוציית x, y ו-z עבור כל ניסוי עצמאי. מערכת המוקד piezo מונחה נדרש כדי במהירות ובדיוק להעביר את המטרה בעת רכישת z-ערימת תמונות.
הערה: כדי לדמות את כל האזור הרשמי של תאי השיער, לאסוף z-מחסנית של תמונות מתוך stereocilia לחצי הרשמי של גוף השיער באמצעות ההגדרות האופטימליות. חשוב לאסוף z מחסנית גדולה לאורך התא השיער כדי להבטיח את ההדמיה של חלקיקים כמו שלפוחית התינוק. - השתמש בתוכנה לרכישת תמונות כדי לעבד את תמונות מיקוד raw באמצעות האלגוריתם השחזור התלת-ממדי של Airyscan עם הגדרות ברירת המחדל של המסנן האוטומטי.
- פתחו את התמונות הקונמיות בתוכנה לעיבוד תמונות כדי לכוונן את הבהירות והניגודיות, הוסיפו את סרגל הקנה מידה ומייצאים את התמונות לדמויות הסופיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבחנו חזק וספציפי תיוג של תאי שיער לאחר הדגירה של 2h של האיבר של corti explants מסוג פראי לנטאל-יום 6 (P6) עכברים עם 3התווית של שלושהכאשר מסומן בדגל עם טקסס אדום (תוספי-TR) (איור 2א-ב). תיוג dextran נצפתה הן בתאי השיער הפנימיים והחיצוניים (IHC ו-OHC) באזורים הבזליים, האמצעיים והאפותיים של האיבר של Corti (איור 2ב).
התווית של phalloidin מתויג באופן שימוש כדי לזהות את הכתמים על הכתם (F-אקטין) ולהמחיש את השיער המבוסס על תאי שיער מבוססי אקטין. אנחנו גם ביצעו ניסויים דומים בתקופות דגירה קצרות, ולמרות שראינו הצטברות dextran-TR בגוף תא השיער, האותות היו חלשים יותר משתנה מאשר אלה ב 2 הדגירה (איור 2ג).
אנו התמונה הבאה הן stereocilia וגופי התא של תאי השיער וציין כי רק תאים המשולבים 3 kDa dextran-TR בגוף התאים שלהם הראה תיוג פלורסנט של סטריאוציליה שלהם (איור 3א). מערכת יחסים זו בין stereocilia לבין הגוף מתייג התאים בתאי שיער מרקמות פגומות, אשר הציג גם תיוג לא ספציפי של תוספי בכמה סוגי תאים של אפיתל החושים (ריבועים צהובים באיור 2b, ואיור 3ב). חשוב לציין, הבחנו באות של קרינה פלואורסצנטית אחידה לאורך הסטריאוסיליה עם העשרה בקצות שורות הסטריאוסיליה הקצרות שבהן הערוץ MET ממוקם18,23 (איור 3ג). כמו כן, שמנו לב שלפוחית כמו מבנים בגוף התא של תאי השיער ואת התאים התומכים השכנה. דפוס vesicle כמו של ספיגה בתאים אלה מרמז כי dextran-TR יכול גם להילקח על ידי האנדוציטוזה (איור 3ג).
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר גם לבדיקה של קליטת דקטרנס גדול יותר ושילובים של דקטרנס שונים. תוספי גדול יותר 10 kda תווית עם טקסס אדום (תוספי-TR) או fluorescein (תוספי-fitc) גם הפיק דפוס שלפוחית העין בגוף התא של תאי השיער והתאים התומכים, בנוסף לצבירת סביב קרום השיער בתבנית לא אחידה (איור 4a, B). The 10 kda דקסטר-TR גם שטחי התווית שלוש שורות stereocilia של כל תאי השיער (איור 4A, שיבוץ), כנראה בשל משטח טעונה שלילית של ממברנה של תא השיער פלזמה44,45,46. בשלב הבא בחנו את ספיגת 3 kDa dextran-TR ו 10 kDa dextran-FITC בו בעוגב של האקסוצמחים Corti. עבור 3 kDa dextran-TR, הבחנו הן מפוזר וגם דפוס שלפוחית כמו. עם זאת, the 10 kDa dextran-FITC רק הציג דפוס בצורת שלפוחית (איור 4ג). נתונים אלה מראים כי ספיגת תוספי מתרחשת על ידי לפחות שני מנגנונים שונים התלויים בגודל של תוספי.
הגענו הבא העריכו אם הערוצים הפונקציונליים נפגשו נדרשו לספיגת של 3 kDa dextran-TR. כדי לעשות זאת, בחנו התאגדות תוספי בתאי שיער מאיבר של corti explants בנוכחות של חוסמי ערוץ נפגשו (neomycin ו amiloride)13,14,47 או Ca2 + כלאטור באפטה, אשר ביטול הזרמים נפגשו על ידי שבירת קישורים טיפים ומניעת הערוץ25,48,49. בניסויים אלה, הרחבות רקמות היו מודבטים בעבר 30 דקות עם neomycin (500 mM), amiloride (150 mM), או עם בפסטה (5mM) לפני תוספת של 3 kDa dextran-TR בנוכחות חוסם MET המקביל. הנוכחות של בפסטה או חוסמי ערוץ MET מנעו את התיוג stereocilia (איור 5א) ואת ספיגת של 3 kda dextran-TR בתאי השיער (איור 5ב). עם זאת, המצור של ערוץ MET שמרו את דפוס כמו שלפוחיתהדעת (איור 5ב), המציין כי דפוס זה של ספיגת הוא עצמאי של הערוצים הפונקציונליים MET. תוצאות דומות נצפו בתאי השיער מ TMC1/TMC2 כפול להוריד עכברים, אשר מחסור MET27. שליט, מבנים אלה כמו שלפוחית האלה לא היו נצפה בנוכחות של amiloride, אשר ידוע לעכב את Na+-H+ מחליף ובכך לעכב endocyציטוזה50,51. תוצאות אלה מצביעות על כך 3kDa dextran-TR נכנס לתאי השיער באמצעות שני מסלולים שונים, אחד שכיח כדי דקטרנס גדול יותר מעורבים vesicle לפוחית כמו מבנים ועוד תלוי בערוצי MET פונקציונלי.
איור 1: צעדים של הניתוח של איבר מורין של קורטי. (א) אזור נקי וחומרים הנדרשים לניתוח. (ב) הגולגולת החשופה לעכבר. , מלקחיים מחזיקים את העור. שמקופל לכיוון האף קווים שחורים מצביעים על שני החתכים הנדרשים להסרת המוח. (ג) בעלת גולגולת ופתח כדי לאפשר הסרת המוח עם מרית (מימין). (ד) גולגולת ועצמות הרקה לאחר הסרת המוח. (ה) גולגולת מחפירה, כולל עצמות הרקה (ריבועים שחורים מקווקווים) בצלחת P35 מכוסה במדיה. (ו) כנימת מחפירה. (ז) שני איברים לגזור של corti על הבאר של לוחית של דיכאון זכוכית. (H) רכוב דגם על שמיכות זכוכית מוכן לדימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בתאי שיער ספיגה 3 kDa dextran-TR. (A) ייצוג סכמטי של טקסס אדום התווית תוספי (תוספי-TR) המכיל שש מולקולות של גלוקוז המתאים משקל מולקולרי של 1.08 kda. תגובת אסתר מקשרת בין המולקולה האדומה (מגנטה) לבין מונומר גלוקוז. (ב) הנציג מוקד התמונה מציג תיוג ספציפי של תאי שיער חושי (HC) עם 3 kda dextran-TR על פני האיבר כולו של corti מעכבר בן 6 ימים. מציינים את אזורי הבסיס (BA), האמצעי (MD) ו-פסגה (AP) של האיבר. ריבועים צהובים מצביעים. על האזורים הפגומים ברקמה (C) 3 הקרינה הפלואורסצנטית-TR לאחר 30, 60, 90, או 120 דקות דגירה עם האיבר של האקסוצמחים corti מוצג בארגמן ממוזג עם F-actin ירוק (תמונות העליון) ובאופן עצמאי בגווני אפור (התמונות התחתונות). טווח תצוגת התמונה היה מותאם באופן ליניארי בכל אחת מהתמונות האפורות בנפרד לצורך הדמיה של הזריחה 3 כבדה dextran-TR. סרגל בקנה מידה = 20 מ"מ. . הדמות הזאת השתנתה מ-27 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: גוף התא שיער ו stereocilia תיוג עם 3 kDa dextran-TR. (א) תמונות confocal וקד מציג 3 כבדה dextran-TR (מגנטה) בגוף התא ו stereocilia נגד מוכתם עם phalloidin כדי תווית F-actin (ירוק) כדי להמחיש את הגבולות תא השיער stereocilia. שלוש שורות של תאי שיער חיצוניים (OHC) ושורה אחת של תאי השיער הפנימי (IHC) מצוינים. סרגל בקנה מידה = 20 מ"מ. (ב) מיקוד תמונות של אזור רקמת פגום המציגים 3 כבדה dextran-TR (מגנטה) בגוף התא stereocilia. חיצים צהובים מציינים את התיוג של תאים התומכים לא חושי. סרגל קנה מידה = 20 מ"מ. (ג) השקפה מקרוב של 3 כבדה dextran-TR בגוף התא stereocilia של תאי השיער החיצוני (ohc, top) ותאי השיער הפנימי (ihc, למטה). סרגל בקנה מידה = 5 מ"מ. . הדמות הזאת השתנתה מ-27 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תיוג גדול יותר 10 kda תוספי ושילוב של 3 ו 10 kda תוספי. (א) התמונה confocal וקד של תאי השיער על הגוף תא השיער (למעלה) ו stereocilia (למטה) רמות מודבטים עם 10 kda DEXTRAN-TR. האות הזריחה של תוספי מוצג בארגמן ממוזג עם F-actin בירוק ובאופן עצמאי בגווני אפור. כמה IHC מוצגים בהגדלה גבוהה יותר בכניסה כדי להעריך את התיוג השטחית של סטריאוסיליה שנצפתה עם 10 kDa dextran-TR. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. (ב) מיקוד של תאי שיער מודבטים עם 10 kda DEXTRAN-fitc מיוצג כמו A. (ג) מוקד של תאי שיער בגוף תא השיער (למעלה) ו stereocilia (למטה) רמות מודבטים בו זמנית עם 3 KDA dextran-TR ו 10 kda dextran-fitc והתמונה באמצעות ערוצים עצמאיים מתוארת בנפרד באפור. בלוח הימני, F-actin (כחול), 10 kDa dextran-FITC (ירוק), ו 3 kDa dextran-TR (מגנטה) מוצגים יחד עם phalloidin (כחול). סרגל בקנה מידה = 20 מ"מ, ואת דפוס שלפוחית כמו של ספיגת מצוין עם חיצים צהובים. . הדמות הזאת השתנתה מ-27 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ערוצי MET מתפקדים נדרשים עבור קליטה של 3 כבדה dextran-TR. הנציגה מיקוד תמונות של תאי השיער ב stereocilia (A) או תאהגוף(ב) רמת לאחר הדגירה עם 3 kda dextran-TR בהעדר (שליטה) או נוכחות של בפסטה או AMILORIDE חוסמי הערוץ MET ו neomycin. שלושה מופיעים בארגמן. הרקמה היתה מוכתמת נגד phalloidin כדי תווית F-actin עבור ויזואליזציה של השיער שיער stereocilia וגבולות (ירוק). חיצים לבנים מצביעים. על מבנים כמו שלפוחית-שלפוחיות שלוש שורות של תאי שיער חיצוניים (OHC) ושורה אחת של תאי השיער הפנימי (IHC) מסומנים, סרגל קנה מידה = 20 מ"מ. . הדמות הזאת השתנתה מ-27 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניסויים ספיגה באיבר murine של האקסוצמחים corti עם 3 kda תוספי טקסס אדום. המטרה של שיטה זו היא לבדוק אם מולקולות גדולות יותר מאשר אחרים שנבדקו בעבר היו גם מסוגלים לתייג במפורש תאים שיער שמיעתי והחדיר דרך ערוץ MET. פרוטוקולים ניסיוניים דומים שימשו בעבר כדי להעריך את החדירות של תאי השיער לצבעי פלורסנט אחרים כגון FM1-43 (0.56 kda)12,19,20 ו-טקסס בעלת תווית של האדום עמינח (1.29 – 1.43 kda)13,52. הזמן הדרוש לתיוג תאים שיער באמצעות אלה מולקולות פלורסנט משתנה עם גודלם. תיוג מקסימלי דורש כמה דקות עבור FM1-4313,53, 30-60 דקות עבור טקסס התווית האדום של הקוגליפאות13, ו 1.5 h עבור טקסס אדום המסומן 3 kda dextran. כך, הדגירה זמן רב הם חיוניים לניסוי זה כפי שראינו רק תיוג מינימלי של גוף תא השיער בתקופות דגירה קצר (איור 2ג). בחרנו ללמוד עכברים P6 עבור ניסויים אלה בגלל, בגיל זה, רוב התאים פסגה ושיער בסיס לשאת זרמים התמרה ולבטא הן TMC1 והן TMC2 חלבונים12,18,54,55. זה אמור להיות אפשרי ללמוד בעלי חיים צעירים כמו זרמים MET נמצאים מוקדם יותר P6, במיוחד ליד בסיס של שבלול12. לימוד בעלי חיים מבוגרים יותר עלול להיות מאתגר יותר כי הניתוח של שבלול הגרמי הופך קשה יותר כמו מבנה זה ממשיך להתקשות56.
בפרוטוקול זה קיימים מספר שלבים קריטיים. המכריע ביותר הוא הניתוח המוצלח והכנת האיבר של רקמת Corti (איור 1). המבנה העדין של העוגב של קורטי ומונסמנט ב שבלול בוני מציג אתגר לניתוח היסטולוגית והביוכימי. כמה פרוטוקולים מפורטים עבור הניתוח המוצלח של רקמה זו פורסמו בעבר בכתב העת56,57,58 ואחרים59. שיבוש של הצומת תא תא ואובדן של שלמות האפיתל חושי השמיעה עשוי להוביל לספיגת של תוספי של עד 40 kda ואת התיוג של התאים המושפעים39,40. בהסכם עם זה, הבחנו תיוג לא ספציפי של תאי השיער ואת התאים התומכים המקיפים כאשר הרקמה נפגעה בשוגג עם מלקחיים במהלך הניתוח לפני דגירה תוספי (איור 2b ואיור 3ב). אין טריקים או הנחיות להגיע מיומנות בניתוח של איבר שלם של Corti מלבד תרגול וסבלנות. עם זאת, הנוכחות של 1 – 2 mM Ca2 + במהלך ניתוח לנתיחה וניסויים ספיגת הוא חיוני כדי לשמור על שלמות הקישור טיפ המעביר את הכוח המכני לערוץ met ובכך לשמר את הפונקציה met ערוץ. לאחר הרקמה הוא קבוע עם 4% בתחתית, הנוכחות של סידן במאגר או מדיה הופך טריוויאלי.
אחת המגבלות של מחקר זה שוכנת בטבעה הטרוגנית של מולקולות תוספי. תוספי פירט על ידי חיידקים leuconostoc הוא פולימר של אנהידרוגלוקוז מורכב כ 95% אלפא (1 – 6) D-הקשר הגילאים (איור 2א). הקשרים הנותרים החשבון עבור הסתעפות של תוספי, אשר מתואם את אורכו, כך תוספי של משקל מולקולרי נמוך יותר הם מוט כמו התפלגות בגודל צר יותר בעוד דקסטר גדול יותר הם polydisperse60. לכן, את המשקל המולקולרי הממשי של המולקולות בכל הכנה של 3 kDa בטווח של שלושה מ1.5 עד 3.0 kDa, כולל מולקולת פלורסנט61. בנוסף, התווית שונה ביותר fluorescently שונים במספר של טקסס המולקולות האדומות המצורפת תוספי (מידה של תיוג). מומלץ להשתמש תוספי עם מידה של תיוג של לפחות 0.4 מאז דרגה נמוכה יותר של תיוג יהיה לעכב את היכולת לזהות את התווית באופן פלואורוסקופים על ידי מיקרוסקופ. צבע הפלורסנט משולב לדקטרן ושאריות הליזין בגרסאות התיקון, יקבע את המטען הכולל של תוספי. זהו שיקול חשוב מאז בסלקטיביות של הערוץ MET רצוי לספיגה של דטרן27. לבסוף, תוספי ליזין לתיקון הוא הכרחי כדי להגיע לרזולוציה המוצגת בניסויים אלה. תוספי לא לתיקון ימשיך לפזר את הרקמה המממנת את הלוקליזציה המדויק שלה והדמיה.
880 lsm מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד בגלאי airyscan המשמש תמונה האיבר של הדגימות corti סיפק לנו עם כפול הרזולוציה, וטוב יותר אות לרעש היחס (SNR) לעומת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד קונבנציונאלי62. לכן, מיקרוסקופ זה איפשר לנו לא רק להתבונן הצטברות תוספי חזק בגוף התא אלא גם כדי להצביע על הצטברות של תוספי בטיפים stereocilia ואת דפוס כמו שלפוחית בגוף התא. מיקרוסקופ קונפוקלית וקד קונבנציונאלי יאפשר את ההדמיה ואת הקוונפיקציה של הצטברות של דקטרן פלורסנט על גוף התא, אבל זה היה קשה להבדיל בין שלוש שורות stereocilia ולוקליזציה מדויקת של תוספי בקצות שורות stereocilia קצר. ברזולוציה דומה לזו שהושגה עם lsm 880 airyscan הקשר ניתן להגיע באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד קונבנציונאלי עם הדגימה ופירוק, למרות SNR יהיה נמוך יותר האחד הגיע עם גלאי airyscan.
בנוסף לשימוש 3 kDa dextran-TR לצורך שינון עבור ערוצים פונקציונליים, פרוטוקול זה יכול להיות משמש עוד יותר כדי ללמוד תהליכים endocytic בתאי השיער מאז כל דקטרנס נבדק לגלות דפוס תאיים שלפוחית העין דמוי האנדוציטוזה. תהליך זה לא היה מוקד עבודתנו, ומחקרים נוספים יידרשו לאפיין את התופעה במלואה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לוינסנט Schram מתוך המיקרוסקופיה וליבת ההדמיה לסיוע ברכישת תמונה מרכזית, ו-Tsg-Hui Chang לעזרה לא יסולא בפז בניהול המושבה ובטיפול בעכברים. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של NINDS, NIH, בת, MD, כדי K.J.S. א יהושע נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של NINDS, NIH, ועל ידי רוברט Wenthold מלגת השתלמות מתוכנית המחקר התוך-קיר של ה-נדבך.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
| C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
| Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
| Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
| Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
| Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
| Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
- Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
- Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
- Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
- Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
- Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
- Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
- Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
- Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
- Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
- Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
- Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
- Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
- Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
- Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
- Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
- Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
- Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
- Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
- Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
- Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
- Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
- Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
- Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
- Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
- Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
- Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
- Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
- Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
- Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
- Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
- Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
- Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
- Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
- Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
- Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
- Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
- Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
- Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
- Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
- Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
- Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
- Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
