Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Dextran وضع العلامات والشراء في خلايا الشعر الحية والوظيفية Murine Cochlear

Published: February 8, 2020 doi: 10.3791/60769
Automatic Translation
1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

هنا ، نقدم طريقة لتصور استيعاب 3 kDa تكساس الأحمر المسمى dextran في خلايا الشعر السمعية مع قنوات mechanotransduction وظيفية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام dextrans من 3-10 كيلو دا لدراسة الخلايا الانبسية في الشعر والخلايا الداعمة لجهاز كورتي.

Abstract

تلعب قناة mechanotransduction خلية الشعر (MET) دورًا مهمًا في السمع. ومع ذلك ، فإن الهوية الجزيئية والمعلومات الهيكلية للMET لا تزال غير معروفة. كشفت الدراسات الكهربية لخلايا الشعر أن قناة MET لديها التوصيل الكبير ونفاذها إلى جزيئات الموجبة الفلورية الكبيرة نسبيا، بما في ذلك بعض الأصباغ الستيريلي والمضادات الحيوية الأمينوغليكوسيد تكساس الحمراء المسمى. في هذا البروتوكول، ونحن نصف طريقة لتصور وتقييم الاستفادة من dextrans الفلورسنت في خلايا الشعر من الجهاز من explants كورتي التي يمكن استخدامها لتفحص لقنوات MET وظيفية. وجدنا أن 3 kDa تكساس الأحمر المسمى dextran على وجه التحديد تسميات خلايا الشعر السمعية الوظيفية بعد 1-2 h الحضانة. على وجه الخصوص، 3 كدا dextran تسميات اثنين من صفوف ستيريوسيليا أقصر ويتراكم في جسم الخلية في نمط منتشر عندما قنوات MET وظيفية موجودة. لوحظ نمط إضافي يشبه الحويصلة من الوسم في جسم الخلية من خلايا الشعر والخلايا الداعمة المحيطة بها. تشير بياناتنا إلى أنه يمكن استخدام 3 kDa Texas-Red dextran لتصور ودراسة مسارين لإستمعاء الصبغة الخلوية. طريق دخول خاص بخلية الشعر من خلال قنوات MET الوظيفية وenocytosis ، وهو نمط متاح أيضًا لـ dextran الأكبر.

Introduction

خلايا الشعر في الأذن الداخلية هي الخلايا الحسية التي تكشف الصوت وسرية المحفزات ميكانيكيا في الإشارات الكهربائية، والتي يتم تفسيرها في نهاية المطاف من قبل الدماغ. هذه الخلايا لديها حزمة على شكل درج من ثلاثة صفوف من خيوط المستندة إلى أكتين، والمعروفة باسم stereocilia، والتي تبرز من منطقتهم apical1،2. المحفزات الميكانيكية تحويل خيوط stereocilia نحو أطول صف والزناد فتح قنوات mechanotransduction (MET)3. فتح قنوات MET يؤدي إلى تدفق الاتلاف التي depolarizs الخلية وبالتالي يشير إلى الإفراج عن الحويصلات المشبك في المنطقة القاعدية من خلية الشعر.

وقد تميزت الخصائص البيوفيزيائية للقناة MET الضرورية للسمع على نطاق واسع. من بين خصائص أخرى، وهذه القنوات هي انتقائية الكاتيون ية ولها التوصيل كبيرة نسبيا (150-300 pS في كاليفورنيا منخفضة2 +)4،5،6،7،8،9،10. ومن اللافت للنظر أن جزيئات الفلورسنت الكبيرة مثل FM1-43 وتكساس الحمراء المسماة الأمينوغليكوزيدات هي حاصرات محاذية لقناة MET، مما يؤدي إلى تراكمها في جسم خلايا الشعر التي يمكن تصورها باستخدام المجهر الفلوري11،12،13،14. وعلى العكس من ذلك، ظلت الهوية الجزيئية وبنية قناة MET ومسار نفاذها بعيدي المنال. تشير الأدلة التجريبية المتزايدة إلى أن بروتين القناة العابر للأغشية 1 (TMC1) هو مكون من قناة MET في خلايا الشعر الناضجة15،16،17،18،19. الطفرات في القناة العابرة للأغشية 1 (TMC1) تغير خصائص قناة MET19،20،21،22 وتسبب الصمم. بالإضافة إلى ذلك ، TMC1 توطين موقع قناة MET18،23 ويتفاعل مع وصلة تلميح المسؤولة عن نقل القوة الميكانيكية إلى قناة MET24،25. وعلاوة على ذلك، فقد حددت تحليل المعلوماتية الحيوية الأخيرة البروتينات TMC كما التطورية المتعلقة قنوات mechanosensitive TMEM63/OSCA البروتينات والبروتينات TMEM16، وهي عائلة من قنوات كلوريد الكالسيوم تفعيلها والمخفوقات الدهون26،27،28. وكشف نموذج هيكلي من TMC1 على أساس العلاقة بين هذه البروتينات وجود تجويف كبير في واجهة البروتين والدهون27. هذا التجويف يأوي الطفرات TMC1 اثنين التي تسبب فقدان السمع المهيمنة الأوتوسومية (DFNA36)27،29،30،31،32، والتعديل الانتقائي للطفرات السيستين للمخلفات في تجويف تغيير خصائص قناة MET28، مشيرا إلى أنه يمكن أن تعمل كمسار نفاذية من قناة MET. الحجم الكبير لهذا التجويف المتوقع في بروتينات TMC يمكن أن يفسر قدرة الجزيئات الكبيرة على اختراق قناة MET. لاختبار التنبؤ بأن قناة MET تحتوي على مسار نفاذية كبير بشكل غير عادي ولدفع حدود حجم التجويف الملاحظ في TMC1 ، وضعنا بروتوكولًا لإجراء تجارب التموعات في جهاز Corti explants مع جزيء أكبر ، 3 KDa dextran الفلوري المسمى بـ Texas Red.

Dextran هو متعدد السكاريد المتفرع ة المعقدة التي تتألف من العديد من جزيئات D-الجلوكوز ملزمة بوصلات ألفا-1,6 جليكوسيديك. الذوبان عالية في الماء، سمية الخلايا المنخفضة، وbioinertity جعله أداة متعددة الاستخدامات لدراسة العديد من العمليات الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، dextran يتوفر في مجموعة واسعة من الأحجام ووصفت الفلورسنت مع الفلوروفوريات من عدة ألوان. وتستخدم عادة dextrans المسمى الفلوري في أبحاث نفاذية الخلايا والأنسجة33،34، لدراسة الانبطفي في أنظمة خلوية متعددة35،36، ولتتبعالعصبية 37،38. في المجال السمعي ، تم استخدام جزيئات dextran أيضًا لتقييم اضطراب تقاطع الخلية وفقدان سلامة الظهارة الحسية السمعية بعد التعرض لضوضاء شديدة في جهاز الشينشيلا في Corti39،40.

في هذا العمل، استغلنا خصائص بعض من أصغر (3 و 10 كيلو دا) الفلورسنت dextrans لإجراء تجارب التموجدا في خلايا شعر الأذن الداخلية المورين واستكشاف حجم مسار نفاذية من قناة الأذن الداخلية الشعر MET الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمنا المجهر البؤري بالليزر (LSM) 880 المجهز بكاشف Airyscan لتصور وتوطين dextran الفلوري في المجسمة وجسم الخلية من خلايا الشعر السمعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ الرعاية الحيوانية والإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، والتي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (بروتوكول الحيوان #1336 إلى KJS).

1. الفئران

  1. تعيين زوجين من أزواج تربية من نوع البرية C57BL/6J لتربية في منشأة الحيوان للسيطرة على تاريخ ولادة القمامة وتتبع عمر الجراء.

2. تشريح القوقعة

  1. تعيين مساحة نظيفة بالقرب من المجسم لإجراء التشريح(الشكل 1A). استخدام الإيثانول 70٪ لتنظيف المساحة والمناطق المحيطة بها ووضع لوحة مقاعد البدلاء نظيفة. وسيلزم كيس بلاستيكي للنفايات المرضية الطبية (MPW) لتجاهل جثث الحيوانات.
  2. إعداد العديد من الأطباق 35 ملم مع بعض وسائل الإعلام L15 Leibovitz.
    ملاحظة: تحتوي وسائط الخلايا L-15 من Leibovitz على 1-2 m M Ca2 +، وهو مطلوب للحفاظ على سلامة وصلات تلميح ، ويحتوي على الأحماض الأمينية الأساسية والفيتامينات والبيروفات الصوديوم لتحسين صحة الخلايا والبقاء على قيد الحياة. تم استبعاد المصل لتجنب التقلبات التجريبية بسبب تكوينه غير المحدد بشكل جيد والتدخل المحتمل مع dextran.
  3. القتل الرحيم بعد الولادة-6-النهار(P6) الفئران عن طريق قطع الرأس.
    ملاحظة: الفئران القديمة 6 أيام مقاومة إلى حد ما للتخدير المستنشق. على الرغم من أنه يمكن استخدام التعرض لـ isoflurane أو CO2 لفترات طويلة (حتى 50 دقيقة) للقتل الرحيم ، يوصى بطريقة جسدية ثانوية لضمان الوفاة.
  4. استخدام المقص الجراحي لإزالة الجلد من الجمجمة عن طريق جعل قطع سطحية من الأمامي إلى النهاية الخلفية وعبر القنوات السمعية الخارجية.
  5. أضعاف الجلد نحو الأنف لفضح الجمجمة(الشكل 2B).
  6. إجراء شق من الخلف إلى الجزء الأمامي من الجمجمة وعبر خط العين(الشكل 2B-C).
  7. فصل الجمجمة في نصفين وإزالة الدماغ مع استخدام ملعقة صغيرة لفضح العظام الزمنية(الشكل 2C-D).
  8. مع مقص صغير، قطع حول العظام الزمنية، واستئصال الأنسجة.
  9. ضع كل من العظام الزمنية في طبق 35 ملم وتأكد من تغطيتها مع وسائل الإعلام L15(الشكل 2E).
    ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية تحت المجهر. عادة ما تساعد الخلفية السوداء على تصور الأنسجة أثناء خطوات التشريح الدقيقة.
  10. تحت مجهر يجهّز بالعدسة واسعة (10X تكبير قوة (WF10X) وتيار خارجي بالتناوب (AC) مصدر ضوء الهالوجين)، قم بإزالة أنسجة القوقعة المحيطة، والقنوات نصف الدائرية، والأعضاء الدهليزية مع الفرمش الجراحي(الشكل 2F).
  11. للسماح لوسائط dextran و L15 بدخول قناة القوقعة ، قم بإجراء حدودين للثقب على القوقعة المشوّشة ، أحدهما على النافذة المستديرة والآخر في منطقة القوقعة apical.
  12. أضف 300 مل من وسائط L15 من Leibovitz في كل بئر من لوحة اكتئاب زجاجية من 9 آبار.
  13. ضع ما لا يقل عن ثلاثة قوقعة تشريحية على كل بئر.

3. دإكستران وضع العلامات

  1. إعادة تشكيل dextran في محلول الملح متوازن هانكس دون كاليفورنيا2 + وملغ2 + (HBSS-CFM) في تركيز نهائي من 10 ملغ / مل. يجب أن يكون هذا الحل الأسهم aliquoted في أنابيب سوداء معتمة (محمية من الضوء) وتخزينها في -30 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: استخدام dextran قابلة للإصلاح يسين أمر بالغ الأهمية لنتيجة ناجحة من هذا البروتوكول.
  2. إعداد كل dextran في تركيز نهائي من 2 ملغ / مل في 500 مل من وسائل الإعلام L15 Leibovitz.
  3. إزالة وسائل الإعلام من القوقعة وإضافة وسائل الإعلام L15 Leibovitz التي تحتوي على dextran الفائدة في تركيز نهائي من 2 ملغ / مل.
    ملاحظة: على الرغم من أن نسبة من قنوات MET مفتوحة في بقية41،42، تم تنفيذ حضانة dextran مع اهتزاز لطيف من explants لزيادة الاحتمال المفتوح لقناة MET.
  4. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة مع اهتزاز لطيف (25 دورة في الدقيقة) باستخدام شاكر ثلاثي الأبعاد مع زاوية مائلة من 25 درجة.
    ملاحظة: يجب حماية dextran المسمى الفلوري من الضوء عندما يكون ذلك ممكناً. لحماية dextran خلال حضانة 2 ساعة، ضع لوحة الزجاج 9-well داخل طبق P150 ثقافة الخلية ملفوفة في رقائق الألومنيوم.

4. إعداد عينة للتصوير

  1. بعد الحضانة مع dextran، وغسل الأنسجة لمدة 2 دقيقة مرتين مع وسائل الإعلام ومرة واحدة مع HBSS.
  2. احتضان الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع 4٪ paraformaldehyde في محلول الملح المتوازن لهانكس (HBSS).
    تنبيه: التعرض للفورمالديهايد يمكن أن يكون مزعجا للعيون والأنف والجهاز التنفسي العلوي. في بعض الأفراد، يمكن أن يسبب التعرض المتكرر للجلد الفورمالديهايد التوعية التي قد تؤدي إلى التهاب الجلد التحسسي. الفورمالديهايد هو مادة مسرطنة بشرية معروفة ومشتبه بها في خطر الإنجاب.
  3. بسرعة وبلطف غسل الأنسجة الثابتة مرتين مع HBSS لإزالة paraformaldehyde.
    ملاحظة: لا توجد حاجة إلى إزالة الكلس للعظام الزمنية في هذه المرحلة التنموية من القوقعة.
  4. إزالة الرباط الحلزوني والغشاء التكتوني مع ملقط طرف ناعم لتشريح جهاز كورتي(الشكل 2G).
  5. إزالة جميع القطع الصغيرة من الأنسجة وغسل الأنسجة مع HBSS.
  6. Permeabilize الأنسجة في 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني تحتوي على phalloidin المسمى الفلورسنت (مترافق إلى الأخضر أو الأحمر عند اختبار استيعاب TR- أو FITC المسمى dextran، على التوالي) في تخفيف 1:200 لمدة 30 دقيقة لتسمية F-actin وتصور ستيريوسيليا المستندة إلى actin.
  7. غسل الأنسجة 2-3 مرات لمدة 2 دقيقة في كل مرة مع العازلة HBSS لإزالة فائض من تريتون وphalloidin، ومرة واحدة مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأملاح.
  8. قم بتركيب عضو أنسجة كورتي على شريحة مجهرية وقم بتغطيتها بالوسائط المتصاعدة.
    ملاحظة: عند تركيب الأنسجة، تأكد من أن الجانب من الأنسجة التي تحتوي على الاستريوسيليا خلية الشعر تواجه زلة الغطاء.
  9. إزالة أي فقاعات محتملة ولدت أثناء إضافة وسائل الإعلام المتصاعدة ومنع توليد فقاعات جديدة أثناء وضع قسيمة الغلاف.
    ملاحظة: يستنشق مع ماصة أي فقاعة ولدت أثناء إضافة وسائل الإعلام المتصاعدة. لمنع فقاعات الهواء من المحاصرين تحت غطاء، ضع حافة الغطاء بالقرب من العينة وبعناية وخفض ببطء coverslip على الأنسجة باستخدام ملقط أو تلميح ماصة.
  10. تغطية الأنسجة في وسائل الإعلام المتصاعدة مع غطاء زجاجي(الشكل 2H).
    ملاحظة: تم تصميم الأهداف ذات الفتحة العددية فوق 0.4 لاستخدام #1.5 قسائم التغطي (سمك 0.17 مم). قد يكون لاستخدام غطاء خاطئ آثار خطيرة على كثافة وجودة الصور.
  11. احتضان الأنسجة المركبة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة للسماح لوسائل الإعلام المتصاعدة الجافة وتخزين الشرائح في 4 درجة مئوية حتى التصوير.

5. الحصول على صورة ومعالجة الصور

ملاحظة: تم التقاط الصور المعتمة باستخدام مجهر بؤري LSM 880 مجهز بكاشف Airyscan 32 قناة في وضع الدقة الفائقة (SR)43 وهدف 63x.

  1. إضافة قطرة صغيرة من زيت الغمر على الهدف.
  2. ضع شريحة المجهر التي تحتوي على عينة الأنسجة المركبة في مرحلة المجهر مع غطاء زجاجي يواجه زيت الغمر.
  3. التركيز على العينة وتعيين معلمات التصوير باستخدام برنامج الحصول على صورة.
  4. استخدم إعدادات اكتساب الصور المتطابقة والمعلمات المثلى لدقة x و y و z لكل تجربة مستقلة. مطلوب نظام التركيز التي يحركها بيزو لتحريك الهدف بسرعة وبدقة عند الحصول على كومة z من الصور.
    ملاحظة: لتصوير المنطقة apical بأكملها من خلايا الشعر، وجمع كومة z من الصور من المجسمة إلى النصف apical من جسم خلية الشعر باستخدام الإعدادات المثلى. من الأهمية بمكان جمع كومة z كبيرة على طول خلية الشعر لضمان تصوير الجسيمات الشبيهة بالحويصلات.
  5. استخدم برنامج اكتساب الصور لمعالجة الصور المعقدة الخام باستخدام خوارزمية إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد Airyscan مع إعدادات فلتر deconvolution الافتراضي التلقائي.
  6. افتح الصور المعتمة في برنامج معالجة الصور لضبط السطوع والتباين، وإضافة شريط المقياس، وتصدير الصور للأرقام النهائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لاحظنا وسم قوية ومحددة من خلايا الشعر بعد 2h حضانة الجهاز من Explants كورتي من البرية نوع بعد الولادة-6-6 (P6) الفئران مع 3 kDa dextran الفلورسنت المسمى مع تكساس الأحمر (dextran-TR)(الشكل 2A-B). لوحظ توسيم Dextran في كل من خلايا الشعر الداخلية والخارجية (IHC وOHC) في المناطق القاعدية والوسطى وapical من جهاز كورتي(الشكل 2B).

تم استخدام phalloidin المسمى بالفلورسنت لمكافحة الأكتين الخيطي (F-actin) وتصور المجسمة الخلايا الشعر المستندة إلى أكتين. كما قمنا بإجراء تجارب مماثلة في أوقات حضانة أقصر ، وعلى الرغم من أننا لاحظنا تراكم dextran-TR في جسم خلية الشعر ، كانت الإشارات أضعف وأكثر متغيرًا من تلك الموجودة في حضانة 2 h(الشكل 2C).

نحن المقبل صورة كل من stereocilia والهيئات الخلية من خلايا الشعر ولاحظ أن فقط تلك الخلايا التي أدرجت 3 kDa dextran-TR في الجسم الخلية أظهرت وسم الفلورسنت من stereocilia بهم(الشكل 3A). هذه العلاقة بين stereocilia والخلية وضع العلامات الجسم كان غائبا في خلايا الشعر من الأنسجة التالفة، والتي قدمت أيضا وضع العلامات غير محددة من dextran في عدة أنواع الخلية من ظهارة الحسية (المربعات الصفراء في الشكل 2B،والشكل 3B). الأهم من ذلك، لاحظنا إشارة فلورية موحدة على طول stereocilia مع الإثراء في نصائح من الصفوف أقصر stereocilia حيث يقع قناة MET18،23 (الشكل 3C). أيضا، لاحظنا هياكل تشبه الحويصلات في جسم الخلية من خلايا الشعر والخلايا الداعمة المجاورة. يشير نمط الإنسطاق الشبيهة بالحويصلة في هذه الخلايا إلى أنه يمكن أيضًا تناول dextran-TR عن طريق الخلايا الانقائية(الشكل 3C).

البروتوكول الموصوف هنا يسمح أيضا لفحص الاستفادة من أكبر dextrans وتركيبات من ديكسترانس مختلفة. أكبر dextran من 10 كيلو دا المسمى مع تكساس الأحمر (dextran-TR) أو الفلورسين (dextran-FITC) أنتجت أيضا نمط مثل الحويصلات في الجسم خلية من خلايا الشعر والخلايا الداعمة، بالإضافة إلى تراكم حول غشاء خلية الشعر في نمط غير مكتمل(الشكل 4A، B). ال 10 kDa dextran-TR كما وصفت سطحيا الصفوف المجسمة الثلاثة من جميع خلايا الشعر(الشكل 4A، inset) ، وربما يرجع ذلك إلى سطح مشحونة سلبا من غشاء البلازما خلية الشعر44،45،46. درسنا المقبل الاستفادة من 3 kDa dextran-TR و 10 kDa dextran-FITC في وقت واحد في جهاز Explants Corti. ل3 kDa dextran-TR، لاحظنا كل من انتشار ونمط مثل الحويصلات. ومع ذلك ، فإن 10 kDa dextran -FITC عرض فقط نمط مثل الحويصلات(الشكل 4C). تشير هذه البيانات إلى أن التمازة dextran يحدث بواسطة آليتين متميزتين على الأقل تعتمدان على حجم dextran.

قمنا بعد ذلك بتقييم ما إذا كانت قنوات MET الوظيفية مطلوبة للحصول على 3 kDa dextran-TR. للقيام بذلك، اختبرنا دمج dextran في خلايا الشعر من جهاز Explants كورتي في وجود حاصرات قناة MET (النيومايسين وأميلوريد)13،14،47 أو Ca 2+ chelator BAPTA ، الذي يلغي تيارات MET عن طريق كسر روابط تلميح ومنع الجاتينغ للقناة25،48،49. في هذه التجارب، تم احتضان النباتات الأنسجة سابقا لمدة 30 دقيقة مع النيومايسين (500 mM)، أميدريد (150 mM)، أو مع BAPTA (5M) قبل إضافة 3 كدا dextran-TR في وجود مانع MET المقابلة. وجود BAPTA أو حاصرات قناة MET منعت تسمية stereocilia(الشكل 5A)وحصة من 3 kDa dextran-TR في خلايا الشعر(الشكل 5B). ومع ذلك، حافظ الحصار المفروض على قناة MET على النمط الشبيهة بالحويصلة(الشكل 5B)،مما يشير إلى أن هذا النمط من التماسي مستقل عن قنوات MET الوظيفية. وقد لوحظت نتائج مماثلة في خلايا الشعر من TMC1/TMC2 مزدوجة خروج المغلوب الفئران، والتي تفتقر إلى MET27. ومن المثير للاهتمام أن هذه الهياكل الشبيهة بالحويصلات لم تكن ملحوظة في وجود الأميليود، الذي يعرف أنه يمنع مبادل Na+-H+ وبالتالي يمنع الانسطية50،51. وتشير هذه النتائج إلى أن 3kDa dextran-TR يدخل خلايا الشعر من خلال مسارين مختلفين، واحد مشترك لdextrans أكبر تنطوي على هياكل تشبه الحويصلة وآخر يعتمد على قنوات MET وظيفية.

Figure 1
الشكل 1: خطوات تشريح عضو من التورني. (أ)منطقة نظيفة والمواد اللازمة للتشريح. (ب)كشف الجمجمة الماوس. ملقط عقد الجلد، والتي قد مطوية نحو الأنف. خطوط سوداء تشير إلى شقا هما المطلوبة لإزالة الدماغ. (C)الجمجمة المنفتح ة للسماح بإزالة الدماغ بملعقة (على اليمين). (د)الجمجمة والعظام الزمنية بعد إزالة الدماغ. (E)الجمجمة المنتقاة، بما في ذلك العظام الزمنية (المربعات السوداء المتقطعة) في لوحة P35 مغطاة بالوسائط. (واو)القوقعة المُستأصلة. (ز)اثنين من أعضاء تشريح كورتي على بئر لوحة الاكتئاب الزجاج. (H)عينة محمولة على غطاء زجاجي جاهز للتصوير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: خلايا الشعر الحصة 3 kDa dextran-TR. (أ)التمثيل التخطيطي لتكساس ريد سكتران (dextran-TR) التي تحتوي على ستة جزيئات من الجلوكوز المقابلة لوزن جزيئي قدره 1.08 كيلو دا. رد فعل استر succinimidyl يربط جزيء تكساس الأحمر (أرجواني) إلى مونومر الجلوكوز. (ب)صورة تمثيلية مُظهرة محددة لخلايا الشعر الحسية (HC) مع 3 kDa dextran-TR عبر العضو بأكمله من Corti من فأر ة عمرها 6 أيام. يشار إلى المناطق القاعدية (BA) والوسطى (MD) وapical (AP) من الجهاز. تشير المربعات الصفراء إلى المناطق التالفة في الأنسجة. (C)3 kDa dextran-TR fluorescence بعد 30، 60، 90، أو 120 دقيقة حضانة مع جهاز Explants كورتي هو مبين في أرجواني دمجها مع F-actin باللون الأخضر (الصور العليا) ومستقل في الرمادي (الصور السفلية). تم ضبط نطاق عرض الصورة خطيًا في كل صورة من الصور الرمادية بشكل مستقل لتصور الفلورسينس dextran-TR 3 KDa. شريط المقياس = 20 مم. وقد تم تعديل هذا الرقم من27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: جسم خلية الشعر وتسمية stereocilia مع 3 kDa dextran-TR. (أ)صور Confocal عرض 3 kDa dextran-TR الفلور (أرجواني) في جسم الخلية ومريوسيليا مضادة مع phalloidin لتسمية F-actin (الأخضر) لتصور حدود خلايا الشعر وstereocilia. يشار إلى الصفوف الثلاثة من خلايا الشعر الخارجي (OHC) وصف واحد من خلايا الشعر الداخلية (IHC). مقياس شريط = 20 ملم (B) صور Confocal من منطقة الأنسجة التالفة عرض 3 kDa dextran-TR الفلورسينس (أرجواني) في جسم الخلية وstereocilia. تشير الأسهم الصفراء إلى وضع العلامات على الخلايا الداعمة غير الحسية. مقياس شريط = 20 ملم(C)عرض أقرب من 3 kDa dextran-TR fluorescence في جسم الخلية وstereocilia من خلايا الشعر الخارجي (OHC، أعلى) وخلايا الشعر الداخلية (IHC، أسفل). شريط المقياس = 5 مم. وقد تم تعديل هذا الرقم من27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: وضع العلامات على أكبر 10 كيلو دا دإكستران ومزيج من 3 و 10 كيلو دا دإكستران. (أ)صورة Confocal من خلايا الشعر في جسم خلايا الشعر (أعلى) وstereocilia (أسفل) المستويات المحتضنة مع 10 كيلو دا dextran-TR. تظهر إشارة الفلورسين dextran في أرجواني دمجها مع F-actin باللون الأخضر ومستقل في تدرج رمادي. تظهر زوجين من IHC في التكبير أعلى في inset لتقدير وضع العلامات السطحية من stereocilia لوحظ مع 10 كيلو دا dextran-TR. مقياس شريط = 5 ملم(B)صورة Confocal من خلايا الشعر المحتضنة مع 10 kDa dextran-FITC ممثلة كما هو الحال في A.(C)صورة Confocal من خلايا الشعر في جسم خلايا الشعر (أعلى) وstereocilia (أسفل) المستويات احتضان في وقت واحد مع 3 kDa dextran-TR و 10 kDa dextran-FITC وتصويرها باستخدام قنوات مستقلة وتصور بشكل منفصل في الرمادي. في اللوحة اليمنى، تظهر F-actin (الأزرق)، 10 كيلو دا dextran-FITC (أخضر)، و 3 كيلو دا دإكستران-TR (أرجواني) جنبا إلى جنب مع phalloidin (الأزرق). شريط المقياس = 20 مم، ويشار إلى نمط الحصة الشبيهة بالحويصلات بأسهم صفراء. وقد تم تعديل هذا الرقم من27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: قنوات MET الوظيفية مطلوبة لـ 3 kDa dextran-TR. صور تمثيلية لخلايا الشعر في المجسة(A)أو جسم الخلية(B)مستوى بعد الحضانة مع 3 kDa dextran-TR في غياب (التحكم) أو وجود BAPTA أو حاصرات قناة MET أميالميلايد والنيومايسين. يظهر 3 كيلو دا دإكستران-TR الفلورسينس في أرجواني. ومضادة الأنسجة مع phalloidin لتسمية F-actin لتصور الاستريوسيليا خلية الشعر والحدود (الأخضر). تشير الأسهم البيضاء إلى هياكل تشبه الحويصلات. يشار إلى الصفوف الثلاثة من خلايا الشعر الخارجي (OHC) وصف واحد من خلايا الشعر الداخلية (IHC) ، شريط المقياس = 20 ملم. وقد تم تعديل هذا الرقم من27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تجارب التمويع في جهاز مورين من Explants Corti مع 3 kDa dextran Texas Red. والهدف من هذه الطريقة هو اختبار ما إذا كانت جزيئات أكبر من غيرها من التجارب السابقة قادرة أيضا على تسمية خلايا الشعر السمعية على وجه التحديد وتتخلل من خلال قناة MET. وقد استخدمت بروتوكولات تجريبية مماثلة في السابق لتقييم نفاذية خلايا الشعر إلى الأصباغ الفلورية الأخرى مثل FM1-43 (0.56 كيلو دا)12،19،20 وتكساس الحمراء المسمى aminoglycosides (1.29-1.43 كيلو دا)13،52. يختلف الوقت اللازم للصق خلايا الشعر باستخدام هذه الجزيئات الفلورية باختلاف حجمها. الوسم الأقصى يتطلب بضع دقائق لFM1-4313،53، 30-60 دقيقة لولاية تكساس الحمراء المسمى aminoglycosides13، و 1.5 ساعة لولاية تكساس الحمراء المسمى 3 kDa dextran. وهكذا ، فإن أوقات الحضانة الطويلة حاسمة لهذه التجربة حيث رأينا الحد الأدنى فقط من وضع العلامات على جسم خلية الشعر في أوقات الحضانة القصيرة(الشكل 2C). اخترنا دراسة فئران P6 لهذه التجارب لأنه في هذا العمر ، تحمل معظم خلايا الشعر apical وbasal تيارات نقل وتعبر عن بروتينات TMC1 و TMC212،18،54،55. يجب أن يكون من الممكن دراسة الحيوانات الأصغر سنا كما تيارات MET موجودة في وقت سابق من P6، ولا سيما بالقرب من قاعدة القوقعة12. قد تكون دراسة الحيوانات القديمة أكثر صعوبة لأن تشريح القوقعة العظمية يصبح أكثر صعوبة مع استمرار هذا الهيكل في الأوسيف56.

هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. الأكثر أهمية هو تشريح ناجح ة وإعداد الجهاز من الأنسجة القشرية(الشكل 1). يمثل الهيكل الدقيق لجهاز كورتي والمغطى في القوقعة العظمية تحديًا للتحليل النسيجي والكيميائي الحيوي. وقد نشرت عدة بروتوكولات مفصلة للتشريح الناجح لهذا النسيج سابقا في هذه المجلة56،57،58 وغيرها59. تعطيل تقاطع الخلية وفقدان سلامة الظهارة الحسية السمعية قد يؤدي إلى تناول dextran تصل إلى 40 كيلو دا ووضع العلامات من الخلايا المتضررة39،40. بالاتفاق مع هذا ، لاحظنا وضع علامات غير محددة لخلايا الشعر والخلايا الداعمة المحيطة بها عندما تضررت الأنسجة عن غير قصد مع الملقط أثناء تشريح قبل حضانة dextran(الشكل 2B والشكل 3B). لا توجد حيل أو إرشادات للوصول إلى الكفاءة في تشريح جهاز سليم من كورتي بخلاف الممارسة والصبر. ومع ذلك ، فإن وجود 1-2 mM Ca2 + أثناء تشريح الأنسجة وتجارب الالتقاط أمر بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة وصلة تلميح التي تنقل القوة الميكانيكية إلى قناة MET وبالتالي الحفاظ على وظيفة قناة MET. مرة واحدة يتم إصلاح الأنسجة مع 4٪ PFA، وجود الكالسيوم في المخزن المؤقت أو وسائل الإعلام يصبح تافهة.

أحد القيود المفروضة على هذه الدراسة يكمن في الطبيعة غير المتجانسة لجزيئات اكستران. وdextran وضعتها البكتيريا Leuconostoc هو البوليمر من اللاهيدروغلوجل تتألف من حوالي 95٪ ألفا-(1-6) د الروابط(الشكل 2A). الروابط المتبقية حساب لتفريع dextran، الذي يرتبط مع طوله، لذلك dextran من انخفاض الوزن الجزيئي هي أكثر قضيب مثل ولها توزيع حجم أضيق في حين أن أكبر dextrans هي polydisperse60. ولذلك، فإن الوزن الجزيئي الفعلي للجزيئات في كل إعداد من dextran 3 KDa يتراوح من 1.5 إلى 3.0 كيلو دا، بما في ذلك جزيء الفلورسنت61. بالإضافة إلى ذلك، فإن dextran المسمى الفلورسنت تختلف في عدد من جزيئات تكساس الأحمر تعلق على dextran (درجة من وضع العلامات). من المستحسن استخدام dextran مع درجة من وضع العلامات على الأقل 0.4 لأن درجة أقل من وضع العلامات ستعيق القدرة على الكشف عن dextran المسمى الفلوري عن طريق المجهر. صبغة الفلورسنت إلى جانب dextran وبقايا الليسين في الإصدارات القابلة للإصلاح، وسوف تحدد الشحنة الإجمالية من dextran. هذا هو الاعتبار الهام منذ انتقائية الموجبة من قناة MET يفضل أن حصة الموجبة الانتقائية27. وأخيراً، من الضروري dextran يسين قابل للإصلاح للوصول إلى الدقة المعروضة في هذه التجارب. وسوف تستمر dextran غير قابلة للإصلاح في الانتشار في الأنسجة مما يعوق التعريب الدقيق والتصور.

المجهر LSM 880 المُحدّد المجهّز بجهاز كشف Airyscan يستخدم لتصوير جهاز عينات Corti، قدم لنا ضعف الدقة، ونسبة إشارة إلى ضوضاء أفضل (SNR) مقارنة بالمجهر البؤري التقليدي62. لذلك ، سمح لنا هذا المجهر ليس فقط بمراقبة تراكم dextran القوي في جسم الخلية ولكن أيضًا لتحديد تراكم dextran في نصائح stereocilia ونمط يشبه الحويصلة في جسم الخلية. ومن شأن المجهر التقليدي المُتَعَرّز أن يسمح بتصور والقياس الكمي لتراكم السُكُرَة الفلورية في جسم الخلية، ولكن من الصعب التمييز بين الصفوف الثلاثة من المجسّة والتعريب الدقيق للدإكستران عند أطراف الصفوف المجسمة الأقصر. ويمكن الوصول إلى قرار مماثل لتلك التي تحققت مع الملتحمة AIRYscan 880 LSM باستخدام المجهر البؤري التقليدي مع الإفراط في أخذ العينات وdeconvolution ، على الرغم من أن SNR سيكون أقل من تلك التي تم التوصل إليها مع كاشف Airyscan.

بالإضافة إلى استخدام 3 كدا dextran-TR إلى فحص لقنوات MET وظيفية، يمكن استخدام هذا البروتوكول كذلك لدراسة العمليات الانبسيفية في خلايا الشعر منذ جميع dextrans اختبار تكشف عن نمط داخل الخلية مثل الحويصلات تشبه الانجيوتس. ولم تكن هذه العملية محور عملنا، وسيلزم إجراء دراسات إضافية لتوصيف هذه الظاهرة بشكل كامل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

نشكر فنسنت شرام من المجهر NICHD والتصوير الأساسية للمساعدة في الحصول على صورة confocal، وTsg-Hui تشانغ للحصول على مساعدة لا تقدر بثمن مع إدارة المستعمرة ورعاية الفئران. تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث داخل الجدران من NINDS، المعاهد القومية للصحة، Bethesda، MD، إلى K.J.S. A.B. بدعم من برنامج البحوث داخل الجدران من NINDS، المعاهد القومية للصحة، وزمالة روبرت وينتهولد ما بعد الدكتوراه من برنامج البحوث داخل المدرسة من NIDCD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 glass coverslips 18mm Warner Instruments 64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin ThermoFisher A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective Carl Zeiss 420780-9970-000
Amiloride hydrochloride EMD MILLIPORE 129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker Benchmarks scientific B3D5000
C57BL/6J wild-type mice strain 000664 The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt ThermoFisher B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade Electron microscopy science 15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red ThermoFisher 14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher 14170
Image J or FIJI NIH http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media Carl Zeiss 444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 31415029
neomycin trisulfate salt hydrate Sigma N6386
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011069
Phalloidin-CF405M Biotium 00034
ProLong Diamond antifade mounting media ThermoFisher P36970
superfrost plus microscope slide Fisherbrand 22-037-246
Triton X-100 Sigma T8787
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 156، Dextran، خلايا شعر الأذن الداخلية، قناة mechanotransduction، تناول صبغ، بطانة الرحم، الحويصلات داخل الخلايا، المجهر المكورس
Dextran وضع العلامات والشراء في خلايا الشعر الحية والوظيفية Murine Cochlear
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ballesteros, A., Swartz, K. J.… More

Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells. J. Vis. Exp. (156), e60769, doi:10.3791/60769 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter