Summary
Aqui, apresentamos um método para visualizar a captação de 3 kDa Texas Red-labeled dextran em células ciliadas auditivas com canais funcionais de mecanotransdução. Além disso, a dextrans de 3 a 10 kDa pode ser usada para estudar endocitose em cabelos e células de apoio do órgão de Corti.
Abstract
O canal de mecanotransção de células para cabelo (MET) desempenha um papel importante na audição. No entanto, a identidade molecular e as informações estruturais do MET permanecem desconhecidas. Estudos eletrofisiológicos de células ciliadas revelaram que o canal MET tem uma grande condução e é permeável a moléculas cationic fluorescentes relativamente grandes, incluindo alguns corantes isofiis e antibióticos de aminoglicolado com rótulo vermelho do Texas. Neste protocolo, descrevemos um método para visualizar e avaliar a captação de dextrans fluorescente em células ciliadas do órgão de corti explantas que podem ser usadas para ensaio para canais MET funcionais. Descobrimos que 3 kDa Texas Red-labeled dextran especificamente rotula células ciliadas auditivas funcionais após 1-2 h de incubação. Em particular, 3 kDa dextran rotula as duas linhas de estereoilia mais curtas e se acumula no corpo celular em um padrão difuso quando os canais MET funcionais estão presentes. Um padrão adicional de rotulagem semelhante a vesícula foi observado no corpo celular das células ciliadas e nas células de suporte circundantes. Nossos dados sugerem que 3 kDa Texas-Red dextran pode ser usado para visualizar e estudar duas vias para a captação de tinta celular; uma rota de entrada específica para células para celular através de canais MET funcionais e endocitose, um padrão também disponível para dextran maior.
Introduction
As células ciliadas do ouvido interno são as células sensoriais que detectam som e encobrem os estímulos mecanicamente em sinais elétricos, que são finalmente interpretados pelo nosso cérebro. Essas células têm um feixe em forma de escadaria de três fileiras de filamentos à base de actin, conhecidos como estereoilia, que se projetam de sua região apical1,2. Os estímulos mecânicos desviam os filamentos estereoilia em direção à linha mais longa e desencadeiam a abertura dos canais de mecanotransdução (MET)3. A abertura dos canais MET leva a um fluxo de cárinos que despolariza a célula e, consequentemente, sinaliza a liberação de vesículas de sinapse na região basal da célula cilia.
As propriedades biofísicas do canal MET essenciais para a audição foram extensivamente caracterizadas. Entre outras propriedades, esses canais são seletivos cationic e possuem uma realização relativamente grande (150-300 pS em baixa Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Notavelmente, grandes moléculas fluorescentes como aminoglicoglicolados de marca vermelha do Texas são bloqueadores perversos do canal MET, resultando em seu acúmulo no corpo de células ciliadas que podem ser visualizados usando microscopia de fluorescência11,12,13,14. Por outro lado, a identidade molecular e a estrutura do canal MET e seu caminho de permeação permaneceram evasivos. Evidências experimentais crescentes indicam que a proteína do canal transmembrana 1 (TMC1) é um componente do canal MET em células ciliadas maduras15,16,17,18,19. Mutações no canal 1 (TMC1) alteram as propriedades do canal MET19,20,21,22 e causam surdez. Além disso, o TMC1 localiza o site do canal MET18,23 e interage com o tip-link responsável por transmitir a força mecânica para o canal MET24,25. Além disso, a recente análise bioinformática identificou as proteínas TMC como evolutivas relacionadas aos canais mecanosensíveis TMEM63/OSCA e as proteínas TMEM16, uma família de canais de cloreto ativados com cálcio e mexidas lipídicas26,27,28. Um modelo estrutural do TMC1 baseado na relação entre essas proteínas revelou a presença de uma grande cavidade na interface protein-lipídica27. Esta cavidade abriga as duas mutações TMC1 que causam perda auditiva autossômica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, e modificação seletiva de mutantes de cisteína para resíduos nas propriedades do canal met da cavidade alter28,indicando que poderia funcionar como o caminho de permeação do canal MET. O grande tamanho dessa cavidade prevista em proteínas TMC poderia explicar a capacidade de grandes moléculas de permear o canal MET. Para testar a previsão de que o canal MET contém um caminho de permeação extraordinariamente grande e para empurrar os limites do tamanho da cavidade observada no TMC1, desenvolvemos um protocolo para realizar experimentos de captação no órgão de explantas corti com uma molécula maior, 3 kDa dextran fluorescente rotulado com Texas Red.
Dextran é um complexo polissacarídeo ramificado composto por muitas moléculas de glicose D amarradas por ligações glicosídicas alfa-1,6. Sua alta solubilidade em água, baixa toxicidade celular e bioinertidade fazem dela uma ferramenta versátil para estudar vários processos celulares. Além disso, o dextran está disponível em uma ampla gama de tamanhos e fluorescentemente rotulado com fluoroforres de várias cores. Dextrans rotulado fluorescente são comumente utilizados na pesquisa de permeabilidade celular e tecidual33,34, para estudar endocitose em múltiplos sistemas celulares35,36, e para rastreamento neural37,38. No campo auditivo, moléculas dextran também têm sido usadas para avaliar a interrupção da junção celular-célula e perda da integridade auditiva sensorial de epitélio após exposição ao ruído intenso no órgão chinchilla de Corti39,40.
Neste trabalho, exploramos as propriedades de algumas das menores (3 e 10 kDa) fluorescentes dextrans para realizar experimentos de captação em células de ouvido internos de murina e explorar o tamanho da via de permeação do canal MET da célula capilar interna do ouvido. Além disso, usamos um microscópio confocal de varredura a laser (LSM) 880 equipado com um detector de airyscan para visualizar e localizar dextran fluorescente na estereoilia e no corpo celular de células cilias auditivas.
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Protocol
Os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram realizados seguindo as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais, que foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (Protocolo Animal #1336 ao KJS).
1. Ratos
- Coloque um par de pares de c57BL/6J do tipo selvagem para procriar na instalação animal para controlar a data de nascimento das ninhadas e acompanhar a idade dos filhotes.
2. Dissecção de Cochleae
- Coloque um espaço limpo perto de um estereótipo para realizar as dissecções (Figura 1A). Use 70% de etanol para limpar o espaço e o ambiente e coloque uma almofada de banco limpa. Um saco plástico de Resíduos Patológicos Médicos (MPW) seria necessário para descartar as carcaças dos animais.
- Prepare vários pratos de 35 mm com alguns meios de Leibovitz L15.
NOTA: A mídia celular L-15 de Leibovitz contém 1-2 mM Ca2+, que é necessário para manter a integridade dos links de ponta, e contém aminoácidos essenciais, vitaminas e piruvate de sódio para melhorar a saúde e a sobrevivência das células. O soro foi excluído para evitar a variabilidade experimental devido à sua composição mal definida e potencial interferência com o dextran. - Eutanize ratos pós-natal-6 (P6) por decapitação.
NOTA: Ratos velhos de 6 dias são um pouco resistentes a anestésicos inaladores. Embora exposições de ISoflurane ou CO2 prolongadas (até 50 min) possam ser usadas para eutanásia, recomenda-se um método físico secundário para garantir a morte. - Use tesouras cirúrgicas para remover a pele do crânio fazendo um corte superficial do anterior para a extremidade posterior e através dos canais auditivos externos.
- Dobre a pele em direção ao nariz para expor o crânio (Figura 2B).
- Faça uma incisão da parte de trás para a frente do crânio e através da linha dos olhos(Figura 2B-C).
- Separe o crânio em duas metades e remova o cérebro com o uso de uma pequena espátula para expor os ossos temporais (Figura 2C-D).
- Com uma tesoura pequena, corte em torno dos ossos temporais, e excisse o tecido.
- Coloque ambos os ossos temporais em um prato de 35 mm e certifique-se de que eles estão cobertos com mídia L15(Figura 2E).
NOTA: As seguintes etapas são realizadas o estereótipo. Um fundo preto geralmente ajuda a visualizar o tecido durante as finas etapas de dissecção. - um estereomicroscópio equipado com um ocular de campo largo (um poder de ampliação de 10X (WF10X) e uma fonte de luz halógena de corrente alternada externa (AC), remova o tecido cochleae circundante, canais semicirculares e órgãos vestibulares com fórceps cirúrgicos(Figura 2F).
- Para permitir que a mídia dextran e L15 entre no duto coclear, realize dois limites de punção na cócleae dissecada, uma na janela redonda e outra na região de coclearapical.
- Adicione 300 mL da mídia L15 de Leibovitz em cada poço de uma placa de depressão de vidro de 9 poços.
- Coloque pelo menos três cochleae dissecado em cada poço.
3. Rotulagem Dextran
- Reconstituir o dextran na solução de sal equilibrado de Hanks sem Ca2+ e Mg2+ (HBSS-CFM) em uma concentração final de 10 mg/mL. Esta solução de estoque deve ser citada em tubos pretos opacos (protegidos contra a luz) e armazenadas a -30 °C até o uso.
NOTA: O uso de dextran fixável de lysine é fundamental para um resultado bem-sucedido deste protocolo. - Prepare cada dextran a uma concentração final de 2 mg/mL em 500 mL da mídia L15 de Leibovitz.
- Remova a mídia da cóchlê e adicione a mídia L15 de Leibovitz contendo o dextran de interesse em uma concentração final de 2 mg/mL.
NOTA: Embora uma proporção dos canais MET estejam abertas em repouso41,42, a incubação dextran foi realizada com um suave tremor das explants para aumentar a probabilidade aberta do canal MET. - Incubar à temperatura ambiente por 2 h com agitação suave (25 rpm) usando um agitador tridimensional com um ângulo inclinado de 25°.
NOTA: Dextran rotulado fluorescentemente deve ser protegido da luz quando possível. Para proteger o dextran durante a incubação de 2 h, coloque a placa de vidro de 9 poços dentro de um prato P150 de cultura celular envolto em papel alumínio.
4. Preparação de amostras para imagem
- Após a incubação com o dextran, lave o tecido por 2 minutos duas vezes com mídia e uma vez com HBSS.
- Incubar o tecido em temperatura ambiente por 30 min com 4% de paraformaldeído na solução de sal balanceada de Hanks (HBSS).
ATENÇÃO: A exposição ao formaldeído pode ser irritante para os olhos, nariz e trato respiratório superior. Em certos indivíduos, a exposição repetida da pele ao formaldeído pode causar sensibilização que pode resultar em dermatite alérgica. Formaldeído é um conhecido cancerígeno humano e um suposto risco reprodutivo. - Lave o tecido fixo duas vezes com HBSS para remover o paraformaldeído.
NOTA: A decalcificação dos ossos temporais não é necessária nesta fase de desenvolvimento da cócla. - Retire o ligamento espiral e a membrana tectorial com fórceps de ponta fina para dissecar o órgão de Corti (Figura 2G).
- Remova todos os pequenos pedaços de tecido e lave o tecido com HBSS.
- Permeabilizar o tecido em 0,5% Triton X-100 em PBS contendo phalloidin fluorescente (conjugado para verde ou vermelho ao testar a absorção de dextran rotulado por TR ou FITC, respectivamente) em uma diluição de 1:200 por 30 min para rotular F-actin e visualizar o estereocilia baseada em actin.
- Lave o tecido 2-3 vezes por 2 min cada vez com tampão HBSS para remover o excesso de tritão e faloide, e uma vez com PBS para remover os sais.
- Monte o órgão de tecidos Corti em um slide de microscópio e cubra-o com mídia de montagem.
NOTA: Ao montar o tecido, certifique-se de que o lado do tecido contendo a estereoilia da célula do cabelo está voltado para o deslizamento de cobertura. - Remova quaisquer bolhas potenciais geradas durante a adição da mídia de montagem e evite a geração de novas bolhas durante a colocação do deslizamento de cobertura.
NOTA: Aspirar com uma pipeta qualquer bolha gerada durante a adição da mídia de montagem. Para evitar que bolhas de ar sejam presas o deslizamento de cobertura, coloque uma borda do deslizamento de cobertura perto da amostra e abaixe cuidadosamente e lentamente o deslizamento de cobertura sobre o tecido usando fórceps ou uma ponta de pipeta. - Cubra o tecido na mídia de montagem com um deslizamento de cobertura de vidro (Figura 2H).
NOTA: Os objetivos com abertura numérica acima de 0,4 são projetados para usar #1,5 deslizamentos de cobertura (espessura de 0,17 mm). O uso do contracheque errado pode ter sérias implicações para a intensidade e qualidade das imagens. - Incubar o tecido montado durante a noite à temperatura ambiente para deixar a mídia de montagem secar e armazenar os slides a 4 °C até a imagem.
5. Aquisição de imagem e processamento de imagens
NOTA: As imagens confocais foram tiradas com um microscópio confocal LSM 880 equipado com um detector de 32 canais airyscan no modo super resolução (SR)43 e um objetivo de 63x.
- Adicione uma pequena gota de óleo de imersão no objetivo.
- Coloque o slide do microscópio contendo a amostra de tecido montada no estágio do microscópio com o deslizamento de vidro voltado para o óleo de imersão.
- Concentre-se na amostra e defina os parâmetros de imagem usando o software de aquisição de imagens.
- Use configurações idênticas de aquisição de imagem e parâmetros ideais para resolução x, y e z para cada experimento independente. Um sistema de foco orientado por piezo é necessário para mover o objetivo de forma rápida e precisa ao adquirir a pilha z de imagens.
NOTA: Para visualizar toda a região apical das células cilias, colete uma pilha z de imagens da estereocilia até a metade apical do corpo da célula capilar usando as configurações ideais. É crucial coletar uma grande pilha z ao longo da célula ciliapara garantir a imagem das partículas semelhantes ao vesículo. - Use o software de aquisição de imagens para processar as imagens cruas confocais usando o algoritmo de reconstrução 3D airyscan com as configurações automáticas do filtro de deconvolução padrão.
- Abra as imagens confocais em um software de processamento de imagens para ajustar o brilho e o contraste, adicionar a barra de escala e exportar as imagens para os números finais.
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Representative Results
Observamos rotulagem robusta e específica de células ciliadas após 2h de incubação de órgão séti de camundongos pós-parto-6 (P6) do tipo selvagem com 3 kDa dextran fluorescente rotulados com Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). A rotulagem Dextran foi observada em células capilares internas e externas (IHC e OHC) nas regiões basal, média e apical do órgão de Corti (Figura 2B).
A phalloidina rotulada fluorescente foi usada para combater a filamentous actin (F-actin) e visualizar a estereocilia de célula seletilia baseada em actin. Também realizamos experimentos semelhantes em tempos de incubação mais curtos, e embora tenhamos observado o acúmulo de dextran-TR no corpo da célula capilar, os sinais eram mais fracos e variáveis do que aqueles com 2h de incubação (Figura 2C).
Em seguida, imaginamos tanto estereocilia sofrilia sofrilia e células das células cilias e observamos que apenas as células que incorporaram 3 kDa dextran-TR em seu corpo celular mostraram rotulagem fluorescente de suas estereoilia(Figura 3A). Essa relação entre estereocilia e rotulagem corporal celular estava ausente em células cilias de tecido danificado, que também apresentava rotulagem inespecífica de dextran em vários tipos de células do epitélio sensorial (quadrados amarelos na Figura 2Be Figura 3B). É importante ressaltar que observamos um sinal uniforme de fluorescência ao longo da estereocilia com enriquecimento nas pontas das linhas estéreiliamais mais curtas onde o canal MET está localizado18,23 (Figura 3C). Além disso, notamos estruturas semelhantes a vesículas no corpo celular das células ciliadas e nas células de suporte vizinhas. O padrão vesículo de captação nessas células sugere que o dextran-TR também pode ser tomado pela endocitose(Figura3C).
O protocolo aqui descrito também permite o exame da captação de dextrans maior e combinações de diferentes dextrans. Maior dextran de 10 kDa rotulado com Texas Red (dextran-TR) ou fluorescein (dextran-FITC) também produziu um padrão semelhante a vesícula no corpo celular de células para os cabelos e células de suporte, além de acumular em torno da membrana celular em um padrão irregular (Figura 4A,B). Os 10 kDa dextran-TR também rotularam superficialmente as três linhas de estereoilia de todas as células cilia (Figura 4A, entrada), provavelmente devido à superfície negativamente carregada da membrana plasmática celular cilia44,45,46. Em seguida, examinamos a captação de 3 kDa dextran-TR e 10 kDa dextran-FITC simultaneamente no órgão de explantas de Corti. Para o 3 kDa dextran-TR, observamos um padrão difuso e vesículo. No entanto, o dda dextran-FITC de 10 kDa exibiu apenas um padrão semelhante a vesícula(Figura 4C). Esses dados sugerem que a captação dextran ocorre por pelo menos dois mecanismos distintos que dependem do tamanho do dextran.
Em seguida, avaliamos se os canais MET funcionais eram necessários para a captação de 3 kDa dextran-TR. Para isso, testamos incorporação dextran em células ciliadas do órgão de Corti explants na presença de bloqueadores de canais MET (neomicina e amiloto)13,14,47 ou o Ca2+ chelator BAPTA, que aboliu as correntes met quebrando os links de ponta e impedindo a gating do canal25,48,49. Nesses experimentos, as explantas teciduais foram previamente incubadas por 30 min com neomicina (500 mM), miloride (150 mM), ou com BAPTA (5mM) antes da adição de 3 kDa dextran-TR na presença do bloqueador MET correspondente. A presença de bapta ou dos bloqueadores do canal MET impediu a rotulagem de estereoilia (Figura 5A) e a captação de 3 kDa dextran-TR em células cilia(Figura 5B). No entanto, o bloqueio do canal MET preservou o padrão vesículo(Figura 5B),indicando que esse padrão de captação é independente dos canais MET funcionais. Resultados semelhantes foram observados em células ciliadas de camundongos tmc1/TMC2 duplo knock-out, que não têm MET27. Curiosamente, essas estruturas semelhantes a vesículos não eram observáveis na presença de amilotore, que é conhecido por inibir o trocador Na+-H+ e, assim, inibir a endocitose50,51. Esses resultados indicam que 3kDa dextran-TR entra nas células ciliadas através de duas vias diferentes, uma comum a dextrans maior envolvendo estruturas semelhantes a vesículos e outra que depende de canais MET funcionais.
Figura 1: Passos da dissecação de um órgão murina de Corti. (A)Área limpa e materiais necessários para a dissecação. (B)Crânio de rato exposto. Fíceps estão segurando a pele, que se dobrou em direção ao nariz. Linhas pretas indicam as duas incisões necessárias para a remoção do cérebro. (C)Insaciou e abriu crânio para permitir a remoção do cérebro com uma espátula (à direita). (D)Crânio e ossos temporais após a remoção cerebral. (E)Crânio extílado, incluindo os ossos temporais (quadrados pretos traceados) em uma placa P35 coberta com mídia. (F)Cochleae excida. (G) Dois órgãos dissecados de Corti no poço de uma placa de depressão de vidro. (H)Amostra montada em um tampamento de vidro pronto para imagem. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Células para cabelo captam 3 kDa dextran-TR. (A) Representação esquemática do Texas Red-labeled dextran (dextran-TR) contendo seis moléculas de glicose correspondentea a um peso molecular de 1,08 kDa. Uma reação de ester sucinta liga uma molécula vermelha do Texas (magenta) a um monomer de glicose. (B) Imagem confocal representativa mostrando rotulagem específica de células ciliadas sensoriais (HC) com 3 kDa dextran-TR em todo o órgão de Corti a partir de um rato de 6 dias de idade. São indicadas as regiões basal (BA), média (MD) e apical (AP) do órgão. Praças amarelas indicam regiões danificadas por tecidos. (C) 3 kDa dextran-TR fluorescência após 30, 60, 90 ou 120 min de incubação com o órgão de corti explants é mostrado em magenta fundido com F-actin em verde (imagens superiores) e independentemente em cinza (imagens inferiores). A faixa de exibição de imagem foi ajustada linearmente em cada uma das imagens cinzas independentemente para visualização da fluorescência de 3 kDa dextran-TR. Barra de escala = 20 mm. Este número foi modificado a partir de27. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Corpo de células para cabelo e rotulagem de estereoilia com 3 kDa dextran-TR. (A) Imagens confocais exibindo 3 kDa dextran-TR fluorescência (magenta) no corpo celular e estereoilia contornados com faloide para rotular F-actin (verde) para visualizar limites celulares e estereoilia. As três fileiras de células cabiliais externas (OHC) e uma fileira de células ciliadas internas (IHC) são indicadas. Barra de escala = 20 mm.(B) Imagens confocais de uma área de tecido danificado exibindo 3 kDa dextran-TR fluorescence (magenta) no corpo celular e estereoilia. As setas amarelas indicam a rotulagem de células de suporte não sensoriais. Barra de escala = 20 mm.(C) Visão mais próxima de 3 kDa dextran-TR fluorescência no corpo celular e estereoilia de células capilares externas (OHC, superior) e células capilares internas (IHC, inferior). Barra de escala = 5 mm. Este número foi modificado a partir de27. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Rotulagem de 10 kDa dextran maior e uma combinação de 3 e 10 kDa dextran. (A) Imagem confocal das células cilias nos níveis do corpo da célula capilar (superior) e estereoilia (inferior) incubada com 10 kDa dextran-TR. O sinal de fluorescência dextran é mostrado em magenta mesclado com F-actin em verde e independentemente em escala cinza. Um par de IHC são mostrados em maior ampliação no início para apreciar a rotulagem superficial de estereocilia observada com os 10 kDa dextran-TR. Barra de escala = 5 mm.(B) Imagem confocal de células cilias incubadas com 10 kDa dextran-FITC representado como em A.(C) Imagem confocal de células cilias nos níveis de corpo de células para cabelo (superior) e estereocilia (inferior) incubadas simultaneamente com 3 kDa dextran-TR e 10 kDa dextran-FITC e imagens usando canais independentes e retratadas separadamente em cinza. No painel direito, F-actin (azul), 10 kDa dextran-FITC (verde) e 3 kDa dextran-TR (magenta) são mostrados junto com phalloidin (azul). Barra de escala = 20 mm, e o padrão de captação semelhante ao vesículo é indicado com setas amarelas. Este número foi modificado a partir de27. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Os canais MET funcionais são necessários para a captação de 3 kDa dextran-TR. Imagens confocais representativas de células cilias na estereocilia (A) ou corpo celular(B)nível após a incubação com 3 kDa dextran-TR na ausência (controle) ou presença de BATPTA ou bloqueadores do canal MET amiloride e neomicina. 3 kDa dextran-TR fluorescência é mostrado em magenta. O tecido foi neutralizado com faloide para rotular F-actin para visualização da célula céreilia e limites (verde). Flechas brancas apontam para estruturas semelhantes a vesículos. As três fileiras de células capilares externas (OHC) e uma fileira de células ciliadas internas (IHC) são indicadas, barra de escala = 20 mm. Este número foi modificado a partir de27. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Este protocolo descreve como realizar experimentos de captação em órgão surina de explants corti com 3 kDa dextran Texas Red. O objetivo deste método é testar se moléculas maiores do que outras testadas anteriormente também foram capazes de rotular especificamente células ciliadas auditivas e permear através do canal MET. Protocolos experimentais semelhantes foram usados anteriormente para avaliar a permeabilidade das células ciliadas para outros corantes fluorescentes, como FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 e aminoglicolados com rótulo vermelho do Texas (1,29-1,43 kDa)13,52. O tempo necessário para rotular células ciliadas usando essas moléculas fluorescentes varia de acordo com seu tamanho. A rotulagem máxima requer alguns minutos para FM1-4313,53, 30-60 min para aminoglicosides com rótulo vermelho do Texas13, e 1,5 h para Texas Red-labeled 3 kDa dextran. Assim, longos tempos de incubação são cruciais para este experimento, pois vimos apenas rotulagem mínima do corpo da célula capilar em tempos curtos de incubação(Figura 2C). Optamos por estudar camundongos P6 para esses experimentos porque, nessa idade, as células ciliadas ebasaismais apical e basal carregam correntes de transdução e expressam as proteínas TMC1 e TMC212,18,54,55 . Deve ser possível estudar animais mais jovens, pois as correntes met estão presentes antes do P6, em particular perto da base da cóchlêa12. Estudar animais mais velhos pode ser mais desafiador porque a dissecção da cóchlê óssea torna-se mais difícil à medida que essa estrutura continua a ossificar56.
Há vários passos críticos neste protocolo. O mais crucial é a dissecação bem sucedida e a preparação do órgão do tecido Corti (Figura 1). A delicada estrutura do órgão de Corti e o enbecado na cóchlê óssea apresenta um desafio para a análise histológica e bioquímica. Vários protocolos detalhados para a dissecação bem sucedida deste tecido foram publicados anteriormente nesta revista56,57,58 e outros59. A interrupção da junção celular-célula e a perda da integridade do epitélio sensorial auditivo pode levar à captação de dextran de até 40 kDa e à rotulagem das células afetadas39,40. De acordo com isso, observamos rotulagem inespecífica de células ciliadas e células de sustentação circundantes quando o tecido foi danificado involuntariamente com os fórceps durante a dissecção antes da incubação dextran(Figura 2B e Figura 3B). Não há truques ou diretrizes para alcançar a proficiência em dissecar um órgão intacto de Corti além de prática e paciência. No entanto, a presença de 1-2 mM Ca2+ durante experimentos de dissecação e captação de tecidos é crucial para manter a integridade do link de ponta que transmite a força mecânica para o canal MET e, assim, preservar a função do canal MET. Uma vez que o tecido é fixado com 4% de PFA, a presença de cálcio no buffer ou na mídia torna-se trivial.
Uma das limitações deste estudo reside na natureza heterogênea das moléculas dextran. O dextran elaborado pela bactéria Leuconostoc é um polímero de anhidroglicose composto de aproximadamente 95% alfa-(1-6) ligações D(Figura 2A). As ligações restantes explicam a ramificação do dextran, que se correlaciona com seu comprimento, por isso dextran de menor peso molecular são mais parecidos com varas e têm uma distribuição de tamanho mais estreita, enquanto dextrans maiorsão são polidisperse60. Portanto, o peso molecular real das moléculas em cada preparação do dextran de 3 kDa varia de 1,5 a 3,0 kDa, incluindo a molécula fluorescente61. Além disso, o dextran fluorescentemente rotulado difere no número de moléculas vermelhas do Texas ligadas ao dextran (grau de rotulagem). É aconselhável usar dextran com um grau de rotulagem de pelo menos 0,4, uma vez que um menor grau de rotulagem dificultará a capacidade de detectar o dextran rotulado fluorescente pela microscopia. O corante fluorescente acoplado ao dextran e aos resíduos de lisina nas versões fixas determinará a carga geral do dextran. Esta é uma consideração importante, uma vez que a seletividade cationic do canal MET seria preferencialmente captação de cofic dextran27. Por fim, é necessário alcançar a resolução exibida nesses experimentos. Um dextran não fixável continuará a difundir-se no tecido dificultando sua localização e visualização precisas.
O microscópio confocal LSM 880 equipado com um detector de airyscan usado para visualizar o órgão de amostras de Corti nos forneceu o dobro da resolução, e melhor relação sinal-ruído (SNR) em comparação com um microscópio confocal convencional62. Portanto, este microscópio nos permitiu não apenas observar o robusto acúmulo de dextran no corpo celular, mas também identificar o acúmulo do dextran nas pontas de estereoilia e o padrão vesículo no corpo celular. Um microscópio confocal convencional permitiria a visualização e quantificação do acúmulo de dextran fluorescente no corpo celular, mas seria difícil distinguir as três fileiras de estereocilia e a localização precisa do dextran nas pontas das linhas estéreiliamais mais curtas. Uma resolução semelhante à alcançada com o confocal de Airyscan LSM 880 poderia ser alcançada usando um microscópio confocal convencional com sobreamostragem e deconvolução, embora o SNR fosse menor do que o alcançado com o detector de airyscan.
Além do uso de 3 kDa dextran-TR para ensaio para canais MET funcionais, este protocolo poderia ser usado ainda mais para estudar processos endocíticos em células ciliadas, uma vez que todos os dextrans testados revelam um padrão intracelular semelhante a vesícula semelhante à endocitose. Esse processo não era o foco do nosso trabalho, e estudos adicionais seriam necessários para caracterizar totalmente esse fenômeno.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Vincent Schram, do núcleo de microscopia e imagem nichd, por ajudar na aquisição de imagens confocais, e tsg-Hui Chang por ajuda inestimável com a gestão de colônias e cuidados com ratos. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do NINDS, NIH, Bethesda, MD, para K.J.S. A.B. foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do NINDS, NIH, e por uma Bolsa de Pós-Doutorado Robert Wenthold do programa de pesquisa intramural do NIDCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
| C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
| Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
| Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
| Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
| Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
| Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
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