Summary
פרוטוקול זה מציג דרך פשוטה וקוהרנטית לupregulate גן של עניין באמצעות modRNA לאחר אוטם שריר הלב בעכברים.
Abstract
אוטם שריר הלב (MI) הוא גורם מוביל לתחלואה ותמותה בעולם המערבי. בעשור האחרון, טיפול גנטי הפך לאפשרות טיפול מבטיח עבור מחלות לב, בשל היעילות שלה השפעות טיפוליות יוצאת דופן. במאמץ לתקן את הרקמה הפגומה post-MI, מחקרים שונים המועסקים DNA מבוססי או נגיפי טיפול גנטי אבל יש התמודד מכשולים ניכרים בשל הביטוי המסכן ובלתי מבוקרת של הגנים הנמסרים, בצקת, הפרעת קצב, והיפרפרס לב. שונה סינתטי mRNA (modRNA) מציג גישה גנטית הרומן טיפול המציעה גבוהה, ארעי, בטוח, לא חיסוני, מסירה mRNA מבוקרת לרקמת הלב ללא כל סיכון של אינטגרציה גנומית. בשל המאפיינים המדהימים הללו בשילוב עם הפרמקוקינטיקה בצורת פעמון בלב, הפכה modRNA לגישה אטרקטיבית לטיפול במחלת לב. עם זאת, כדי להגביר את יעילותו ב vivo, שיטת מסירה עקבית ואמינה צריך להיות אחריו. מכאן, כדי למקסם את יעילות מסירה modRNA ועקביות תשואה בשימוש modRNA עבור יישומים vivo, שיטה ממוטבת של הכנה ומסירה של הזרקת modRNA בתוך מודל MI העכבר מוצג. פרוטוקול זה יהפוך את מסירת modRNA לנגישה יותר עבור מחקר בסיסי וטרנסלייתי.
Introduction
טיפול גנטי הוא כלי רב עוצמה מעורבים המסירה של חומצות גרעין לטיפול, ריפוי, או מניעה של מחלות אנושיות. למרות ההתקדמות בגישות אבחון וטיפולי למחלת לב, יש הצלחה מוגבלת בהעברת גנים אוטם שריר הלב (MI) ואי ספיקת לב (HF). פשוט כמו תהליך של ריפוי גנטי נראה, היא גישה מורכבת במידה ניכרת בהתחשב גורמים רבים שצריכים להיות ממוטבים לפני שימוש ברכב משלוח מסוים. וקטור משלוח נכון צריך להיות לא חיסוני, יעיל, ויציב בתוך גוף האדם. המאמצים בתחום זה יצרו שני סוגים של מערכות משלוח: נגיפי או לא ויראלי. בשימוש נרחב מערכות ויראליות, כולל העברה גנטית על ידי אדנווירוס, רטרווירוס, הנגיף, או וירוס הקשורים adeno, הראו קיבולת התמרה יוצאת דופן. עם זאת, השימוש שלהם במרפאות מוגבל בשל התגובה החיסונית חזקה הנגרמת1, הסיכון של tumorigenesis2, או הנוכחות של נוגדנים לנטרל3, כולם נשארים מכשול גדול ליישום רחב ואפקטיבי של וקטורים ויראליות בטיפול גנטי האדם. מצד שני, למרות דפוס הביטוי המרשים שלהם, המסירה של ה-DNA העירום מציג יעילות הזיהום הנמוך, בעוד mRNA העברה מציג חיסוני גבוה ורגישות השפלה על ידי RNase4.
עם מחקר נרחב בתחום של mRNA, modRNA הפך לכלי אטרקטיבי עבור העברת גנים ללב ואיברים אחרים שונים בשל יתרונותיה הרבים על פני וקטורים מסורתיים5. החלפת השלמה של uridine עם התוצאות הטבעיות המתרחשות באופן טבעי ביטוי חלבונים חזקים יותר וארעי, עם אינדוקציה מינימלית של התגובה החיסונית מולדת הסיכון של אינטגרציה גנומית6. פרוטוקולים שהוקמו לאחרונה להשתמש כמות ממוטבת של אנטי הפוכה כובע אנלוגי (מארקה) כי עוד מגביר את תרגום החלבון על ידי הגברת היציבות והיכולת הטרנססינתטית של mRNA הסינתטי7.
דיווחים קודמים הראו את הביטוי של כתבת שונים או גנים פונקציונליים שנמסרו על ידי modRNA ב שריר הלב מכרסם לאחר MI. עם יישומים modrna, אזורים משמעותיים של שריר הלב, כולל הקרדיוציטים וללא קרדיוציטים, היתה בהצלחה לאחר הפגיעה הפוסט-קרדיולוגית8 כדי לגרום לאנגיוגנזה9,10, הישרדות תא הלב11, ו התפשטות קרדיומוציט12. מנהל יחיד של modRNA מקודד עבור האדם מוטציה follistatin כמו 1 גורם התפשטות של העכבר CMs למבוגרים ומגדילה באופן משמעותי את תפקוד הלב, מקטין את גודל הצלקת, ומגביר את צפיפות נימי 4 שבועות post-MI12. מחקר שנערך לאחרונה דיווח על תפקוד לב משופר לאחר MI עם יישום של וודרנה modRNA במודל חזיר10.
כך, עם הפופולריות הגוברת של modRNA בשדה הלב, זה חיוני לפתח ולייעל פרוטוקול למשלוח של modRNA ללב post-MI. בזאת הוא פרוטוקול המתאר את ההכנה והמסירה של מודנה מטוהרים ואופטימיזציה בניסוח ביולוגי מלוחים ציטראט המספק חזק, ביטוי חלבון יציב מבלי לעורר תגובה חיסונית. השיטה המוצגת בפרוטוקול זה וידאו מדגים את ההליך הכירורגי הרגיל של העכבר MI על ידי הארכה לצמיתות של העורק הקדמי שמאל בירידה (LAD), ואחריו שלושה זריקות האתר תאיים של modRNA. המטרה של הנייר הזה היא להגדיר בבירור שיטה מדויקת מאוד מדויק של משלוח modRNA כדי שריר הלב murine כדי להפוך יישום modRNA נגיש באופן נרחב לטיפול גנטי לב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי החיות המתוארים כאן אושרו על ידי בית הספר לרפואה ע י Icahn בראש הועדה המוסדית של הר סיני.
1. סינתזה של modRNA
הערה: הפרטים של סינתזה של modRNA ניתן למצוא ב-Kondrat ואח '13.
- הזמן את תבניות הפלביניים (טבלת חומרים) וצור מוצר PCR נקי שישמש כתבנית mrna.
- להכין את modRNAs על ידי שעתוק בתוך מבחנה עם תערובת ribonucleoside מותאם אישית של הבאים (טבלת חומרים): T7 kit, 6 מ"מ אנטי הפוכה כובע אנלוגי (מארקה) 30-O-Me-m7G (50) ppp (50) G, 75 mm guanosine triphosphate, 75 mm אדנוזין triphosphate, 75 mm cytidine triphosphate, 100 הפסבדו מ"מ-5-triphosphate, ו האנזים T7 DNase.
- לטהר את modRNA עשה בשלב 1.2 עם ערכת ניקוי שעתוק (לוח חומרים) ולטפל עם פוספספטאז האנטארקטי. בשלב הבא, הסלידה מmodrna עם ערכת ניקוי התעתיק ומכמת אותו באמצעות ספקטרוסקופיה.
- מזרז את modRNA עם אתנול ו אמוניום אצטט ו להשעות מחדש ב-10 mM טריס-HCl ו 1 מ"מ EDTA.
- לרכז את modRNA עבור במסירה vivo ידי מסננים צנטריפוגליים ולמדוד את האיכות באמצעות פלטפורמת אלקטרופורזה אוטומטית (טבלת חומרים).
2. הכנת הזרקת modRNA למסירה vivo
- לחשב את הנפח הדרוש עבור 100 μg של לוציפראז (לוק)/הזרקה modRNA הזרקת מבוסס על הריכוז modRNA.
- מערבבים את הנפח המחושב של modrna עם חלקים שווים של הפתרון סוכרוז הכין ב נוקלאז מים ללא תשלום (0.3 g/mL) ו 0.1 הפתרון של ציטראט (pH = 7) (20 μl כל מומלץ).
- הביאו את הכרך הסופי של הזריקה ל-60 μL על-ידי הוספת תמיסת מלח.
3. ניתוח אוטם שריר הלב
- הרדמה והכנת החיה
הערה: מחקר זה משתמש בעכבר CFW זכר ונקבה 8 עד 12 שבועות.- שבור את העכבר עם 2% isofלוריאן באמצעות חדר אינדוקציה ומניחים את החיה על גבו בתנוחה גב עם מסכה על האף והפה כדי לשמור על ההרדמה. שמרו על ההרדמה באמצעות אוורור מכני תוך שימוש במכונת ההנשמה המצוידת בצינור אווירי 7-8 מ"מ ומסנן.
- , לשתק את העכבר בפלטפורמת הניתוח. לאבטח את איבריו בנייר כירורגי גלח את אזור הצוואר ואת הצד השמאלי של הצלעות ולחטא באמצעות 70% אתנול ו povidone יוד. חזור על שלב החיטוי פעמיים. בדוק את הרפלקסים שלה, צובט את הזנב ואת הרגליים האחוריות כדי להעריך את עומק ההרדמה.
- ברציפות לפקח ולתחזק את טמפרטורת הגוף הליבה בנוראממיה (37.5-38 ° c).
- לשמור על דרכי הנשימה פתוח על ידי ביצוע צנרור intratracheal. כדי לעשות זאת, מניחים את העכבר בתנוחה מגיית עם הפה מול הניסויים ומושכים את הלשון בעדינות. התאימו את זווית הצוואר וישרו את נתיב הצנרור ודחפו את צינורית הצנרור.
- במידה והחיה אינה מסוגלת לנשום דרכו, ניתן לבצע שעומת קנה. בצע חתך צוואר הרחם לאורך קו האמצע בידוד העור, שריר, רקמה לחלוקה לרמות את קנה הנשימה באמצעות מיקרוסקופ. כאשר קנה הנשימה נראה בבירור, להכניס את צינור האנדוקנה לתוך הרקמה בין שתי טבעות מחסנית מתחת glottis על ידי עשיית חור קטן מחזיק את החלק הגולגולתית של קנה הנשימה באמצעות מלקחיים יקרוכירורגית.
- שימו לב לתנועת החזה של העכבר כדי לוודא ששתי הריאות מקבלות חמצן. שיעור הנשימה (RR) צריך להיות כ-120 נשימות לדקה, עם לחץ inspiratory של 17 עד 18 ס"מ H2O.
- הארכה שמאלית קדמית (LAD)
- כדי לבצע את הפנייה לחור, סובב את העכבר בזהירות, כך שהוא שוכב על צידו הימני. הרם את העור ובצע את הניקור השמאלי בין הצלע השלישית לצלעות הארבע ונתח את הרקמה ואת השריר בזהירות. . השתמש בבית-גידול כדי למנוע דימום
- פתח את החזה בזהירות וברגע שהוא פתוח, מצא את הלב, בלי לגעת בריאה עם כל חפץ חד. מניחים את הטרקטורים לתוך החתך כדי לשמור על חלל החזה פתוח יש לראות ברור של הלב. עכשיו להעביר את הריאות לקצה החתך ולהסיר את החלק של שק קרום הלב המכסה את הלב כדי לגשת אל פני השטח הקדמי של הלב.
- בזהירות לזהות את LAD, אשר ניתן לראות ככלי אדום אור עמוק הממוקם בין עורק הריאות לבין האוריקל השמאלי. ליגייט הצעיר עם תפר אחד של תפר משי 7-0 מניחים צינורית חזה (28 גרם, קטטר וונאל), בין הצלע הרביעית לבין ה-5.
- לסגור את החתך בחזה בשכבות. השתמש משי 6-0 פועל תפרים להתאים את הצלעות ולהשתמש 5-0 משי פועל תפרים לסגור את העור. הקפידו להשאיר חלון מתאים למדידת מדידת האקו-קרדיוגרפית העתידית.
- בזהירות לנקז את בית החזה עם פתרון איזוטוניק חם (9 גרם של נתרן כלוריד 1 L של מים) באמצעות מזרק 2 mL. הניחו את העכבר על גבו. אם ביצוע מימוש בקנה הנשימה, השתמש בצינור האנדוקנה ובעזרת הכלי להתאמת מחסנית הקנה עם תפר של 7-0 באחת. מניחים את מסיכת הפנים על העכבר ולסגור את העור באמצעות 5-0 משי פועל תפרים.
- לשלב ההתאוששות, לנתק את צינורית הצנרור ממכונת ההנשמה ולאפשר נשימה ספונטנית. מניחים את החיה תחת מנורת חום עד שהיא משיגה את התודעה. אל תשאירו את בעל החיים ללא השגחה לאחר הניתוח עד שהוא ער לחלוטין.
- ניהול טיפול בכאב עם buprenophine ב 0.1 מ"ג/ק"ג משקל הגוף, מוזרק תת-עורי עבור 3 הימים הבאים במרווחי זמן של 12 h.
4. משלוח לב של modRNA
- לספק סכום כולל של 60 μL של modRNA מוכן בשלב 2.3 הפנימי (IM) באמצעות מזרק אינסולין (31 G) בעקבות MI.
- הכנס 20 μL של modRNA בשלושה אתרים שונים של שריר הלב המקיפים את אזור סיכונים (שניים בכל צד של הארכה ואחד בקודקוד). בצע את הזריקות מיד לאחר LAD, לפני סגירת החזה.
הערה: תמונות מייצגות של אתרי הזרקת modRNA ניתן לראות באיור 1.
- הכנס 20 μL של modRNA בשלושה אתרים שונים של שריר הלב המקיפים את אזור סיכונים (שניים בכל צד של הארכה ואחד בקודקוד). בצע את הזריקות מיד לאחר LAD, לפני סגירת החזה.
5. אימות ביטוי החלבון בתוך הלב לכתוב MI
- ביטוי לוציפראאז מודרנה באמצעות מערכת דימות ביולומינסנציה
הערה: סך של 100 μg של לוק mRNA הכין ב 60 μL של המאגר הציטראט של סוכות מוזרק ישירות ללב של עכברים CFW לאחר MI.- ב 24 h לאחר הזרקת MI ו modrna, מורדם העכברים עם 2% isofלוריאן באמצעות חדר אינדוקציה ו intraperitoneally הזריק לוספרין (150 מ"ג/g משקל גוף) כדי לאמת את האות לוק ב vivo.
- התמונה עכברים באמצעות מערכת הדמיה biלומינסנציה כל 2 דקות עד האות לוק מגיע לרוויה.
- לכמת את נתוני ההדמיה שנאספו עם תוכנת ניתוח הדמיה. השתמש עכברים מוזרק עם מלוחים רק כקריאה בסיסית עבור לוק ביטוי להפחית את אות הרקע שנאסף מתוך עכברים מוזרק מלוחים.
הערה: האות לוק מתבטא ב-p/s/cm2/sr x 106.
- כתמים לאימות מעגל היצור
- כדי לאמת את הקשר עם היצור, להקריב את החיות 24 שלאחר ההזרקה באמצעות הזרקת הצפק של 100 mg/ק"ג ו 10 מ"ג/ק"ג xylazine ואחריו פריקה צוואר הרחם. לפני ביצוע חתך, לחטא את החזה ואת הבטן באמצעות 70% מספוגית אלכוהול.
- פתח את חלל בית החזה על ידי ביצוע חתך רוחבי ~ 1 ס מ נמוך יותר עצם החזה ולהעביר את המספריים לכיוון הראש, חיתוך דרך כלוב הצלעות.
- פתח את החזה ולהזריק 1 מ ל של ה-PBS סטרילי בחדר הימני הנכון כדי להסיר דם עודף. בלו את הלב מיד והניחו אותו בערוץ ה-PBS הסטרילי כדי לשטוף את הדם שנותר.
- לתקן את הלב ב 4% פאראפורמלדהיד (בארה ב) עבור 24 שעות, ואחריו דגירה לילה ב 30% הפתרון סוכרוז ב 4 ° c. ביום למחרת להטביע את ליבם של טמפרטורה החיתוך האופטימלי בינונית ולחלק אותם בעובי של 10 יקרומטר באמצעות קריוסטט.
- כתם את הסעיפים עם הנוגדן העיקרי נגד המוני האני (cTNI) ולתייג אותם עם נוגדן משני פלורסנט. כדי לזהות את הגרעין, כתם עם 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) עבור 5 דקות. תמונה השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט.
6. אנליזה סטטיסטית
- מתווה גרף עמודות המבוסס על הביטוי לוק בתוך מלוחים ועכברים מוזרק לוק ומדווח על הערכים כממוצע ± SEM. השוואת שתי הקבוצות באמצעות מבחן t שאינו משויך (* * * * p < 0.0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שמונה עד עשרה עכברים בני שבוע. הורדם עם איזולבנה וצינורות לאחר שהחיה הייתה תחת הרדמה, אזור החזה השמאלי היה מגולח ומעוקר באתנול, והלב נחשף לקשר בחור. עורק העורקים השמאלי הושאר בחוזקה על ידי שיסוף התפר מתחת לעורק הראשי (ייצוג התרשים באיור 1A). לאחר אוטם מוצלח (המצוין על-ידי paling של הקיר השמאלי חדרית חינם), הזרקה ישירה של 100 μg של לוק או המוני modRNA מומס סוכרוז ציטראט נמסר ישירות לתוך שריר הלב בשלושה אתרים שונים (איור 1B) המקיפים את אזור הפציעה באמצעות מזרק אינסולין. הליך MI עם זריקות modRNA נמשך 30-45 דקות לכל חיה. בעלי החיים הראו כ-90% שיעור ההישרדות פוסט. לאחר הניתוח, החזה והעור היו מסושמים בחוזקה בשכבות והחיה הוסרה מאוורור ברגע שהחלה לנשום כרגיל.
לאחר שניהל את התקשרות הנער והמסירה הבאה של הזרקת לוק modRNA, הצלחנו לבדוק את מערכת החיסון לוק modRNA על ידי בדיקה של ביטוי החלבון לוק 24 הזרקה באמצעות המערכת הדמיה biלומינסנציה (איור 2a). הקמנו בפרסומים הקודמים כי למרות הביטוי חלבון ניתן לראות עד יום 6 העברה, היעילות הגבוהה ביותר של modRNA הוא נצפתה 24 h8. באופן דומה, גילינו בהצלחה את האות לוק בלב שטופלו הזרקת לוק modRNA (1.76 x 108) לעומת העכברים שהוחדרו עם מאגר של סוכרוז ציטראט לאחר MI (3.0 x 105) (איור 2b).
עוד, אנו ביקשו לאמת את הביטוי modRNA על ידי בדיקת התרגום שלה biodistribution פצה ב-Rosa26Mtmg העכבר הטרנסגניים. מערכת זו מודל העכבר מבטא את התא מקומי קרום tdTomato (mT) ביטוי פלואורסצנטית כל הגוף/רקמות ושינויים תא קרום מקומי EGFP (mG) ביטוי הזריחה על שילוב מחדש של היצורים. כך, כדי להתבונן בביטוי של היצור modRNA, 100 μg היצורים המוזרקים ישירות לתוך שריר הלב post-MI ב Rosa26Mtmg גברים ונשים עכברים, ואת החיות הוקרב 24 שלאחר הניתוח. לבבות תוקנו ועובדו לעיבוד חיסוני עם הסמן cTNI וסמן גרעיני DAPI (איור 3A). ביטוי היצור מוצלחת היה ברור בשל הופעתו של תאים בצבע ירוק (איור 3B), אשר היו תוצאה של שילוב מחדש עם modRNA היצור מועברת לעכבר, מיוצג על ידי שינוי של צבע tdTomato כדי egfp סביב האתר הזרקת היצור (איור 3b).
איור 1: הארכה והעברת לב של modRNA. (א) תרשים סכמטי המציג את אזור התקשורת של LAD ושלושה אתרים של הזרקת modRNA. (ב) תמונות מייצגות של לכתוב לב העכבר כולו מוצלחת MI הנגרמת על ידי הארכה קבע (א) ואתרים של הזרקת modrna לאחר MI. 100 μg של modrna הומס ב 60 μl של סוכרוז ציטראט המאגר הועבר באזור אזור הגבול המקיף את אוטם, שניים משני צדי התקשורת (ב,ג) ואחד בפיסגה (ד). סרגל בקנה מידה = 1 ס מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: לוק ניתוח ביטויים לאחר הזרקת modRNA. סוכות מאגר ציטראט המכיל 100 μg של לוק modRNA הוזרק ישירות לתוך שריר הלב של עכברים CFW בניתוח פתוח בחזה. מערכת ההדמיה הביולומינסבית שימש לחישוב ביטוי החלבון של לוק ב -24 שעות לאחר ההזרקה. (א) תמונות ביולומיטיות השוואתית של עכברי בקרה (מוזרקים עם מאגר בלבד) מול עכברים שהוחדרו עם לוק modRNA. (ב) כימות של אות לוק בהשוואה לעכברי הבקרה שנמדדו לאחר 24 שעות באמצעות ביולומינסנציה. סרגל השגיאות מייצג את SEM עם p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ואלידציה של ביטוי היצור בvivo. תמונות מייצגות של מקטעים הצלב הלב החוצה (תצוגת ציר קצר) לאמת את הביטוי של היצור modRNA ב Rosa26Mtmg עכבר 24 שעות הזרקת. (א) החיסוני הקרדיותאי עם cTNI (אדום). (ב) תאים בצבע ירוק מייצגים את התאים מוכי היצורים. (ג) תמונה ממוזגת המציגה את התאים הפעילים מסביב לשתי הזריקות. כחול הוא הכתם הגרעיני DAPI. סרגל בקנה מידה = 1 ס מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טיפול גנטי הראה פוטנציאל עצום כדי לקדם באופן משמעותי את הטיפול במחלת לב. עם זאת, כלים מסורתיים המועסקים ניסויים קליניים הראשונית לטיפול ב-HF הראו הצלחה מוגבלת משויכים תופעות לוואי חמורות. RNA שונה מציג משלוח גנטי לא נגיפי כי הוא צובר פופולריות ברציפות ככלי העברת גנים בלב. ModRNA לא דורש לוקליזציה גרעינית של גנים לתרגום, ובכך מציע ביטוי יעיל ומהיר של החלבון. עוד, כמו mRNA אינו משתלב לתוך מארח הגנום, משלוח גנטי ידי modRNA מדלג על הסיכון של מוטזיס. כתוצאה מכך, בשל יתרונותיה של כלי רכב משלוח גנים קונבנציונליים, modRNA הפך לאחד הפלטפורמות האטרקטיבי ביותר עבור מסירה של גן יחיד או שילובים גנים ללב. עם זאת, עד היום אין פרוטוקול מתוקננת להכנה והעברה של modRNA לתוך הפציעה הלב. כך, המטרה כאן היתה להקים פרוטוקול רגיל וממוטב עבור משלוח תאיים של modRNA ב לב מכרסם כדי לשפר את השימוש modRNA ככלי טיפול גנטי כדי להפוך אותו מתאים למטרות טיפוליות.
בפרוטוקול זה, modRNA מוכן על ידי החלפת uridine עם פסבדו, ואחריו סגירה עם מארקה בסוף 5. שינויים אלה במבנה המשני של mRNA הוכחו להפוך את התרגום חלבון גבוה יותר לעומת נוקלאוטיד השונים שינויים8. יתר על כן, מבנה mRNA זה שונה בורח החיסוני לאחר זריקות IM בעכברים על ידי הגבלת ההכרה שלה על ידי קולטנים כמו שיחות ונוקלאוטיות6. כאן, הראנו כי משלוח mRNA עירום עם מאגר הציטראט של סוכות מייצרת תרגום חלבון חזק בלב באמצעות מודל MI של העכבר. במחקרים הקודמים שלנו, הקמנו את עליונותה של modRNA עם מאגר של סוכרוז ציטראט בלב לעומת כימוס של modRNA ב חלקיקים, כמו ב vivo fectamine או ב-vivo jetPEI, אשר עשוי לעכב את התרגום modRNA לתוך חלבון8. השימור הגבוה של ה-RNA על ידי ציטראט ואנרגיה נוספת שמספקת הסוכות לאנדוקציטוזה, בנוסף להצלת הדרך היחידה של מודרנה, יכולה להיות הסיבה לעלייה המסומנת בתרגום של modRNA במאגר של סוכרוז ציטראט.
למרות השימוש modrna החמיר במחקרים טרום קליניים וקליניים10,14 בעשור האחרון, אזורים מסוימים צריכים להיות נחקר להצלחה משופרת של modrna במרפאה. ראשית, סינתזה modRNA בכמויות הגבוהות הדרושות לחקירות טיפוליות יכול להיות מעולה. לכן, זה חיוני לפתח ברמה קלינית וחסכונית modRNA להעביר את השדה לקראת השלב הקליני טיפול RNA בבני אדם. שנית, שיטת המסירה קלינית הישימה עבור modRNA צריך להיות מזוהה. בהתחשב בנזק שנגרם על ידי זריקות IM לב, פחות פולשנית שיטות מסירה מבוסס המסירה עשוי להיות סביר יותר בהעברת כמות גדולה של modRNA הצורך transfect לבבות גדולים.
לסיכום, עבודה זו הוכיחה את המסירה מוצלחת של RNA המכיל שינויים הפסבדו בתוך הלב העכבר לכתוב MI. המשלוח של modRNA במאגר ציטראט של סוכרוז הניב ביטוי חלבון חזק 24 שעות לאחר ההזרקה. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לעקוב אחר משלוח והערכת חלבונים סטנדרטית בפגיעה לאחר שלאחר הלב ובכך לספק נגישות יותר בהכנה ובמסירה של modRNA עבור המחקר שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מכירים אן אנו קונאן על עזרתה בכתב יד זה. עבודה זו ממומנת על ידי מענק הסטארט-up קרדיולוגיה הוענק המעבדה Zangi וגם על ידי NIH מענק R01 HL142768-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
