Summary

Lieferung von Modified mRNA in einem Myokardinfarkt-Mausmodell

Published: June 11, 2020
doi:

Summary

Dieses Protokoll stellt eine einfache und kohärente Möglichkeit dar, ein Gen von Interesse mit modRNA nach Myokardinfarkt bei Mäusen vorübergehend zu regulieren.

Abstract

Myokardinfarkt (MI) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Sterblichkeit in der westlichen Welt. In den letzten zehn Jahren hat sich die Gentherapie aufgrund ihrer Effizienz und außergewöhnlichen therapeutischen Wirkung zu einer vielversprechenden Behandlungsoption für Herzerkrankungen entwickelt. Um das beschädigte Gewebe nach dem MI zu reparieren, haben verschiedene Studien DNA-basierte oder virale Gentherapie eingesetzt, standen aber aufgrund der schlechten und unkontrollierten Expression der gelieferten Gene, Ödeme, Arrhythmie und Herzhypertrophie vor erheblichen Hürden. Synthetische modifizierte mRNA (modRNA) stellt einen neuartigen Gentherapieansatz dar, der eine hohe, vorübergehende, sichere, nichtimmunogene und kontrollierte mRNA-Bereitstellung in das Herzgewebe ohne Risiko einer genomischen Integration bietet. Aufgrund dieser bemerkenswerten Eigenschaften in Kombination mit seiner glockenförmigen Pharmakokinetik im Herzen ist modRNA zu einem attraktiven Ansatz für die Behandlung von Herzerkrankungen geworden. Um jedoch die Wirksamkeit in vivo zu erhöhen, muss eine konsistente und zuverlässige Bereitstellungsmethode befolgt werden. Um die Effizienz der modRNA-Bereitstellung und die Konsistenz der modRNA-Nutzung für In-vivo-Anwendungen zu maximieren, wird daher eine optimierte Methode zur Vorbereitung und Bereitstellung der intrakardialen ModRNA-Injektion in einem Maus-MI-Modell vorgestellt. Dieses Protokoll wird die modRNA-Bereitstellung für die Grundlagen- und Translationsforschung zugänglicher machen.

Introduction

Gentherapie ist ein leistungsfähiges Werkzeug mit Lieferung von Nukleinsäuren für die Behandlung, Heilung oder Prävention von menschlichen Krankheiten. Trotz der Fortschritte bei den diagnostischen und therapeutischen Ansätzen für Herzerkrankungen, gab es begrenzte Erfolge bei der Lieferung von Genen in Myokardinfarkt (MI) und Herzinsuffizienz (HF). So einfach der Prozess der Gentherapie auch scheint, es ist ein ausgesprochen komplexer Ansatz, wenn man die vielen Faktoren berücksichtigt, die optimiert werden müssen, bevor ein bestimmtes Lieferfahrzeug eingesetzt wird. Der richtige Liefervektor sollte nicht immunogen, effizient und stabil im menschlichen Körper sein. Die Bemühungen in diesem Bereich haben zwei Arten von Zustellungssystemen hervorgebracht: virale oder nicht-virale. Die weit verbreiteten Virussysteme, einschließlich Gentransfer durch Adenovirus, Retrovirus, Lentivirus oder Adeno-assoziiertes Virus, haben eine außergewöhnliche Transduktionskapazität gezeigt. Jedoch, ihre Verwendung in Kliniken ist begrenzt aufgrund der starken Immunantwort induziert1, Risiko der Tumorgenese2, oder das Vorhandensein von neutralisierendenAntikörpern 3, die alle ein großes Hindernis für eine breite und effektive Anwendung von viralen Vektoren in der menschlichen Gentherapie bleiben. Auf der anderen Seite zeigt die Lieferung von nackter Plasmid-DNA trotz ihres beeindruckenden Expressionsmusters eine geringe Transfektionseffizienz, während der mRNA-Transfer eine hohe Immunogenität und Erniedrigungsanfälligkeit durch RNase4aufweist.

Mit der umfangreichen Forschung auf dem Gebiet der mRNA hat sich modRNA aufgrund seiner zahlreichen Vorteile gegenüber traditionellen Vektoren zu einem attraktiven Werkzeug für die Lieferung von Genen an das Herz und verschiedene andere Organe entwickelt5. Der vollständige Ersatz von Uridin durch natürlich vorkommendes Pseudouridin führt zu einer robusteren und vorübergehenderen Proteinexpression, mit minimaler Induktion der angeborenen Immunantwort und dem Risiko einer genomischen Integration6. Kürzlich etablierte Protokolle verwenden eine optimierte Menge an Anti-Reverse Cap Analog (ARCA), die die Proteintranslation weiter verbessert, indem die Stabilität und Transaktivität der synthetischen mRNA7erhöht wird.

Frühere Berichte haben die Expression verschiedener Reporter- oder Funktionsgene gezeigt, die von modRNA im Nagetier Myokard nach MI geliefert werden. Mit modRNA-Anwendungen wurden signifikante Bereiche des Myokards, einschließlich Kardiomyozyten und Nicht-Kardiomyozyten, erfolgreich nach kardialen Verletzungen transfiziert8, um Angiogenese9,10, Herzzellüberleben11und Kardiomyozytenproliferation12zu induzieren. Eine einzige Verabreichung von modRNA kodiert für mutierte menschliche Follistatin-ähnliche 1 induziert die Proliferation von Maus erwachsenen CMs und erhöht signifikant die Herzfunktion, verringert die Narbengröße, und erhöht die Kapillardichte 4 Wochen nach MI12. Eine neuere Studie berichtete verbesserte Herzfunktion nach MI mit Anwendung von VEGFA modRNA in einem Schweinemodell10.

Daher ist es angesichts der zunehmenden Popularität von modRNA im Herzbereich wichtig, ein Protokoll für die Lieferung von modRNA an das Herz post-MI zu entwickeln und zu optimieren. Hierin ist ein Protokoll, das die Vorbereitung und Abgabe von gereinigter und optimierter modRNA in einer biokompatiblen Citrat-Saline-Formulierung beschreibt, die eine robuste, stabile Proteinexpression ohne Stimulierung einer Immunantwort bietet. Die in diesem Protokoll und Video gezeigte Methode zeigt den Standard-Chirurgischen Eingriff einer Maus MI durch permanente Ligation der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD), gefolgt von drei intrakardialen Injektionen von modRNA. Das Ziel dieses Papiers ist es, eine hochgenaue und reproduzierbare Methode der ModRNA-Bereitstellung an das murine Myokard klar zu definieren, um die modRNA-Anwendung für die Herzgentherapie allgemein zugänglich zu machen.

Protocol

Alle hier beschriebenen Tierprozeduren wurden von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai Institutional Care and Use Committee genehmigt. 1. Synthese von modRNA HINWEIS: Die Details der modRNA-Synthese finden Sie in Kondrat et al.13. Bestellen Sie die Plasmidvorlagen (Materialtabelle) und generieren Sie ein sauberes PCR-Produkt, das als mRNA-Vorlage verwendet werden soll. Bereiten Sie die modRNAs durch…

Representative Results

Acht bis zehn Wochen alte Mäuse wurden mit Isofluran beanstandet und intubiert. Nachdem das Tier unter Anästhesie war, wurde die linke Brustregion rasiert und mit Ethanol sterilisiert, und das Herz wurde für LAD Ligation ausgesetzt. Die linke Koronararterie wurde durch festes Verknoten der Naht unter der Arterie verknotet (Diagrammdarstellung Abbildung 1A). Nach einem erfolgreichen Infarkt (angezeigt durch das Abschlagen der linksventrikulären freien Wand) wurde eine direkte Injektion vo…

Discussion

Die Gentherapie hat ein enormes Potenzial gezeigt, die Behandlung von Herzerkrankungen signifikant voranzutreiben. Jedoch, traditionelle Werkzeuge in den ersten klinischen Studien für die Behandlung von HF verwendet haben nur begrenzten Erfolg gezeigt und sind mit schweren Nebenwirkungen verbunden. Modified RNA präsentiert eine nichtvirale Genabgabe, die als Gentransfer-Tool im Herzen kontinuierlich an Popularität gewinnt. ModRNA benötigt keine kernnukleare Lokalisierung von Genen für die Translation und bietet somi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren würdigen Ann Anu Kurian für ihre Hilfe bei diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde durch ein kardiologisches Start-up-Stipendium des Zangi-Labors und auch durch den NIH-Zuschuss R01 HL142768-01 finanziert.

Materials

Adenosine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Antarctic Phosphatase New England Biolabs M0289L
Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G TriLink Biotechnologies N-7003
Bioluminescense imaging system Perkin Elmer 124262 IVIS100 charge-coupled device imaging system
Blunt retractors FST 18200-09
Cardiac tropnin I Abcam 47003
Cytidine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Dual Anesthesia System Harvard Apparatus 75-2001
Forceps- Adson FST 91106-12
Forceps- Dumont #7 FST 91197-00
Guanosine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
In vitro transcription kit Invitrogen AMB13345 5X MEGAscript T7 Kit
Intubation cannula Harvard Apparatus
Megaclear kit Life Technologies
Mouse ventilator Harvard Apparatus 73-4279
N1-methylpseudouridine-5-triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081
NanoDrop Spectrometer Thermo Scientific
Olsen hegar needle holder with suture scissors FST 12002-12
Plasmid templates GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Sharp-Pointed Dissecting Scissors FST 14200-12
Stereomicroscope Zeiss
Sutures Ethicon Y433H 5.00
Sutures Ethicon Y432H 6.00
Sutures Ethicon 7733G 7.00
T7 DNase enzyme Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Tape station Aligent 4200
Transcription clean up kit Invitrogen AM1908 Megaclear
Ultra-4 centrifugal filters 10k Amicon UFC801096

References

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Cite This Article
Kaur, K., Sultana, N., Hadas, Y., Magadum, A., Sharkar, M. T. K., Chepurko, E., Zangi, L. Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model. J. Vis. Exp. (160), e60832, doi:10.3791/60832 (2020).

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